מתן חומרי הרדמה נדיפים לזחלי דג הזברה לתצפית התנהגותית

פרוטוקול זה מציג שיטה נגישה ליצירת סביבה אטומה לגז למתן חומרי הרדמה נדיפים לזחלי דגי זברה לניסויים התנהגותיים.

מחקר זה מתאר שיטה ייחודית למתן חומרי הרדמה נדיפים, כגון איזופלורן וסבופלורן, לזחלי דגי זברה במהלך ניסויים התנהגותיים. בעוד שדגי הזברה מציעים יתרונות רבים כאורגניזם מודל של בעלי חוליות - כולל התנהגויות מורכבות, יכולת גנטית, עוברים שקופים והתפתחות מהירה - השימוש בהם בחקר חומרי הרדמה נדיפים היה מוגבל. מתן חומרי הרדמה נדיפים דורש לעתים קרובות מכשירים מורכבים או מסורבלים שעשויים שלא להיות נגישים באופן נרחב, מה שיוצר מחסומים למחקר פרמקולוגי של חומרי הרדמה נדיפים באורגניזמים מודלים מימיים. שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה המשתמשת ביריעות סיליקון דביקות ליצירת אטימה אטומה לגז על לוחות זכוכית של 96 בארות. התיקוף בוצע באמצעות הערכת תנועה ספונטנית, שלא הראתה הבדלים משמעותיים בין בארות אטומות לפתוחות לאורך תקופה של 90 דקות. בנוסף, ריכוז חומרי ההרדמה נשאר יציב לאורך זמן, כפי שנמדד על ידי HPLC. התוצאות המייצגות כוללות קביעה ניסויית של ערכי ריכוז אפקטיבי חציוני (EC₅₀) עבור סבופלורן. מחקר זה מספק גישה פשוטה ונגישה לניסויים פרמקולוגיים באמצעות חומרי הרדמה נדיפים, שניתן להתאים בקלות לחקר חומרים נדיפים אחרים ונקודות קצה ניסיוניות.

מודלים של בעלי חיים שאינם מימיים (תולעים, זבובים, מכרסמים, ארנבות, פרימטים וכו') היו מבחינה היסטורית המודלים הנפוצים ביותר לחקר פרמקולוגיה של הרדמה. בכל אחד מהמינים הללו, חומרי הרדמה נדיפים (הניתנים באמצעות שאיפת גז) מאתגרים הרבה פחות ממתן חומרי הרדמה תוך ורידיים (הניתנים בנתיבים תוך-ורידיים או תוך-צפקיים)¹. בנוסף לאתגר הטכני של מתן התרופות התוך-ורידיות, השגת מצב יציב של הרדמה היא הרבה יותר קלה עם חומרים נדיפים מאשר חומרים תוך-ורידיים².

מתן חומרי הרדמה תוך ורידיים למינים מימיים של זחלים יכול להיות מושג על ידי דיפוזיה מהמדיום המימי הסובב אותם ^3,4, ולכן הוא דומה יותר למתן חומרי הרדמה נדיפים למינים שאינם מימיים. במשך שנים רבות, ראשנים (Xenopus laevis) היו המודל הנבחר לחקר חומרי הרדמה בשל קלות מתן התרופות ופרמקוקינטיקה במצב יציב שהושגה על ידי הוספת אמבטיה פשוטה של חומר ההרדמה למי הבריכה המלאכותית שלהם ^5,6. עם זאת, ישנן דוגמאות מעטות יחסית לחקר חומרי הרדמה נדיפים במודל זה בשל הדרישה למכשירים אטומים לגז שלעתים קרובות בנויים במיוחד ויכולים להיות מסורבלים לשימוש ^7,8.

