Curvas de crecimiento: Generación de curvas de crecimiento utilizando unidades formadoras de colonias y mediciones de densidad óptica

Fuente: Andrew J. Van Alst¹, Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, y Victor J. DiRita^1
1 Departamento de Microbiología y Genética Molecular, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, Michigan, Estados Unidos de América

Las curvas de crecimiento proporcionan información valiosa sobre la cinética del crecimiento bacteriano y la fisiología celular. Nos permiten determinar cómo responden las bacterias en condiciones de crecimiento variables, así como definir parámetros de crecimiento óptimos para una bacteria determinada. Una curva de crecimiento arquetípico progresa a través de cuatro etapas de crecimiento: retraso, exponencial, estacionario y muerte (1).

Figura 1: Curva de crecimiento bacteriana. Las bacterias cultivadas en el cultivo por lotes progresan a través de cuatro fases de crecimiento: retraso, exponencial, estacionario y muerte. Fase de retraso es el período de tiempo que tarda la bacteria en alcanzar un estado fisiológico capaz de crecimiento celular rápido y división. La fase exponencial es la etapa de crecimiento y división celular más rápido durante la cual la replicación del ADN, la transcripción del ARN y la producción de proteínas se producen a un ritmo constante y rápido. La fase estacionaria se caracteriza por una ralentización y meseta del crecimiento bacteriano debido a la limitación de nutrientes y/o acumulación intermedia tóxica. La fase de muerte es la etapa durante la cual la lisis celular ocurre como resultado de una limitación severa de nutrientes.

Fase de retraso es el período de tiempo que tarda la bacteria en alcanzar un estado fisiológico capaz de crecimiento celular rápido y división. Este retraso se produce porque las bacterias tardan tiempo en adaptarse a su nuevo entorno. Una vez que los componentes celulares necesarios se generan en fase de retraso, las bacterias entran en la fase exponencial del crecimiento donde se producen la replicación del ADN, la transcripción del ARN y la producción de proteínas

1. Configuración

1. Materiales de laboratorio requeridos: medios líquidos, medios de agar solidificados, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo de 15 ml, solución salina tamponada de fosfato (PBS), esparcidor celular bacteriano, 70% etanol y un espectrofotómetro. Todas las soluciones y cristalería deben esterilizarse antes de su uso.
2. Preparar la estación de trabajo esterilizando con 70% de etanol. Trabaje cerca de un quemador Bunsen para evitar la contaminación de los medios.
3. Cuando se trabaja con bacterias, se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado y la técnica aséptica. Se requiere una capa de laboratorio y guantes cuando se trabaja con cultivos bacterianos.
4. Recetas para búferes, soluciones y reactivos
   1. Solución salina tamponada de fosfato (PBS) (8).
   2. Caldo Luria-Bertani (LB) (9).

