כימות מיקרו-פלסטיק וננו-פלסטיק מבוססי פוליבוטילן אדיפט טרפתלט מהקרקע באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון

מתוארת כאן שיטה לכימות מיקרו וננו-פלסטיק שמקורו בפוליבוטילן אדיפט טרפתלט בקרקע באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית. טכניקה זו משפרת את המתודולוגיה הקיימת מכיוון שהיא משתרעת על כימות של ננו-פלסטיק וניתן להתאים אותה בקלות לעיבוד דגימות סביבתיות בכמויות גדולות.

יש צורך בשיטה לשחזור וכימות מיקרו-פלסטיק וננו-פלסטיק (MPS ו-NPs) שנוצרו בקרקע במהלך פירוק ביולוגי כדי להעריך במדויק את הפירוק וההשפעה הסביבתית של מוצרי פלסטיק מתכלים. נוכחותם של MPS ו-NPs באדמה עשויה לשנות את תכונות הקרקע כמו התנהגות צבירה או להשפיע על ביוטה בקרקע. שיטות התאוששות MP קיימות לא תמיד מתאימות למדידת פולימרים מתכלים כמו פוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT); כמה הליכי עיכול נפוצים עם חומצות או מחמצנים יכולים להרוס MPS מתכלים מבוססי PBAT. שיטות זיהוי כמו ספקטרוסקופיה של מיקרו-FTIR ומיקרו-ראמאן מוגבלות גם על ידי הגודל המינימלי של חלקיקים שניתן לשחזר ולנתח. לכן, שיטה זו פותחה כדי לחלץ ולכמת PBAT מהקרקע כדי להעריך את חלק המסה של MPS ו-NPs בקרקע מבלי לשנות כימית PBAT. בפרוטוקול משתמשים בתמיסת כלורופורם-מתנול למיצוי סלקטיבי של PBAT מהאדמה. הממס מתאדה מהתמצית, ולאחר מכן התמצית מומסת מחדש בכלורופורם דוטראט. התמצית מנותחת על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון (¹H-QNMR) תחת פרמטרים כמותיים כדי לכמת את כמות ה-PBAT בכל דגימה. יעילות מיצוי הממסים עבור PBAT נעה בין 76% באדמת טיט מוצלת ל-45% באדמת טיט חולית של אלקהורן. התאוששות PBAT עשויה להיות מופחתת עבור חומרים מחומצנים בהשוואה לחומרים בתוליים ועשויה להיות מופחתת בקרקעות עם תכולת חרסית גבוהה. יעילות המיצוי אינה תלויה בריכוז PBAT בטווח הבדיקה, אך נצפתה יעילות מיצוי נמוכה יותר עבור NPs מאשר עבור MPS. תוצאות כימות PBAT היו דומות לכימות פירוק הפלסטיק על ידי מדידת נשימת קרקע מצטברת במחקר דגירה במעבדה.

שיטות למדידת זיהום MP בקרקע נחוצות כדי להבין את היקף זיהום הפלסטיק בקרקעות גלובליות¹, מקורות זיהום פלסטיק² ופתרונות פוטנציאליים³. קרקעות חקלאיות חשופות באופן ייחודי לזיהום פלסטיק: יותר מ-15 מיליון טון מטרי של פלסטיק משמשים בחקלאות מדי שנה נכון לשנת 2021⁴, כולל 2.5 מיליון טון חיפוי פלסטיק⁵. חיפוי פלסטיק משמש במגע הדוק עם אדמה, מוחל מחדש פעם אחת או יותר בשנה⁶, ויכול להיות קשה להסרה מלאה מהאדמה לאחר חייהם השימושיים⁷. תחום מרכזי אחד שבו יש צורך בשיטות מדידת MP הוא בהערכת מוצרי פלסטיק מתכלים כמו חיפויי פלסטיק מתכלים לשימוש במערכות צמחיות⁸.