בשנים האחרונות הפך דג הזברה למודל מועדף לחקר חומרי הרדמה תוך ורידיים בשל אותה קלות במתן תרופות בנוסף ליתרונות אחרים כמו ההתנהגויות המורכבות המתוארות היטב שלהם וזמינות יחידות מסחריות לצפייה בהתנהגויות אלה⁹. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה השתמשו ביחידות תצפית זמינות מסחריות כאלה כדי לסנן תרכובות נוירואקטיביות, כולל חומרי הרדמה, תוך שימוש בפורמטים של צלחות של 96 בארות ו-24 בארות כדי לכמת את התנהגות זחלי דג הזברה 4,10,11,12,13,14,15 . שלבי הזחל מתאימים במיוחד למחקרי פרמקולוגיה בשל יכולתם להעריך תגובות התנהגותיות רבות, גודלם הקטן, תאימות התפוקה הגבוהה והמעגלים העצביים המאופיינים היטב ^9,16,17. עם זאת, מגבלה משמעותית אחת במחקרים אלה של חומרי הרדמה במודל דג הזברה היא הקושי היחסי במתן חומרי הרדמה נדיפים. מגבלה זו הובילה לדוגמאות מועטות להשוואה בין חומרים נדיפים לוורידים ^4,15,18. היכולת ללמוד ולהשוות בקלות את שני סוגי חומרי ההרדמה במודל של חיה אחת מוסיפה כלי חשוב להקל על חקר פרמקולוגיה מרדימה בכל המחלקות.

באופן מסורתי, חקר חומרי הרדמה תוך ורידיים במין מימי דרש ציוד מיוחד, לעתים קרובות מותאם אישית, שיכול להיות קשה לשימוש או שאינו אטום מספיק לגז כדי למנוע אובדן חומר ההרדמה למשך הניסוי. ההליך המתואר כאן מציג אמצעי חלופי נגיש לייצור אטימה אטומה לגז בתא זכוכית המתאים לתצפית על התנהגות דג הזברה באמצעות יחידת תצפית מסחרית (ראה טבלת חומרים).

כל הניסויים בדגי הזברה נערכו בהתאם לפרוטוקולי שימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). דגי זברה בוגרים הוחזקו במתקן הימי של אוניברסיטת פנסילבניה תחת פיקוח המעבדה האוניברסיטאית למשאבי בעלי חיים (ULAR). דגי זברה ארוכי סנפיר מסוג טובינגן גודלו בבית לכל הניסויים ונשמרו בתנאי גידול סטנדרטיים עם מחזור אור/חושך של 13/11 שעות עד שהגיעו ל-5 ימים לאחר ההפריה (dpf). הניסויים נערכו באמצעות שכפולים ביולוגיים, עם מצמדים שמקורם בזוגות הזדווגות נפרדים כדי להבטיח מגוון ביולוגי הולם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור יריעות סיליקון דביקות

הערה: ניתן להשיג מקבילות לחומר זה (יריעת סיליקון בתוספת דבק) ממקור מסחרי, אך לעתים קרובות בהוצאה גדולה יותר ובזמינות פחותה.

1. הניחו את יריעת הסיליקון 0.5 מ"מ על משטח נקי וישר.
2. בדוק את הסדינים לאיתור קמטים והימנע מהם במידת האפשר.
   הערה: יריעות סיליקון עם קמטים עשויות שלא להיצמד כראוי לסרט ועלולות לגרום לאיטום לא מספק של הבארות ו/או להדמיה לקויה של דג הזברה.
3. נקו את הסדינים עם 70% אלכוהול כדי להסיר שמן או פסולת והניחו להם להתייבש.
4. בעזרת מוליך, כגון מברשת, מרחו שכבה דקה ואחידה של פריימר דבק על יריעת הסיליקון. כדי למנוע מריחת יתר, עבדו בחלקים קטנים יותר מכיוון שמקדם הדבק מתייבש במהירות (מתייצב תוך 1-5 שניות).
   הערה: ללא מקדם הדבקה זה, הסרט לא יידבק כראוי ליריעת הסיליקון.
5. לאחר מריחת מקדם הדבק, יישר את הסרט המצופה כפול עם יריעת הסיליקון כשגב הנייר פונה כלפי מעלה.
6. מרחו את הסרט בהדרגה על הסיליקון באמצעות רולר כדי להחליק את פני השטח ולהסיר בועות אוויר (לאחר המריחה הראשונית, עבודה עם סיליקון כלפי מעלה תסייע בהדמיה והסרה של בועות אוויר).
7. אפשר למקדם הדבק להתרפא לחלוטין למשך 24 שעות על משטח ישר.
8. חותכים את הסיליקון הדביק לרצועות ברוחב 10 מ"מ לפחות (קוטר באר 7.5 מ"מ בתוספת חפיפה מכל צד).
   הערה: בעת שימוש בכל שורה שנייה של לוחית הבאר, שונות רחבה יותר ברצועות לא תשפיע לרעה על בארות בשורות סמוכות, מה שעשוי לא רק להקל על היישום אלא גם להיות הכרחי כדי להשיג איטום סביב כל היקף הבאר.
   1. ודא שהרצועות ארוכות מספיק כדי לכסות לפחות את רוחב שורה אחת של צלחת הבאר.
      הערה: אם משתמשים בצלחת באר שאינה 96 באר, כגון צלחת 24 באר או 48 בארות, ניתן לכוונן או לחתוך את גדלי הרצועות כך שיתאימו למידות הספציפיות של הצלחת, מה שמבטיח כיסוי נכון ללא קשר לגודל הצלחת.