2. Protocolo

1. Preparación de medios
   1. Identificar los medios de crecimiento con los que cultivar las bacterias y preparar tanto caldo líquido como agar sólido (1,5% p/v agar) en botellas autoclavables separadas. Aquí, el caldo LB y el agar LB se prepararon para el crecimiento de Escherichia coli.
   2. Esterilice el soporte con una tapa semiapretada en un autoclave ajustado a 121 oC durante 35 min.
   3. Para los medios de agar, después de la autoclave, colóquelo en un baño de agua ajustado a 50 oC durante 30 minutos para enfriar. Una vez enfriado, vierta los medios de agar de 20-25 ml en platos circulares Petri de 100x15 mm. Deje que las placas se ajusten 24 horas a temperatura ambiente antes de su uso.
2. Preparación inicial de bacterias
   1. A partir de las existencias congeladas, las bacterias de la raya para el aislamiento en el agar de medios seleccionados para obtener aislados de una sola colonia. Incubar en condiciones de crecimiento permisibles para las bacterias elegidas. Aquí, E. coli se extiende sobre el agar LB y se incuba a 37 oC durante la noche (16-18h).
   2. Usando un bucle de inoculación estéril, seleccione una sola colonia de la placa de raya e inocular medios líquidos de 4 ml en un tubo de ensayo de 15 ml y crezca en condiciones permisibles para las bacterias elegidas. Aquí, E. coli se cultiva a 37 oC con temblores a 210 rpm durante la noche (16-18h).
3. Configuración de la curva de crecimiento
   1. Preparación del matraz de crecimiento
      1. Autoclave frascos Erlenmeyer de tamaño adecuado. Normalmente, se utiliza una proporción de 1:5 entre el volumen total del matraz. Aquí, los medios LB de 100 ml se utilizan en un matraz de 500 ml.
      2. Con una pipeta serológica, transfiera medios estériles al matraz Erlenmeyer.
   2. Preparación de la serie de dilución
      1. Etiqueta 15 mL tubos de ensayo: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 y -9, distribuyendo 9ml PBS en cada uno. Estos números corresponden al factor de dilución utilizado para calcular la CFU/ml. Se necesita un nuevo conjunto de tubos para cada punto de tiempo de recolección. (Figura 2)
   3. Preparación de la placa de agar
      1. Placas de etiqueta con tiempo de recolección y factor de dilución. Por cada punto de tiempo habrá una placa para cada dilución.
4. Protocolo de curva de crecimiento
   1. Inoculación de medios
      1. Utilizando el cultivo líquido nocturno preparado como parte del paso 2.2.2, inocular los medios de matraz con 1:1000 volumen de cultivo. Aquí, se añade un cultivo líquido nocturno de 100 ml a los medios LB de 100 ml.
      2. Gire los medios para distribuir uniformemente las bacterias.
   2. Colección Timepoint
      1. Configuración de la condición de crecimiento
         1. Coloque el matraz en condiciones de crecimiento experimental elegidas para las bacterias dadas. Los plazos deben tomarse con frecuencia para las bacterias de rápido crecimiento y se pueden tomar en intervalos más largos para las bacterias de crecimiento lento. Aquí, E. coli se cultiva a 37oC con temblores a 210 revoluciones por minuto (rpm) y puntos de tiempo tomados cada 1 hora.
      2. Medición de densidad óptica (OD600)
         1. En cada punto de tiempo, incluido el punto de inactividad de inicio (t a 0), retire 1 ml de cultivo bacteriano y dispensar en una cubeta de espectrofotómetro.
         2. Limpie la cubeta y registre la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm. Si la lectura de la densidad óptica es mayor que 1,0, diluir 100 ml de cultivo 1:10 con medios frescos de 900 ml, registrar la densidad óptica y multiplicar este valor por 10 para la medición OD600.
      3. Medición de la unidad formadoras de colonias (CFU/ml)
         1. En cada punto de tiempo, retirar 1 ml de cultivo bacteriano y dispensar en el tubo de ensayo de vidrio -1 que contiene 9 ml de PBS.
         2. Para la serie de dilución, transfiera en serie 1 ml desde el tubo -1 por todos los tubos de dilución hasta el -9, vórtice después de cada transferencia. (Figura 2)
         3. Para cada dilución, dispensar 100 ml de suspensión celular a la placa de agar de medios sólidos etiquetada correspondientemente. (Figura 2)
         4. Usando un esparcidor celular que ha sido esterilizado en etanol, pasado a través de una llama del quemador Bunsen, y enfriado tocando la superficie del agar, esparza los 100 s de suspensión celular hasta que la superficie de la placa de agar se seque.
         5. Incubar las placas de propagación boca abajo a una temperatura que apoya el crecimiento de las bacterias. Aquí, E. coli se incuba a 37oC.
         6. Después de la incubación, una vez que surgen colonias visibles, contar el número de colonias bacterianas en cada placa y registrar estos valores junto con su factor de dilución asociado para todas las placas en cada punto de tiempo.