מוצרי פלסטיק מתכלים באדמה הם חלופות מבטיחות לפלסטיק חקלאי קונבנציונאלי מכיוון שהם יכולים למנוע זיהום פלסטי של הקרקע על ידי חיפוי פלסטיק אם הם פועלים כמתוכנן. בשנת 2022 יוצרו ברחבי העולם פחות ממיליון טון מטרי של פלסטיק מתכלה, עם צמיחה מהירה צפויה לתעשייה⁹. ארבעת הפולימרים המתכלים הנפוצים ביותר, חומצה פולילקטית (PLA), עמילן פולימר, פוליהידרוקסיאלקנואטים (PHA) ופוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT), כולם משמשים באופן מסחרי או ניסיוני בחיפויי פלסטיק מתכלים חקלאיים¹⁰. למרות הבטחתם, הפירוק של מוצרי פלסטיק מתכלים אלה בתנאי שטח משתנה¹¹. בעוד שכמה מחקרים על פירוק חיפוי פלסטיק מתכלה בשטח התמקדו בשברי מקרופלסטיק¹¹, הערכת הפירוק המוחלט של חומרים פלסטיים דורשת יכולת לשחזר MPS ו-NPs מהאדמה. כימות מיקרופלסטיק מהקרקע חשוב גם כדי להעריך את הפוטנציאל להשפעות שליליות על מערכות אקולוגיות בקרקע מזיהום MP¹².

כמה טכניקות נפוצות לזיהוי וכימות MP כוללות ניתוח חזותי, ספקטרוסקופיה אינפרא אדום מותמרת מיקרו-פורייה (μFTIR), ספקטרוסקופיה מיקרו-רמאן (μRaman), כרומטוגרפיה של גז-ספקטרוסקופיה מסה (GCMS כולל פירוליזה GCMS וספיחת מיצוי תרמי GCMS), וניתוח תרמוגרבימטרי¹³. טכניקות פיתוח אחרות כוללות ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום למדידת MP באתרה בקרקעות¹⁴, מיצוי מתיל אסטריפיקציה של חומצות שומן לניתוח GCMS¹⁵ וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית¹⁶. עד 90% מהמחקרים שכימתו MPS בקרקע השתמשו בניתוח חזותי (לבד או בשילוב עם טכניקות אחרות) כדי לזהות חלקיקי פלסטיק, בעוד ש-77% השתמשו בטכניקות ספקטרוסקופיה FTIR, Raman או GCMS¹⁷. פיתוח והרמוניה של מגוון רחב של טכניקות כימות MP יכול לעזור להרחיב את יכולתה של הקהילה המדעית לענות על שאלות מחקר מיקרופלסטיק מגוונות¹⁸. קיימות שלוש גישות גנריות להכנת דגימות קרקע לכימות מיקרופלסטיק: 1) הפרדת חלקיקי מיקרופלסטיק בודדים ללא שינוי מהקרקע (למשל על ידי הפרדת צפיפות), 2) מיצוי חומר פלסטי או פולימרי שעבר טרנספורמציה (למשל על ידי פירוק), או 3) ניתוח אדמה בתפזורת. גם ספקטרוסקופיה μFTIR וגם μRaman דורשות הפרדה של MPS בודדים מהאדמה לפני שניתן יהיה לזהות אותם כימית¹⁹ בעוד ש-pyro-GCMS עשוי להתבצע על חלקיקי פלסטיק מבודדים המופרדים מאדמה או אדמה בתפזורת²⁰. הפרדת MPS מתכלים מהאדמה יכולה להיות קשה מכיוון שחלק מהעיכול המשמש להסרת חומר אורגני בקרקע יכול לפרק או לשנות כימית פולימרים מתכלים, כולל PBAT²¹. לספקטרוסקופיה של מיקרו-ראמאן ו-μFTIR יש גם מגבלת רזולוציה מרחבית: חלקיקים חייבים להיות גדולים מ-10-20 מיקרומטר עבור μFTIR ו-1 מיקרומטר עבור μRaman (אם ניתן להכין חלקיקים בודדים כה קטנים לניתוח)^19,22. טכניקות אלו יכולות לספק זיהוי כימי של פולימרים MP, וניתן להשתמש בהדמיה ספקטרוסקופית כדי למדוד גודל^{MP 22}. כל סוגי הפירו-GCMS מוגבלים בכך שהדגימות נהרסות במהלך הניתוח.

