זיהוי מיקרואורגניזמים סביבתיים עם תגובת שרשרת פולימראז ואלקטרופורזה ג'ל

1. איסוף דוגמאות

1. לאסוף אדמה באמצעות אוגר או את חפירה עד לעומק נחוש. אם אוספים אדמה מהקרניזון (האזור הצר של האדמה המקיפה ומושפעת משורשי הצמח והמיקרואורגניזמים הקשורים אליהן), אוספים ישירות מסביב לשורשים הצמחיים רק על ידי פגיעה בקרקע לחבית איסוף.
2. לאסוף דגימת מים על ידי טבילת בקבוק פלסטיק סטרילי לתוך המים תוך החזקת הקצה של מקל הטבילה.

2. מיצוי והכנה של חומצות גרעין

1. לאסוף אורגניזמים ווירוסים מהדגימה, ולחלץ דנ"א ורנ"א מהם. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי JoVE על מיצוי חומצת גרעין קהילתית.
2. אחסן את הדנ"א שחולץ בצינורות מיקרופוגה מסומנים. אם ה- DNA צריך להיות מאוחסן בלילה או לתקופות זמן ארוכות יותר, להקפיא אותו ב -20 °C (70 °F), ולהפשיר את הצינורות בטמפרטורת החדר כאשר מוכן לשימוש.
3. אם החומר הגנטי שיש להתבצע הוא RNA (בין אם זה הגנום של וירוסי RNA, או ה- RNA המתומלל של אורגניזמים תאיים), בצע שעתוק הפוך (RT) על המדגם כדי ליצור DNA משלים (cDNA) לפני שתמשיך ל- PCR. לפרטים, אנא עיינו בסרטון החינוך המדעי של JoVE ב- RT-PCR.

3. תגובת שרשרת פולימראז

1. מניחים את האנזים PCR(למשל, טאק פולימראז) על קרח ומפשירים את ריאגנטים אחרים (חיץ PCR, dNTPs, פריימרים) בתוך מכסה המנוע "נקי" המיועד בטמפרטורת החדר. האנזים מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס אך לעולם אינו קופא. הוא רגיש לטמפרטורה, ולכן יש לשמור על קור רוח ועל חשיפתו לטמפרטורת הסביבה ממוזערת
2. חשב את הנפח של כל ריאגנט הדרוש כדי ליצור "תערובת ראשית" של כל הריאגנטים הקבועים בין כל התגובות (טבלה 1). הקפד להסביר פקדים חיוביים(לדוגמה,תבנית הידועה כמכילה את אזור היעד) ושלילי(לדוגמה,ללא תבנית) בחישובים. הוסף 10% נוספים לאמצעי האחסון הסופי כדי להסביר שגיאת צנרת. כרכים פריימר תלויים בדיקות עבור אורגניזמים ספציפיים; עיין בספרות שפורסמה עבור הערכים המתאימים.
3. באמצעות צינור מיקרו-קשירה נמוך, הממזער את ההידבקות של מולקולות ריאגנט לקירות הפלסטיק, מוסיפים את הנפחים המחושבים של כל ריאגנט כדי להרכיב את תערובת האב. מערבולת בעדינות וצנטריפוגות כל ריאגנט לפני הוספת. לאחר תערובת המאסטר מוכן, מערבולת לערבב ולאסוף על ידי צנטריפוגה
4. הכן רצועות PCR 8-tube. ייעד צינור לכל דגימה, כולל פקדים חיוביים ושליליים
5. מחלקים את הנפח המתאים של תערובת PCR לכל שפופרת של הרצועה
6. הוסף את הנפח המתאים של תבנית DNA מן הדגימות, כמו גם 5 μL של התבנית החיובית ו 5 μL של מים כיתה מולקולרית כמו שליטה שלילית, לתוך צינורות PCR בהתאמה.
7. מניחים את המכסה בבטחה על רצועת 8 הצינורות וצנטריפוגה למשך מספר שניות באמצעות מיני צנטריפוגה
8. מניחים את רצועת 8 הצינורות בתרמוסקלר
9. הגדר את תוכנית ה- PCR המתאימה לפעול על התרמו-מחזור. תוכנית טיפוסית מורכבת מהפעולות הבאות
   1. דנטורציה ב 94 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
   2. 30-40 מחזורים של הגברה: denaturation ב 94 °C (30 °F) עבור 30 s, חישול בטמפרטורה ספציפית פריימר (בדרך כלל בין 50-60 °C (50 °F) עבור 30 °C (30 °F), והרחבה ב 72 °C (72 °F) עבור 30 ° C / 500 bp.
   3. הארכה סופית ב 72 °C (7-10 דקות).

