Method Article
וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.
וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם.
פיצול hESCs מ Matrigel כדי Matrigel
בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על Matrigel ניתן לפצל 1:03-01:05 עוד צלחת Matrigel, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול.
זיהוי סמנים pluripotency ידי מיקרוסקופית immunofluorescence
מיקרוסקופיה immunofluorescence משמש כדי לבחון את הביטוי של סמנים hESC pluripotency אוקטובר-4-4 ו SSEA במהלך culturing.
אדם בתאי גזע עובריים קבלות
ES התקשורת (תא גזע עובריים התקשורת):
DMEM/F12 - 400ml
נוק סרום תחליף - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 5 מ"ל
200mm GlutaMax / BME פתרון - 5 מ"ל
פניצילין / סטרפטומיצין - 5 מ"ל
מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה hESC בבקבוקים 500ml ב 4 ° C. טוב לכל היותר שבועיים.
MEF התרבות מדיה:
DMEM - 1000ml
FBS - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 10 מ"ל
גלוטמין - 10 מ"ל
Penicllin / סטרפטומיצין - 10 מ"ל
מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה MEF ב 4 ° C.
הפתרון 200mm Glutamax / BME:
Glutamax - 100 מ"ל
β-mercaptoethanol (פתרון במלאי ב 14.3M) - 140 μ1
מערבבים היטב שני פתרונות ואז 10ml מנות aliquot. שמור aliquots ב -20 ° C.
bFGF פתרון (הריכוז הסופי של המניה: 10 מיקרוגרם / מ"ל):
bFGF (FGF2) - 50 מיקרוגרם
0.1% ב BSA 1xPBS, pH 7.4 - 5 מ"ל
ממיסים 50 מיקרוגרם bFGF ב BSA 0.1% 5 מ"ל לעשות המניה 10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך μl 500 חלקים. חנות ב -80 ° C.
Collagenase IV פתרון (1mg/ml):
Collagenase IV - 50 מ"ג
DMEM/F12 מדיה - 50 מ"ל
מוסיפים את אבקת IV collagenase לצינור בז 50 מ"ל. ב למכסה המנוע, לערבב 50 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת סטרילית. הפתרון וורטקס דקות 1 <. כדי לוודא את אבקת מתמוסס. ב למכסה המנוע, לעבור 0.22 מיקרומטר לסנן לתוך צינור חדש סטרילי בז 50 מ"ל. פתרון זה הוא טוב לכל היותר 2 שבועות מאוחסנים 4 ° C.
Dispase פתרון (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 מדיה - 8ml
Dispase מסחרי Aliquot 5mg/ml פתרון ולאחסן ב -20 ° C. מדולל dispase כדי 1mg/ml באמצעות DMEM/F12. פתרון זה יכולים להישמר במשך שבוע 1 ב 4 ° C.
זו סדרה של 3 סרטונים מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין (וידאו 1), כיצד מעבר להם Matrigel תא ללא מזין צלחות (וידאו 2), וכיצד לשמור על hESCs ידי passaging במזין Matrigel תא ללא תנאים (וידאו 3). מחקרים קודמים הראו כי רבים ותחזוקה של, hESCs קיימא מובחן דורש על התרבות תאים מזין מומת MEF. עם זאת, ניסויים רבים, אוכלוסיה טהורה של hESCs ללא זיהום תא מזין נדרשת. כדי להשיג מטרה זו, אנו הדגימו כיצד hESCs קטע מתוך צלחות MEF מזין מזין את התאים ללא צלחות Matrigel וכיצד לשמור ברציפות hESC מעבר מושבות מזין תנאי התא חינם. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, כמות קטנה של זיהום תא MEF מזין עדיין יכול להתקיים במעבר אחד על צלחת Matrigel, אך זיהום זה הוא בדרך כלל קל לדמיין. במעבר Matrigel שניים מעבר, זיהום MEF לא נמצא בדרך כלל, משאיר האוכלוסייה טהור של hESCs לניסויים. מכתים immunofluorescence ו cytometry מיקרוסקופית או זרימה עבור סמנים hESC pluripotency, כגון אוקטובר-4 ו SSEA-4, יש צורך לאשר אחזקת hESCs במצב מובחן במהלך התרבות.
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד"ר Amander קלארק, ד"ר ג'רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.