תמ"ג שימש בהצלחה לאפיון מרכיבי קרקע ומזהמים²³, לכימות MPS 16,24,25,26, ולהערכת הפירוק של PBAT ופולימר אחר, פוליסטירן^27,28. כאשר היא מופעלת תחת פרמטרים כמותיים, ספקטרוסקופיה ^של1 H-NMR מייצרת ספקטרום שבו השטח של כל שיא ספקטרלי עומד ביחס ישר למספר המימנים התורמים בדגימה; זה מאפשר לכמת את המרכיבים המרכיבים במדגם²⁹. תמ"ג היא טכניקה אנליטית רבת ערך לכימות חלק מחברי הפרלמנט, כולל PBAT, בתוך הקרקע מכיוון שהיא מאפשרת כימות וזיהוי בו זמנית, היא מתאימה לתערובות מורכבות וטהורות, ואינה דורשת תקני ייחוס זהים מבחינה כימית^30,31. ספקטרוסקופיה NMR של תמצית ממס יכולה לכמת MPS או NPs קטנים מאלה שניתן לעבד עבור כימות μFTIR, μRaman או GCMS. למרות יתרונות אלה, גישות NMR כמותיות עדיין מספקות רגישויות נמוכות יותר מאשר גישות מבוססות ספקטרוסקופיה מסה הרסנית³².

השיטה המוצעת, המשורטטת באיור 1, מתארת זרימת עבודה לעיבוד וניתוח דגימות קרקע המכילות PBAT - כולל פלסטיק PBAT בגודל ננו. בשיטה מופק פולימר PBAT מדגימות קרקע על ידי ניעור האדמה בתערובת של כלורופורם ומתנול. תמציות הממס המכילות PBAT מיובשות ולאחר מכן מומסות מחדש בכלורופורם דוטראט בתוספת קליברנט פנימי. ספקטרוסקופיה של תמ"ג מתבצעת על התמציות באמצעות פרמטרים כמותיים. הספקטרום המתקבל מנותח כדי לכמת PBAT על ידי השוואת שטח הפסגות המותאמות לאטומי מימן של ה-PBAT ומולקולות הקליברנט. שיטה זו מיישמת את גישת מיצוי הממס וספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית של פרוטון (¹H-NMR) שהודגמה על ידי נלסון ואחרים.33. המטרה הייתה להשתמש בשיטה המתאימה לעיבוד דגימות בקנה מידה סביבתי (~100 גרם אדמה) ולעבד מספר דגימות במקביל ללא ציוד מיצוי מיוחד.

1. איסוף והכנת אדמה

הערה: ציוד דגימה ועיבוד לא אמור להכיל את הפולימר PBAT או מרכיביו כדי למנוע זיהום דגימה. חומרים פולימריים אחרים אינם בהכרח מפריעים לכימות PBAT מהאדמה. לדוגמה, פוליאתילן ופוליפרופילן אינם מייצרים פסגות ספקטרליות בכלורופורם ¹H-NMR המפריעות לכימות של PBAT³⁴, אך פוליאתילן טרפתלט, עם קבוצת הטרפתלט שלו, ככל הנראה יפריע^ל-35, כמו גם פוליאסטרים אחרים. ניתן להשתמש בטקסטים כמו ברנדוליני והילס³⁴ כדי לקבוע את ספקטרום ^{ה-H-NMR של פולימרים}שונים ולסנן פסגות חופפות עם פסגות ה-PBAT המשמשות לכימות (מתואר להלן).