2. הכנת פתרונות

הערה: כל תמיסות המלאי והבדיקה של חומרי הרדמה נדיפים נעשו ממש לפני הניסוי כדי למנוע אובדן ריכוז התרכובות הנדיפות .

1. עבור כל תמיסה (מלאי או תמיסת עבודה), הוסף נפח של ממס לא נדיף (מי עובר E3, DMSO וכו') לבקבוקון HPLC או נצנוץ שבשילוב עם הדילול הסופי של חומר הרדמה נדיף, הנפח הכולל ימלא את הבקבוקון במידה מספקת וישאיר מרווח ראש מינימלי (ראה איור 1A).
2. הוסיפו חומר הרדמה נדיף עם מזרק אטום לגז של המילטון ואטמו במהירות את הבקבוקון.
   הערה: ניתן להשתמש בתמיסות מלאי בבקבוקונים עם מכסי מחיצה כדי להקל על דילולים נוספים באמצעות העברת תמיסה עם מזרקים אטומים לגז.
3. לאחר מכן, מערבבים את הבקבוקונים (מערבולת, סוניקציה) לפי הצורך ומאחסנים אותם באופן זמני תוך כדי הכנת צלחות דג הזברה.

3. הגדרת הניסוי ההתנהגותי

הערה: שלב זה של הפרוטוקול עשוי לדרוש תרגול מסוים. מומלץ לעבוד ללא דגים או תמיסות המכילות חומר יקר עד שנוח עם הטכניקה.

1. מעבירים דג זברה אחד (5 dpf) לכל שורה שנייה של צלחת הזכוכית בת 96 בארות.
   הערה: השארת כל שורה שנייה ריקה מאפשרת פוטנציאל מופחת לזיהום בארות סמוכות מזליגה מכיוון שהבארות אטומות בשלב 3.4.
2. הסר בזהירות את תמיסת E3 מכל באר. ניתן לעשות זאת שורה אחת בכל פעם או על הצלחת כולה אם היא מסוגלת לעבוד במהירות.
   הערה: משך הזמן שבו הזחלים היו מחוץ לתמיסה צומצם כדי להפחית את הלחץ הפוטנציאלי. ניתן להשתמש בהליכים חלופיים על סמך צרכים ניסיוניים שונים, כולל הסרה חלקית בלבד של התמיסה לפני הוספת התמיסה המכילה תרופה כדי למזער את הלחץ. יש להתאים את הפרוטוקול לצרכי הניסוי, כולל זמן שיווי משקל שניתן לבעלי החיים כדי לפצות על כל לחץ פוטנציאלי, יעילות ערבוב תמיסות ודיוק הריכוזים של תמיסה המכילה תרופה, אם לא כל ה-E3 מוסר לפני הוספת תמיסת העבודה.
3. לאחר מכן, השתמש בפיפטה העברה כדי למלא כל באר בשורה בתמיסה הניסיונית. הקפד לא להכניס בועות. מילוי יתר של כל באר (איור 1B).
4. בעזרת רצועות הסיליקון הדביקות המיוצרות בשלב 1, לחץ את הרצועה כלפי מטה במהירות (איור 1C). זה עוזר למנוע היווצרות בועות ומונע מדגים לעלות על גדותיהם לבארות סמוכות.
5. לחץ בחוזקה על החלק העליון של הצלחת כדי להבטיח שכל באר אטומה.
6. חזור על שלבים 2-5 עד להחלפת התמיסה ואטימות הבארות עבור כל שורה שנייה של לוחית הבאר (איור 1D).
7. הפוך בעדינות את הצלחת ובדוק אם יש בועות אוויר.
   הערה: נוכחותן של בועות אוויר תטשטש את ההדמיה של תנועת דג הזברה.
8. הנח את הצלחת ביחידת תצפית ההתנהגות (צד דבק הסיליקון כלפי מטה) ובצע את הניסוי ההתנהגותי (ראה סעיף תוצאות לפרטים).

