אנו מכירים את התמיכה מחקר על ידי תוכנית המחקר עירונית של NIBIB, NIH.

נייד מדגם העצרת מומנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מתחילים תא בנייה מדגם ידי לשים יחד 2 אסיפות החלון. הנח אטם חלון לתוך המחזק את החלון. מקם את אניה חלון (או שזה נקרא לפעמים כרית החלון) בתוך מחזיק את החלון כך הפתיחה של אניה היא מול חור המנעול של בעל. בזווית קלה, במקום חלון בעל יישור סימן סופר על החלון עם הדרך מפתח של בעל החלון. לחץ כלפי מטה בעדינות בקצוות מאוד משני צידי החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח אטימה ראויה מומנט מדויק של התא מדגם, אנו קלות המעיל אטם הדיור ואת טבעת בורג עם סיכה Spinkote. מורחים כמות קטנה מאוד של Spinkote בין האגודל לאצבע המורה. מעיל את הטבעת הנושאים בורג עם סרט דק בלתי נראה של Spinkote. כמו כן, המעיל אטם דיור. תמחקי את כל חומר סיכה לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין תא הרכבה מדגם ידי הזזה חלון אחד של העצרת, עם חלון הפונה כלפי מעלה, אל לך, לתוך התא דיור על ידי יישור חור המנעול עם המפתח דיור. יישר את חור המנעול עם המפתח המרכזי דיור ולתת לו ליפול בעדינות על גבי הרכבה חלון בתוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש בכל סוג של כלי לדחוף את מרכזי דיור לתוך התא. הדבר עלול לגרום נזק בלתי הפיך למחסום וכתוצאה מכך דליפה במהלך הניסויים. סובבו את הרכבה החלון השני, כך החלון פונה לכיוון המרכזי, הרחק ממך, ליישר חור המנעול עם המפתח דיור והחלק אותו כלפי מטה על גבי במרכז. הנח אטם דיור על גבי, אם כן, טבעת בורג כל כך את המילה &quot;Out&quot; גלוי. בעזרת האצבעות כלי היישור, יד להדק את טבעת בורג. אם המפלגה הקומוניסטית לא להחליק בקלות לתוך החבית דיור, קודם ליישר אותה, אם כן, מקום ההרכבה החלון השני על גבי זה. על ידי הפעלת לחץ כלפי מטה בעדינות על הרכבה חלון, להחליק לתוך שתי דיור התא בעת ובעונה אחת. בדרך זו, אנו נמנעים לחיצה ישירות על המפלגה הקומוניסטית. עכשיו הוא זמן טוב להסתכל בתוך התא עבור מוך אבק, טביעות אצבעות. תוכלו גם להבחין טבעות ניוטון המעידים יש עדיין אוויר בין CP והחלונות. אלו ייעלמו לאחר החלת מומנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הטבעת לפשל והמילה &quot;החוצה&quot; גלוי, במקום תא מדגם כל הדרך למטה בתוך collet התא מומנט של דוכן מומנט. החזק תא במקום על ידי הפעלת לחץ קבוע על ידית מומנט לעמוד. בתנועה רציפה אחת, להדק את טבעת בורג אל בין 120-140 ב-ק&quot;ג. אם באמצעות מפתח ברגים מתכוונן מומנט מיקרומטר, להגדיר את זה בין 120-140 ב / ק&quot;ג ולהדק את טבעת בורג עד מפתח &quot;קליקים&quot; המציין את מומנט להגדיר הושג. שחרר