1. אסוף לפחות 100 גרם משקל יבש שווה ערך של אדמה עבור כל דגימה. קבע את גודל דגימת הקרקע על סמך הריכוז הצפוי של פלסטיק על מנת לאסוף דגימה מייצגת ולהומוגניזציה של האדמה לאיסוף תת-דגימה במידת הצורך³⁶.
   הערה: מערכות קרקע הן הטרוגניות מטבען³⁷, וכך גם התפלגויות מזהמים (למשל, MPS) בתוכם³⁸. קיימת גם שונות הקשורה לשיטות המשמשות למדידת ריכוזי מזהמים³⁹. לכן, מומלץ ליצור עיצוב דגימה או עיצוב ניסיוני הכולל דגימות משוכפלות ככלי להערכת אי הוודאות ואיסוף נפחי דגימה מייצגים על סמך ריכוז הפלסטיק⁴⁰. ריכוזי MP בקרקע תועדו כנעים בין קרוב לאפס ל-1 x 10⁷ פריטים לק"ג אדמה, כאשר רוב האתרים מכילים פחות מ-10,000 פריטים לק"ג אדמה⁴¹. נפח יסודי מייצג תיאורטי יכול לנוע בין 23 מ"^ר בריכוז MP של 10 פריטים למ"ר ל-0.02 מ"^ר כאשר ריכוזי MP הם 10,000 פריטים למ"ר³⁶.
   1. כדי להגדיל את שטח הדגימה האפקטיבי מאתר שדה תוך מזעור כמות האדמה שיש לעבד, אסוף אדמה משטח גדול (למשל, 1 מ"^ר), ולאחר מכן השתמש בשיטת הרבעים כדי להומוגניזציה ואיחוד הדגימה (למשל, ל-500 גרם אדמה)³⁶.
   2. בשיטת הרביעון, עורמים אדמה משטח גדול על ברזנט או משטח אחר, מערבבים היטב בעזרת חפירה ואז מחלקים לרבעים. שמור רבע מהדגימה והשליך את שלושת הרבעים האחרים. חזור על תהליך זה עד שהדגימה תהיה בגודל הרצוי.
2. מסננים את האדמה דרך מסננת רשת של 2 מ"מ. נקו לחלוטין את המסננת ותפסו את התבנית בין דגימות אדמה.
3. יבש אדמה באוויר, ולאחר מכן אחסן בשקיות דגימה אטומות. אדמה יבשה עשויה להיות מאוחסנת במצב זה לפני מיצוי PBAT.

2. מיצוי PBAT מקרקעות

זהירות: כלורופורם נדיף ורעיל. אחסן אותו בחושך בזכוכית ענבר, הרחק ממחמצנים. בזמן העבודה איתו, יש ללבוש כפפות מתאימות, מגן עיניים וביגוד מגן. טפל בזה רק במכסה אדים. מתנול הוא דליק, נדיף ורעיל. אחסן מתנול בארון חסין אש. בזמן העבודה עם מתנול, יש ללבוש כפפות מתאימות, הגנה על העיניים וביגוד מגן. טפל במתנול רק במכסה אדים. כלי זכוכית עלולים להישבר ולגרום לפציעה. ללבוש מגן עיניים בעת טיפול בכלי זכוכית. הימנע מלגעת בזכוכית שבורה בידיים חשופות. במקום זאת, נקה זכוכית שבורה עם כפפות עמידות בפני חיתוך, מלקחיים, מטאטא או כלי אחר.

הערה: כלורופורם אינו תואם לרוב הפלסטיק או המתכות. ודא שכל החומרים תואמים (למשל, זכוכית או פוליטטרפלואורואתילן, פלסטיק PTFE).

1. במכסה אדים, הכינו 100 מ"ל של תערובת 90:10 v/v של כלורופורם (טריכלורו-מתאן; CHCl₃) ומתנול (CH₃OH) לכל דגימה שיש לחלץ. לדוגמה, כדי לחלץ מ-5 דגימות, מערבבים 450 מ"ל כלורופורם עם 50 מ"ל מתנול.
2. הוסף 100 גרם אדמה יבשה, 100 מ"ל תמיסת כלורופורם-מתנול ו -20 חרוזי זכוכית לצנצנת מיצוי זכוכית. אטמו היטב צנצנות מיצוי עם מכסים מרופדים ב-PTFE כך שאף אדי ממס לא יוכלו לצאת מהצנצנות.
   הערה: PBAT מסיס מאוד בכלורופורם; נעשה שימוש בתערובת כלורופורם-מתנול מכיוון שמתנול יכול ליצור קשרי מימן עם מומסים, להתחרות במרכיבים מינרליים ואורגניים בקרקע ולהגביר את ההתאוששות של PBAT מהקרקע³³.
3. השתמשו בשולחן שייקר כדי לנער את צנצנות החילוץ למשך 8 שעות ב-200 סל"ד. לאחר הטלטול, הניחו לאדמה בצנצנות החילוץ להתיישב לפחות 4 שעות.
4. יש להפריד את התמצית מהאדמה. במכסה האדים, פתחו את צנצנת המיצוי והעבירו את הנוזל באמצעות פיפט דרך מסנן נייר איכותי בגודל נקבוביות של 11 מיקרומטר לצנצנת זכוכית נקייה עם תווית. רשום את נפח הממס שהוחזר מצנצנת החילוץ. הימנע מהעברת מוצקי אדמה עם התמצית; השאירו כמה מ"ל ממס מאחור במידת הצורך.
   הערה: נייר הסינון נועד להסיר חתיכות גדולות של חומר אורגני מתמיסת הממס.
5. יבש את התמציות על ידי השארתן במכסה האדים עד לאידוי מלא של הממס. פעולה זו עשויה להימשך עד 24 שעות. יבש את האדמה גם במכסה האדים. לאחר שהאדמה יבשה לחלוטין, השליכו אותה.
6. לאחר שהתמציות יבשות, מכסים כל צנצנת דגימה ומאחסנים אותן באזור קריר, חשוך ויבש עד לצורך.