השוואה לתצפית מסורתית על בארות פתוחות
על מנת להעריך האם לאיטום דבק יש השפעה כלשהי על תנועה ספונטנית, נעשתה השוואה בין הבקרות בבארות פתוחות לעומת בארות אטומות. כפי שניתן לראות באיור 2A, לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בתנועה בין הקבוצות האלה למשך הזמן הסטנדרטי של ~30 דקות ששימש בניסויים המתוארים במאמר זה. מתוך הכרה בכך שפרדיגמות ניסוי אחרות עשויות להזדקק לחשיפה ניסויית ארוכה יותר, בוצע קורס זמן של שעתיים, שלא חשף הבדל סטטיסטי בתנועה עד לציון השעתיים (ראה איור 2B). משך ניסוי ארוך יותר יביא ככל הנראה להפרש גדול עוד יותר בתנועה. מחקרים קודמים כימתו את ההשפעה השלילית של היפוקסיה על התנהגות השחייה¹⁹, ובסופו של דבר פגעו בשלמות תוצאות הניסוי. לפיכך, ההשערה היא כי היפוקסיה ו/או ייצור CO₂ הם הגורמים הסבירים ביותר לסטייה זו ב-SM בהשוואה לבקרות באר פתוחות. למרבה הצער, האיטום האטום לגז המונע אובדן חומר הרדמה נדיף מהבאר הסגורה מונע גם דיפוזיה של גזים אחרים לתוך או מחוץ לתמיסה הסגורה. המשמעות היא, כמובן, דיפוזיה מוגבלת של_CO2 וחמצן כפי שהם מיוצרים ונצרכים בהתאמה על ידי הדגים. זוהי מגבלה חשובה ביחס למשך הניסוי האפשרי בשיטה זו. חשוב גם לציין שעם הזמן מתחילות להיווצר בועות קטנות בבארות שהיו בעבר נטולות בועות, ככל הנראה בגלל חילוף החומרים. עם זאת, במהלך הבדיקה, בועות אלו לא הפריעו למעקב אחר דג הזברה על ידי התוכנה. נראה כי לניסויים של עד שעה וחצי (בתוספת זמן שיווי משקל) אין השפעה משמעותית על מעקב ה-SM של דגי הזברה מסוג הבר הללו, אך דגים שמפגינים יותר תנועה או שיש להם דרישות מטבוליות מוגברות אחרות עשויים שלא להתאים לניסויים באורך כזה.

ריכוז חומרי הרדמה נדיפים לאורך זמן
כדי להבטיח ריכוז עקבי של חומר הרדמה נדיף לאורך זמן, נעשה שימוש בבארות ללא דג זברה למדידת מהלך זמן של ריכוז חומר ההרדמה כפי שנקבע על ידי HPLC. אותה תמיסה נוספה לכל באר, וריכוז הסבופלורן או האיזופלורן נמדד כל 15 דקות למשך 3 שעות (כל מדידה מבאר אחרת, בניגוד למדידות חוזרות מאותה באר). כפי שניתן לראות באיור 3, כמעט אף חומר הרדמה לא אבד לאורך כל מהלך הזמן עם סבופלורן (לחץ אדים של 197 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס), שיש לו לחץ אדים נמוך יותר מאיזופלורן (לחץ אדים של 238 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס) שהראה אובדן של 4% ב-3 שעות. אף אחד מחומרי ההרדמה הנדיפים לא הראה אובדן ניכר במרווח של 30 דקות עד 60 דקות, האופייני לניסויים התנהגותיים רבים.