את ידית מומנט לעמוד ובזהירות להסיר את תא מדגם בלי לגעת בחלונות. </li></ol> טעינה איטום תא Sample <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים מהירות שקיעה, אנו שגרתי עומס נפח 400ul לתוך סקטור אחד מרכזי 12mm בעזרת פיפטה 200ul. מקם את התא מדגם עם החורים העמסה על גבי והמילה &quot;החוצה&quot; על הטבעת בורג גלוי. החלק את חצי הדרך פיפטה קצה לתוך המגזר המרכזי שמאלה דרך החורים העמסה לאט לוותר 200ul של פתרון התייחסות. חזור פעם אחת בסך הכל 400ul. משתמש קצה פיפטה אותו באותה טכניקה, בזהירות ולאט לאט למלא את הסקטור המרכזי ימינה עם 400ul של פתרון המדגם. כרכים של ul 150-180 משמשים לניסויים שיווי משקל שקיעה אבל את הטיפול באותה טכניקה ויש אחריו. זה הכרחי כדי להתאים את כמויות של פתרונות התייחסות מדגם ככל האפשר. התאמת קצה פיפטה בחוזקה על פיפטה, לאט העמסה מחלק פתרונות, הימנעות בועות טעינה באמצעות קצה פיפטה זהה בשני פתרונות כל סיוע בשמירה על כרכים כמו שווה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם התא על ידי הנחת 2 חדש אדום תקע אטמים דיור בנוחות לתוך כל חור הטעינה לוודא שהם ממוקמים בין היצירה מרכז הדיור אלומיניום. מכסים כל אחד עם תקע דיור. יד להדק עם מברג שטוח ראש קטן. </li></ol> נייד מדגם המערך ב רוטור <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת הרוטור, ודא לאזן הוא לא יותר מ 0.5 גרם קל יותר מאשר בתא מדגם במצב ההפוך במקרה זה תא דליפות המדגם. התחל עם יתרת אפס. ראשית לשקול את התא מדגם זה יהיה בעמדה מול CB. טרה את האיזון כדי להפחית את משקל התא המדגם, אם כן, לשקול את CB. להוסיף או לגרוע משקל מהחור מצורף של משקל נגד. ודא משקולות לא לבלוט מלמעלה. Reweigh כדי להבטיח את המשקל הסופי הוא לאזן בתוך 0.5 גרם קל יותר מאשר תא המדגם השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הרוטור 4-מקום, במקום לאזן לעמדה 4, כך על החץ הלבן גלוי מצביע tהוא הכיוון של כוח צנטריפוגלי. ודא זה כל הדרך למטה בתוך הרוטור. להדק בעדינות את הבורג להגדיר, נמצא על גבי לאזן את ממש מול החץ הלבן, עד לאזן את זה במקומו, אך עדיין מסוגל להיות מתואם. מקם את התא מדגם מאוזנת עם הדיור תקעים מול מרכז הרוטור ואת המילה &quot;החוצה&quot; על הטבעת בורג גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבט מלמטה הרוטור, ליישר את סימן בתוך הסופר (סימן הקרוב במרכז הרוטור) עם סימן הסופר על לאזן באמצעות כלי היישור. הדקו את הבורג להגדיר לנעול לאזן מיושר במקום. באותו אופן, ליישר את התא מדגם סופר לסמן עם הסימן בתוך הסופר בעמדה 2 על הרוטור. </li></ol> לקבלת מידע נוסף ראה <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