3. אוסף ספקטרום NMR

זהירות: כלורופורם נטול סיכונים מהווה את אותם סיכונים ודורש את אותם אמצעי זהירות כמו כלורופורם פרוטוני שתואר לעיל.

1. הוסף קליברנט^{פנימי 42} לדגימה. השתמש ביתרה כדי לשקול 1.00 מ"ג של 1,4-דימתוקסי בנזן (DMB; C₆H₁₄O) לכל צנצנת דגימה המכילה תמצית מיובשת.
2. השעו מחדש את הדגימה בכלורופורם דוטראט (CDCl₃; trichloro(deutero)methane). במכסה האדים, השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף 500 מיקרוליטר של כלורופורם דוטראט לצנצנת עם תמצית דגימה מיובשת.
3. יש לסגור את הצנצנת ולנער כדי להמיס את התמצית המיובשת על ידי טפיחה עדינה של הצנצנת על יד או ספסל, בערך פי 10 מכל צד. לאחר מכן השתמש בקצה פיפט נקי כדי להעביר את הנוזל לתוך צינור NMR.
4. חזור על שלבים 3.2 ו-3.3 עם 500 מיקרוליטר נוספים של כלורופורם דוטראט, והוסף את החלק השני של הדגימה לאותו צינור NMR כמו הראשון. השטיפה השנייה נועדה להבטיח פירוק מלא והתאוששות של התמצית המיובשת מהמיכל.
5. מכסה את צינור ה-NMR ואחסן אותו למשך 3 ימים לפני איסוף ספקטרום ה-NMR. זמן האחסון המתאים יהיה תלוי בקצב האידוי של הממס מצינור ה-NMR. נתח דגימות זמן קצר לאחר הכנתן עם כלורופורם דוטראט.
6. כדי להעביר צינורות NMR לספקטרומטר, השתמש במחזיק המיועד לתמוך בצינורות הארוכים והעדינים. לאלה יש בדרך כלל תמיכה ליד הבסיס והחלק העליון של הצינור. שמור את הצינורות במצב זקוף במהלך ההובלה.
7. באמצעות ספקטרומטר NMR של 500 מגה-הרץ, אסוף ספקטרום פרוטונים ^{של 1}H עם זווית דופק של 90°²⁹, רוחב דופק של 8 מיקרון³³, זמן עיכוב של 25 שניות (נקבע על ידי ניסוי התאוששות ההיפוך^29,43), 262K נקודות לסריקה, ו-32 סריקות מרוכבות^29,44 מ-12 עד -2 עמודים לדקה למשך זמן ריצה כולל של 25 דקות.
   הערה: השתמשנו בספקטרומטר Bruker Neo 500 מגה-הרץ עם בדיקה מותאמת לפס רחב ודגימה אוטומטית בטמפרטורה מבוקרת של 300 K. ניתן להשתמש בספקטרומטרים דומים אחרים. אם משתמשים במכשיר בעל עוצמת שדה מגנטי שונה, ניתן לחשב את זמן ההשהיה המתאים על סמך זמן ההרפיה T1 עבור PBAT ו-1,4-dimethoxybenzene באמצעות ניסוי התאוששות היפוך^29,43.
8. לאחר הפעלת הדגימה, שמור, העבר או גש לנתונים הספקטרליים לפי הצורך.
   בדוק נתונים ספקטרליים. בדוק שכל שיאי ה-PBAT המשמשים לכימות נפתרים בבירור אם קיימים. השתמש בשיאי PBAT 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6' (4.38 ppm), 3' (4.15 ppm) ו-3 (4.09 ppm) לכימות (פרטים בטבלה 1). השתמש בפסגות DMB A (6.84 ppm) ו-B (3.77 ppm) גם לכימות (פרטים בטבלה 2). שימו לב במיוחד לפסגות 6, 6', 3' ו-3 של PBAT, שנראות קרובות מאוד זו לזו ועשויות לחפוף.
9. אם חלק מהפסגות אינן נפתרות בבירור, יש לדלל את הדגימה. שלב 100 מיקרוליטר של דגימה ו-500 מיקרוליטר של כלורופורם דוטראט בצינור NMR נקי והפעל מחדש את הדגימה תחת אותם פרמטרים שהוגדרו בשלב 3.7.