עוצמת הסבופלורן בזחל דג הזברה
טכניקה זו שימשה למדידת העוצמה של חומרי הרדמה נדיפים בדגי זברה¹⁵, ועשויה להיות עדיפה על מתודולוגיות אחרות ששימשו בעבר⁴. הריכוז האפקטיבי החציוני (EC₅₀) עבור סבופלורן על ידי מדדים של תנועה ספונטנית (SM) ותנועה מעוררת (EM) מוצג באיור 4. בטכניקת באר אטומה, נקבעו ערכי EC₅₀ של 62 מיקרומטר (95% CI: 49-81) עבור SM, ו-126 מיקרומטר (95% CI: 81-193) עבור EM. ערך ה-SM דומה ל-EC₅₀ שדווח בעבר של 76 מיקרומטר (95% CI: 50-114). עם זאת, הערך שדווח בעבר של 240 מיקרומטר (95% CI: 169-328) עבור EM הוא כמעט כפול מהערך שהתקבל כאן⁴. מבלי לבצע מחקר HPLC דומה של מתודולוגיה זו (גריז ואקום וכיסוי זכוכית ליצירת אטימה אטומה), לא ניתן לומר בוודאות אם הבדל זה נובע מאובדן חומר הרדמה נדיף לאורך זמן. עם זאת, זוהי השערה רציונלית, במיוחד בהתחשב בכך שהגירוי ל- EM (ברז אקוסטי) נרשם בסוף זמן התצפית ההתנהגותית. ללא קשר לשיטת איטום הבאר, לכל אובדן של ריכוז הסבופלורן תהיה ההשפעה הגדולה ביותר בנקודות זמן מאוחרות יותר. כמובן, הבדלים אלה יכולים לנבוע מגורמים בסיסיים אחרים, כגון הרקע הגנטי של דג הזברה.