הרכבה תא ראויה, הכניסה המדגם, ויישור תא הרוטור הוא קריטי עבור ניסויים באיכות גבוהה AUC. הדבר נכון במיוחד, עבור ניסויים הדורשים ניתוח מפורט מאוד של נתונים על רכש את הפרופילים שקיעה macromolecular, למשל, כאשר לומדים אינטראקציות חלבון וקביעת מצטבר בכמויות זעירות. לעתים קרובות את האיכות של ההתקנה הניסיונית היא המגביל את הדיוק ואת הדיוק של תוצאות המחקר AUC. לפרטים על תכנון וביצוע מעשי נוספת של ניסויים AUC, ראה הפניות 1-3. סדנאות המכסה את ההתקנה תיאוריה מעשית, וניתוח נתונים של ניסויים AUC מתקיימות פעמיים בשנה במעבדה שלנו במכון הלאומי לבריאות [4].

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

Ultracentrifuge אנליטית (AUC) הוא כלי biophysical עוצמה המאפשר לנו להקליט שקיעה פרופילים macromolecular במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה. כאשר מתוכנן כהלכה והוצאו להורג, מהירות שקיעה AUC או שיווי משקל הניסוי שקיעה יכולה לגלות הרבה על חלבון לגבי גודל וצורה, טוהר המדגם, מקדם שקיעה, מדינות oligomerization ו חלבונים אינטראקציות. טכניקה זו, לעומת זאת, דורש רמה של תשומת לב קפדנית טכנית. תאים לדוגמא להחזיק פיסת מרכז sectored דחוקה בין שתי אסיפות החלון. הם חתומים עם לחץ של מומנט סביב 120-140 ב / ק&quot;ג. מאגר יעץ מדגם נטענים לתוך המגזרים המרכזי ואז לאחר איטום, התאים מיושרים במדויק לתוך הרוטור טיטניום כך מערכות זיהוי אופטי לסרוק הן מדגם חיץ התייחסות לקו האמצע באותו מסלול הרדיאלי דרך כל מגזר המרכזי בעוד סיבוב במהירויות של עד 000 סל&quot;ד 60, תחת ואקום גבוה מאוד לא רק מדגם נאות תא הרכבה קריטי, התא רכיבים מדגם יקרים מאוד ויש יטופלו כהלכה כדי לוודא שהם במצב עבודה אופטימלי על מנת למנוע דליפות שבירה במהלך הניסויים. ידית חלונות בקפידה, אפילו את הסדק הקל ביותר או לגרד יכולה להוביל שבירה בצנטריפוגה. הקשר בין מרכזי וחלונות חייב להיות חזק ככל האפשר, כלומר לא טבעות ניוטון זה צריך להיות גלוי לאחר הלחץ מוחל מומנט. , מוך אבק, שריטות או שמנים על החלונות או המרכזי לכל פשרה זה קשר והוא יכול בקלות רבה לגרום דליפה של פתרונות מתחום אחד למשנהו או דולף מתוך המרכזי הכל ביחד. לא רק דגימות יקרות לאיבוד, דליפה של פתרונות במהלך ניסוי יגרום לחוסר איזון של לחץ בתא מובילה לעיתים קרובות חלונות וסידורי שבור. בנוסף, אטמים התקע המתחבר הדיור חייב להיות בבטחה במקום כדי למנוע פתרונות להיות שלף של המגזר המרכזי דרך החורים העמסה על ידי ואקום גבוה בתא צנטריפוגות. ספינות חלון אטמים חייב להיות ללא הפסקות וסדקים שעלולים לגרום לתנועה וכתוצאה מכך חלונות שבורים. סרט הווידאו הזה תדגים נהלי שלנו הרכבה תא מדגם, מומנט העמסה יישור הרוטור על מנת למזער את הנזק רכיב, פתרון דולף ושבירה במהלך הניסוי AUC מושלמת.

Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ultracentrifuge אנליטית (AUC) תא מדגם מחזיקה מדגם חיץ התייחסות במהלך ניסויים חשוף ואקום גבוה ומהירויות הרוטור עד 60,000 סל&quot;ד. וידאו זה יהיה להדגים את תשומת לב קפדנית לכל פרט הכרחי עבור טעינת הרכבה, ויישור של מרכיב זה חשוב מאוד של ניסוי AUC.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Views.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. Ultracentrifuge אנליטית (AUC) תא מדגם מחזיקה מדגם חיץ התייחסות במהלך ניסויים חשוף ואקום גבוה ומהירויות הרוטור עד 60,000 סל"ד. וידאו זה יהיה להדגים את תשומת לב קפדנית לכל פרט הכרחי עבור טעינת הרכבה, ויישור של מרכיב זה חשוב מאוד של ניסוי AUC.

Video: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo טוען מכני של גיד

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

העצרת, כוונון ושימוש מיקרוסקופ שדה Apertureless קרוב אינפרא אדום עבור הדמיה חלבון

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...