4. ניתוח ספקטרום NMR לכימות PBAT

הערה: ניתן לבצע ניתוח ספקטרלי בכל עת לאחר האיסוף. ניתוח נתונים באותו יום שבו מיוצרים ספקטרום עדיף כדי להבטיח שהדגימות עדיין זמינות להפעלה חוזרת במקרה של בעיות כלשהן.

1. פתח את קובץ ה-FID שנוצר על ידי הספקטרומטר בתוכנת עיבוד ה-NMR FID (השתמשנו ב-MestreNova מבית MestreLab, אפשרויות אחרות אך קיימות אפשרויות אחרות).
2. החלת הרחבת קו על הספקטרום: בתוכנת עיבוד FID, בחר תבנית עיבוד בתפריט עיבוד, ולאחר מכן נווט למקטע Apodization. בחר מודל מעריכי בגודל של 0.5 הרץ ונקודה ראשונה של 0.5 הרץ.
3. החילו תיקון פאזה אוטומטי בלחיצה על הלחצן Auto Phase Correction בתפריט Processing. החילו תיקון קווי בסיס אוטומטי בלחיצה על הלחצן Auto Baseline Correction בתפריט Processing.
4. השתמש בדה-קונבולוציה של שיא כדי להתאים לפסגות הספקטרליות הנמדדות: בכרטיסייה ניתוח של תוכנת עיבוד הספקטרה, במקטע התאמה, לחץ על כפתור התאמה חדשה . השתמש בסמן כדי ללחוץ על הספקטרום בהזזה של 8.5 עמודים לדקה, ולאחר מכן גרור את הסמן להזזה של 3.0 ושחרר.
5. לחץ על טבלת התאמת קו מתחת לקטע התאמה כדי להציג את כל הפסגות המותאמות.
6. שמור על הפסגות המשמשות לכימות כמתואר בטבלה 1 ובטבלה 2 ומסומנות באיור 2. השתמש ב-PBAT Peaks 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6' (4.38 ppm), 3' (4.15 ppm) ו-3 (4.09 ppm) בכימות (פרטים בטבלה 1), כמו גם בשיאי DMB A (6.84 ppm) ו-B (3.77 ppm). אטומי המימן התואמים לכל שיא המפורט בטבלה 1 ובטבלה 2 מסומנים בתרשימים המבניים באיור 3, כאשר איור 3A מראה את המבנה של שני הדימרים PBAT, איור 3B מראה כיצד מיקום הדימרים בפולימר מקיים אינטראקציה כדי לשנות את שינוי שיא המימן מהמונומר 1,4-בוטנדיול, ואיור 3C המציג את המבנה של DMB.
7. מחק את כל הפסגות האחרות מההתאמה על-ידי בחירת הפסגות הלא רצויות ולחיצה על Delete Peak.
8. השתמש בטבלת ההתאמה כדי להעתיק את השטח של כל פסגה ליישום גיליון אלקטרוני לחישובים (בחרנו להשתמש בגיליון אלקטרוני).
9. להעתקת אזורי שיא לגיליון אלקטרוני, בחר תחילה את כל נתוני השיא בטבלת התאמת הקו. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק מהתפריט הנפתח. הדבק את הנתונים בגיליון האלקטרוני.
10. חשב את מספר השומות של DMB שנוספו לדגימה, n_DMB, באמצעות המשוואה
    