איור 1: שלבים פרוצדורליים עיקריים. (א) בעבודה עם תמיסות נדיפות נעשה תכנון דילול כדי למזער את מרווח הראש בכל בקבוקון. (B) מילוי יתר של בארות מבוצע כאשר מוסיפים תמיסות ניסיוניות לאלה שמכילים דג זברה כדי לסלק בועות אוויר. (ג) רצועות דבק סיליקון מונחות מצד אחד של הצלחת לצד השני כדי למנוע לכידת אוויר. (ד) כל שורה שנייה משמשת לניסויים למניעת זיהום בארות סמוכות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השוואה של תנועה בבארות אטומות לעומת בארות פתוחות. (A) משווים תנועה ספונטנית כוללת מ-0 דקות ל-4 דקות לאחר שיווי משקל של 15 דקות ביחידה ההתנהגותית. תנועה של 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) דג זברה בבארות פתוחות (254 מ"מ, 95% CI: 185-322) ובבארות אטומות (257 מ"מ, 95% CI: 186-326) אינה מראה הבדל משמעותי (P = 0.374). (B) אחרי תקופת הסתגלות של 15 דקות במערכת ההתנהגות של דג הזברה, דגים (N ≥ 36) נצפים לתנועה ספונטנית (מרחק הנסיעה הכולל) במשך תקופה של 4 דקות בתחילת כל חצי שעה. הנתונים מוצגים כאחוזי בקרה (בארות פתוחות), עם השוואות סטטיסטיות (ANOVA) שנעשו לנקודת הזמן של 0 שעות. באמצעות סף ערך P של <0.05, נצפה הבדל משמעותי בתנועה בין בארות פתוחות ואטומות בסימן 2 שעות (P = 0.0139), המודגש באדום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: התאוששות של סבופלורן לאורך זמן. ריכוזי הסבופלורן והאיזופלורן בלוחות באר זכוכית אטומים בדבק סיליקון נקבעים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לאורך תקופה של 3 שעות. אחוז התאוששות, המחושב כממוצע של שלושה שכפולים, מוצג בחלק התחתון של הגרף. איזופלורן מציג אובדן ריכוז של עד 4% לאחר 3 שעות, ככל הנראה בשל לחץ האדים הגבוה יותר שלו (238 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס) בהשוואה לסבופלורן (197 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: עקומות Sevoflurane EC₅₀ . עקומת סבופלוראן_{EC 50} בבארות אטומות נקבעת על סמך תנועה ספונטנית (על פני תקופה של 4 דקות), ותנועה מעוררת (פרק זמן של שנייה אחת לאחר הקשה אקוסטית) של דג זברה של 5 dpf. התנועה מותאמת לפקדי DMSO בלבד. הערך הסופי של EC₅₀ מחושב כ-62 מיקרומטר (רווח בר-סמך 95%: 49-81) עבור תנועה ספונטנית (SM) ו-126 מיקרומטר (רווח בר-סמך 95%: 81-193) עבור תנועה מעוררת (EM). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מאמר זה מתאר שיטה למתן חומרי הרדמה נדיפים, כמו סבופלורן, לדגי זברה זחלים, ששימשה לכימות עוצמת ההרדמה הנדיפה בדגים מסוג בר. למרות שטכניקה זו פשוטה מבחינה רעיונית, ניתן לדרוש תרגול כדי להבטיח שורת בארות אטומה כראוי ונטולת בועות במסגרת זמן קצרה כדי למזער את אובדן החומרים הנדיפים. מכיוון ששיטה זו מיועדת לתרכובות נדיפות, היא דורשת לא רק מריחה זהירה של דבק הסיליקון על צלחת הבאר אלא גם הכנה מדוקדקת של פתרונות ניסיוניים כדי לייעל את הדיוק של ריכוזי תרכובות נדיפות.

לכידת אוויר עלולה לעכב הדמיה ומעקב מדויקים. בנוסף לתרגול האיטום, מילוי ובדיקה קפדניים של כל באר הם קריטיים מכיוון שלא סביר שכל בועות הקיימות לפני האיטום לא יוסרו במהלך תהליך האיטום. מילוי יתר של בארות מסייע גם במניעת לכידת אוויר בכל באר. עם זאת, מילוי יתר יתר עלול להוביל להעברה לא מכוונת של דגים לבארות סמוכות. אם זה קורה, נסה למלא פחות. מזעור מילוי יתר עודף לא רק יסייע להעברה לא מכוונת של דגים לבארות סמוכות, אלא עשוי לשפר את יעילות הדבק המשמש לאיטום בנוכחות כמויות גדולות של תמיסה עודפת. למרות שהדבק נבחר במיוחד בחלקו בשל יכולתו להיצמד למשטחים רטובים, התחלה עם פלטה נקייה ויבשה מבטיחה שאף חומר אחר לא יפריע להידבקות, ובכך משפר את השלמות הכוללת של מערך הניסוי. אם בועות עדיין נמשכות למרות היעדר בועות הרבה לפני מריחת הדבק, אופטימיזציה של מילוי יתר וטכניקת יישום דבק סיליקון, ייתכן שהסיבה לכך היא שימוש ברצועות דבק צרות מדי. רצועות שאינן רחבות מספיק עלולות לא לאטום, או לאטום בצורה לא מספקת כדי למנוע הכנסת אוויר במהלך תהליך היישום או לאחריו. הקדמה פוטנציאלית נוספת של שגיאה בטכניקה זו היא איכות האיטום המיוצר על ידי רצועות הסיליקון הדביקות, שיכולה להיגרם מקמטים בסיליקון, איטום לא מספיק של הדבק (פריימר דבק לא מספיק, זמן ריפוי או ניקוי משטחים לפני מריחת סיליקון). למרות שנראה שהדבק עצמו מספק אטימה הדוקה מספיק, ללא הסיליקון כגיבוי מגן, הדבק לבדו עלול להיכשל בעמידות נאותה למים כדי להגן מפני אמבט המים המסתובב לאורך כל הניסוי.