4. הכנת ג'ל אגרוז

1. בהתבסס על נפח הג'ל הרצוי וריכוז הג'ל (טבלה 2), לשקול את הכמות המתאימה של אבקת אגרוז לתוך בקבוק ארלנמאייר 125 מ"ל.
2. מוסיפים את הנפח המתאים של מאגר ג'ל לבקבוקון, ומערבבים את הבקבוק ביד.
3. מחממים את תערובת האגרוז במיקרוגל בעוצמה גבוהה במשך דקה אחת.
4. מוציאים את הבקבוקון מהמיקרוגל ומערבבים ביד כדי לוודא שכל האגרוז נמס. אם האגרוז לא נמס לחלוטין, מיקרוגל חוזר במרווחים של 30-s.
5. לאחר אבטחה הדוקה של המכסה על הבקבוקון, לקרר אותו ל 50 °C (50 °F) על ידי סיבוב תחת מים קרים זורמים.
6. הוסף 1 μL של אתידיום ברומיד (EtBr) לתערובת אגרוז באמצעות מיקרופיפט המיועד EtBr. EtBr הוא צבע הקושר חומצות גרעין כפולות נטושות פלואורסים כתומים כאשר הוא מואר באור UV. שים לב כי EtBr הוא פוטנציאל מסרטן, כך ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה, כפפות עמידות EtBr) חייב להיות משוחק.
7. יוצקים את הג'ל המותך לתוך מגש יציקה של ג'ל אלקטרופורזה. ודא כי אין בועות לכודות בתוך agarose. מניחים מסרק לתוך הג'ל ומהדקים בבטחה. המתן כ 20-30 דקות עד שהג'ל יתמצה.
8. לאחר הג'ל התגבש, להסיר את המסרק בזהירות מבלי לגרום לדמעות בג'ל. המסרק יוצר בארות בג'ל לטעינת הדגימות.

5. אלקטרופורזה ג'ל

1. מניחים את ג'ל אגרוז מוצק לתוך תא אלקטרופורזה.
2. מוסיפים את מאגר הריצה המתאים לתא עד שהג'ל בקושי שקוע.
3. על חתיכת Parafilm, כתמי פיפטה של תרכיז צבע טעינה. כלול גם סולם DNA של מגוון מתאים לגדלים הצפויים של מוצרי PCR. לחלופין, השתמש קבוצה חדשה של צינורות microfuge, אחד עבור כל מדגם.
4. לאחר ה- PCR, יש לאחזר את רצועת 8 הצינורות מהתרמוסקלר, ובקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף עיבויים. הוסיפו נפח מתאים של מוצר DNA לצבע הטעינה והפפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. לדוגמה, 2 μL של צבע טעינה 10x מעורבב עם 8 μL של מדגם כדי לתת נפח סופי של 10 μL, עם הצבע ב 1x.
5. פיפטה כל תערובת דגימת צבע לתוך בארות המיועדות בג'ל אגרוז, נזהר לא לנקב את בארות.
6. חבר את האלקטרודות לתא האלקטרופורזה. הדנ"א טעון לרעה, כך שהוא "רץ" לעבר האלקטרודה החיובית. לכן, לחבר את האלקטרודה החיובית לצד הנגדי של התא, שם בארות היו טעונות. הגדר את ספק הכוח למתח המתאים למערכת החיץ ולגודל תא הג'ל, והגדר אותו לפעול. בועות קטנות צריכות להיות גלויות נעות במעלה צידי התא אם האלקטרופורזה מתקדמת כראוי.
7. ברגע שחזית הצבע התקדמה מספיק במורד הג'ל, כבה את אספקת החשמל. בזהירות להעביר את הג'ל לתוך transilluminator או הדמיה חזותית ולהדליק את אור UV כדי לדמיין את רצועות ה- DNA על הג'ל.
8. לנתח את גודל הרצועה ואת המיקום על הג'ל. השווה את מיקומי הרצועה של הדגימות לשליטה החיובית כדי לקבוע אם DNA מהאורגניזם מעניין נמצא במדגם (איור 1).

טבלה 1. אמצעי אחסון ריאגנט עבור תערובת מאסטר PCR. *נפחי הפריימר משתנים בהתאם לאי-ההסתעפות של האורגניזם. התאם את נפח המים המולקולריים כדי להפוך את הנפח הסופי 45 μL. אמצעי אחסון של רכיבים אחרים אינם אמורים להשתנות.

טבלה 2. גודל שבר DNA טווחים נפתרו בצורה אופטימלית על ידי אחוזי ג'ל אגרוז שונים.