3. Análisis de datos y resultados

1. Gráfica de curva de crecimiento de densidad óptica (OD600)
   1. Trazar la densidad óptica (OD600) frente al tiempo en una escala de semiregistro. (Figura 3)
2. Unidad formadoras de colonias (CFU/mL) Gráfica de curva de crecimiento
   1. Para cada punto de tiempo, elija la placa de dilución donde el recuento de colonias cayó dentro del rango de 30-300 bacterias. Multiplique el número de recuento de colonias por el factor de dilución y luego por 10, ya que la dispersión de 100 l se considera una dilución adicional de 1:10 al calcular CFU/ml.
      
   2. Trazar las unidades formadoras de colonias en comparación con el tiempo en una escala de semi-registro. (Figura 4)
3. Relación de densidad óptica y unidades formadoras de colonias
   1. Trazar las unidades formadoras de colonias frente a la densidad óptica en una escala lineal para las lecturas OD600 menor o igual a 1.0 OD600 ya que la relación entre OD600 y CFU/mL es menos precisa más allá de 1.0 OD600. Aquí, se trazan los primeros seis puntos de tiempo. (Figura 5)
   2. Genere una línea de tendencia de regresión lineal que muestre la ecuación y el valor R^2.
4. Determinar el tiempo de duplicación de bacterias
   1. Usando la gráfica de curva de crecimiento de la unidad de formación de colonias, durante la fase exponencial, identifique dos puntos en el gráfico con la pendiente más pronunciada entre ellos para calcular el tiempo de duplicación.
   2. Cálculo del tiempo de duplicación
      1. 
      2. •Tiempo s 2 - t₁, donde t₁ - Punto de tiempo 1 y t₂ - Punto de tiempo 2
      3. , donde b es el número de bacterias en t₂, B - número de bacterias en t₁, y n número de generaciones. Derivado de: .
      4. Calcular el tiempo de duplicación utilizando:
         

Las parcelas de las unidades formadoras de colonias y la densidad óptica son dos formas de visualizar la cinética del crecimiento. Al determinar la relación entre CFU/mL y OD600, la gráfica de densidad óptica también proporciona una estimación de CFU/ml a lo largo del tiempo. Las condiciones que resultan en el menor tiempo de duplicación se consideran óptimas para el crecimiento de las bacterias dadas.

Las curvas de crecimiento son valiosas para entender la cinética de crecimiento y la fisiología de las bacterias. Nos permiten determinar cómo responden las bacterias en condiciones de crecimiento variables, así como definir los parámetros de crecimiento óptimos para una bacteria dada. Las gráficas de unidad de formación de colonias y densidad óptica contienen información valiosa que muestra la duración de la fase de retraso, la densidad celular máxima alcanzada y permite el cálculo del tiempo de duplicación bacteriana. Las curvas de crecimiento también permiten la comparación entre diferentes bacterias en las mismas condiciones de crecimiento. Además, la densidad óptica proporciona un medio para estandarizar los inóculos iniciales, mejorando la consistencia en otros experimentos.

Determinar qué enfoque utilizar al diseñar un experimento de curva de crecimiento requiere consideración. Como método preferido para generar curvas de crecimiento, las gráficas unitarias formadoras de colonias reflejan con mayor precisión los recuentos de celdas viables en el cultivo por lotes. Las parcelas unitarias formadoras de colonias también permiten medir el crecimiento bacteriano en condiciones que de otro modo interferirían con una medición de densidad óptica. Sin embargo, es un proceso que consume más tiempo, que requiere un uso extensivo de reactivos, y debe realizarse manualmente. Las gráficas de densidad óptica son menos precisas y proporcionan sólo una estimación de las unidades formadoras de colonias, lo que requiere una curva estándar que se generará para cada bacteria única. La densidad óptica se utiliza principalmente para su comodidad, ya que consume mucho menos tiempo y no requiere muchos reactivos para funcionar. Lo más atractivo para la densidad óptica, es que las incubadoras espectrofotométricas pueden generar automáticamente curvas de crecimiento, aumentando enormemente el número de condiciones de cultivo que se pueden probar a la vez y eliminando la necesidad de asistir constantemente a la cultura.

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7. Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R. 2007. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol 189:8746-9.