לוחות זכוכית מתאימים היטב ליישום זה מכיוון שבניגוד לפלסטיק רבים²⁰, הם תואמים לחומרים הידרופוביים כמו חומרי הרדמה נדיפים, פני השטח שלהם שטוחים (בניגוד ללוחות באר פלסטיק טיפוסיים), המאפשרים הידבקות של פס הסיליקון, ויש להם תחתית שקופה (בניגוד לטפלון וכמה לוחות פלסטיק). לוחות באר קוורץ עשויים לספק בהירות אופטית מוגברת לניסויים שבהם יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. כל הנתונים לדוגמה המוצגים כאן התקבלו בלוחות זכוכית של 96 בארות, ולוחות דומים אחרים זמינים מסחרית בפורמטים גדולים יותר של בארות, אך אלה לא נבדקו על ידי המחברים. פתרונות נוספים בבאר גדולה יותר עשויים להגדיל את משך הזמן הפוטנציאלי של ניסוי בטכניקה זו עקב זמינות גדולה יותר של חמצן ועשויים גם להקל על ניסויים עם דגי זברה מבוגרים יותר, אך שינוי ניסוי בדרך זו ידרוש אימות נוסף. שינויים אחרים בטכניקה זו כוללים יישום של טכניקה זו על פרדיגמות התנהגותיות אחרות (למשל, גירויים כגון אור)²¹, מודלים גנטיים שונים, סוגים אחרים של מחקרים פרמקולוגיים (למשל, מתן משותף של תרופות), ואולי אפילו התאמה למחקרי הדמיה.

שיטה זו מספקת שיטה פשוטה ונגישה למתן תרכובות נדיפות לדגי הזברה לצורך תצפית התנהגותית. דגי הזברה הם מודל פופולרי יותר ויותר לחקר חומרי הרדמה, בפרט חומרי הרדמה תוך ורידיים (IV) (פרופופול, אטומידאט, קטמין וכו'). זה נובע בחלקו מהקלות במתן תרופות, אך ישנם גם שיקולים פרמקוקינטיים מופחתים בהשוואה למתן חומרי הרדמה לווריד למודלים של בעלי חיים שאינם מימיים (תולעים, זבובים, מכרסמים, בני אדם וכו') הדורשים מודלים של עירוי מבוקר מטרה למתן במצב יציב². זה דומה למתן חומרים נדיפים בבעלי חיים אלה, שהוא פשוט כמו לשים את החיה בקופסה ולגרום להם לנשום את החומר מעורבב עם חמצן/אוויר. מתן חומרים נדיפים לבעלי חיים מימיים (דג זברה, ראשנים) מסובך יותר מכיוון שהוא דורש סביבה מימית אטומה. הבדל זה נוטה לחלק את השימוש במודלים מסוימים של בעלי חיים עבור חומרי הרדמה מסוימים, אך בשיטה המוצגת כאן, ניתן להעביר בקלות את שני סוגי חומרי ההרדמה לאותו מודל של בעלי חיים. היכולת להשוות בקלות פרדיגמות ניסיוניות שונות במודל יחיד למרות דרכי מתן שונות. זה יכול להיות מותאם גם לשימוש בחומרי הרדמה נדיפים באופן שמנצל את החוזקות האחרות של דג הזברה, כולל יכולת האחיזה הגנטית שלהם, התפתחות מהירה ועוברים שקופים, המאפשרים תצפית בזמן אמת על תגובות פיזיולוגיות. הבנת ההשפעה של חומרי הרדמה נדיפים, כגון איזופלורן וסבופלורן, בדגי הזברה יכולה לשפר את ההבנה של מנגנוני הפעולה ותופעות הלוואי שלהם. מתודולוגיה חדשנית זו מספקת מסגרת חזקה לחקירת חומרי הרדמה נדיפים בדגי זברה.

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחינוך ומחקר הרדמה (FAER). איור 1 נוצר בשנת BioRender.com.