    כאשר m_DMB היא המסה של DMB שנוספה לדגימה בגרמים (מומלץ 1.00 מ"ג) ו-MM_DMB היא המסה המולרית של DMB (138.17 גרם/מול).
11. חשב את מספר השומות של דימר בוטילן טרפתלט של PBAT במדגם, n_BT, באמצעות המשוואה
    
    כאשר A₅ הוא השטח הנמדד של שיא PBAT 5, A_A הוא השטח הנמדד של שיא DMB A, ו - A_B הוא השטח הנמדד של שיא DMB B. יחידות השטח המיוצרות על ידי תוכנת הניתוח הספקטרלי הן שרירותיות.
12. חשב את מספר השומות של דימר בוטילן אדיפט של PBAT במדגם, n_BA, באמצעות המשוואה
    
    כאשר A₃ הוא השטח הנמדד של שיא PBAT 3, A_3' הוא השטח הנמדד של שיא PBAT 3', A₆ הוא השטח הנמדד של שיא PBAT 6, _{ו-A 6'} הוא השטח הנמדד של שיא PBAT 6'. יחידות השטח המיוצרות על ידי תוכנת הניתוח הספקטרלי הן שרירותיות.
13. חשב את המסה של PBAT במדגם, m_{PBAT, משוחזר}, באמצעות המשוואה
    
    כאשר MM_BA היא המסה המולרית של דימר BA מ-PBAT (200 גרם/מול), ו-MM_BT היא המסה המולרית של דימר BT מ-PBAT (220 גרם/מול).
14. אם הייתה כמות ידועה של PBAT במדגם, ניתן לחשב את אחוז ההתאוששות, η, עבור המדגם כמדד ליעילות המיצוי לפי המשוואה
    
15. חשב את ריכוז ה-PBAT במדגם, C_PBAT, באמצעות המשוואה
    
    כאשר m_{אדמה יבשה} היא מסת האדמה היבשה המשמשת לייצור התמצית (0.1 ק"ג),_{ממס V ששוחזר} הוא נפח הממס שהוחזר מהאדמה בשלב 2.4,_{ו-V sovlent נוסף} הוא הכמות הראשונית של ממס שנוספה לדגימת האדמה (100 מ"ל).

5. הכנת עקומת כיול לכימות PBAT מקרקע מסוימת

הערה: עקומת כיול שנוצרה על סמך דגימות קרקע עם כמויות ידועות של PBAT שנוספו תספק מידע שימושי על אופן ההפקה וההתאוששות של PBAT מקרקע מסוימת. המיצוי אינו זהה עבור כל הקרקעות או כל צורות ה-PBAT. אנו חושדים שיעילות המיצוי תלויה בחימר הקרקע ובתכולת החומר האורגני³³, וממליצים ליצור עקומת כיול עבור כל סדרת קרקע ואופק מעניין. ניתן ליצור את עקומת הכיול לפני או אחרי עיבוד דגימות לא ידועות בשיטה זו.

1. אוספים ומכינים שווה ערך ל -2.5 ק"ג אדמה יבשה כמתואר בשלבים 1.1-1.3.
2. קבע את הטווח שיכוסה על ידי עקומת הכיול; הריכוז המרבי של PBAT המשמש בעקומת הכיול צריך להיות גבוה מריכוז ה-PBAT הגבוה ביותר בקרב דגימות לא ידועות.
3. הכן או השג מספיק פלסטיק PBAT ליצירת 5 דגימות דוקרניות של 100 גרם אדמה עם 0%, 25%, 50%, 75% ו-100% מהריכוז המרבי (25 דגימות בסך הכל). לדוגמה, אם 40 מ"ג/ק"ג הוא הריכוז המקסימלי הרצוי, יהיה צורך בסך הכל ב-50 מ"ג PBAT כדי ליצור את הדגימות הדוקרניות.
4. הכינו 25 דגימות של 100 גרם אדמה כל אחת. הגדל את הדגימות על ידי שקילת פלסטיק מבוסס PBAT והוספתו לדגימות קרקע בשיעורים שנקבעו. לדוגמה, אם 40 מ"ג/ק"ג PBAT הוא הריכוז המקסימלי הרצוי, צור 5 דגימות ללא PBAT, 5 דגימות עם 1 מ"ג PBAT, 5 דגימות עם 2 מ"ג PBAT, 5 דגימות עם 3 מ"ג PBAT ו-5 דגימות עם 4 מ"ג PBAT. לאחר הוספת PBAT לאדמה, מערבבים היטב.
5. חלץ PBAT מ-25 הדגימות הדוקרניות, ולאחר מכן אסוף ספקטרום NMR מהתמציות ונתח את הספקטרום המתקבל כמתואר בשלבים 2.1 עד 4.16.
6. זהה את המשוואה של עקומת כיול עבור PBAT בקרקע זו על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית בין כמות ה-PBAT הנמדדת בכל דגימה דוקרנית לבין הכמות בפועל של PBAT שנוספה בכלי ניתוח סטטיסטי. השתמשנו בגיליון אלקטרוני. אם לא מתגלה PBAT בדגימות הדוקרניות ללא תוספת PBAT, אז כוח b = 0 ברגרסיה.
   הערה: מבחן רגרסיה ליניארית מעריך את חוזק הקשר הליניארי בין שני משתנים מספריים רציפים x ו-y, על פי הקשר y = mx + b. הערכים של m ו-b המתאימים ביותר לנתונים מחושבים על ידי הבדיקה. מקדם r² של מבחן הרגרסיה מתאר עד כמה שני המשתנים קשורים זה לזה.
7. בדוק קשר מובהק בין יעילות המיצוי לריכוז PBAT באמצעות כלי הניתוח הסטטיסטי. חשב את יעילות החילוץ של PBAT מהדגימות הדוקרניות כ
   
8. השתמש בכלי הניתוח הסטטיסטי כדי לחשב את ההסתברות שהנתונים הנצפים יכולים להתרחש באופן אקראי ללא מתאם בין יעילות המיצוי לריכוז PBAT. אם ערך p זה גדול מסף המובהקות שנקבע מראש, α, אז הוא לא מצליח לדחות את השערת האפס שאין קשר בין שני המשתנים. אם זה המקרה, ניתן להניח שיעילות המיצוי קבועה עבור כל ריכוזי ה-PBAT בטווח הנבדק. אם השערת האפס נדחית, ייתכן שהמודל הליניארי המתואר כאן לא יהיה הדרך הטובה ביותר למדל את הנתונים.
9. השתמש במשוואת הרגרסיה הליניארית של עקומת הכיול כדי להעריך את כמות ה-PBAT בדגימות לא ידועות שעובדו בשיטה זו. אם משתנה הרגרסיה x היה הכמות בפועל של PBAT בדגימות דוקרניות של עקומת כיול, המשתנה y היה הכמות הנמדדת של PBAT, ו-b הוגדר ל-0, אז
   
   הערה: ניתן להשתמש בתכולת ה-PBAT של דגימות משוכפלות המוערכות באמצעות משוואת עקומת כיול כדי ליצור מרווח סמך עבור כמות ה-PBAT בקרקע מסוימת, או אם ניתן לחשב ממוצע ומרווח סמך עבור ריכוזי ה-PBAT בתמציות משוכפלות, ניתן ליישם את עקומת הכיול כדי להעריך את ריכוז ה-PBAT באדמה. כל אחד מסדר הפעולות מייצר את אותו מרווח בר-סמך לתכולת PBAT באדמה. לדוגמה, שקול תמציות מ-10 דגימות משוכפלות בעלות ריכוזי PBAT של 10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 ו-5 מ"ג/ק"ג ואת משוואת עקומת הכיול y _{(PBAT נמדד בתמצית)} = 0.75 x _{(PBAT אמיתי באדמה).} ניתן להעריך את ריכוזי PBAT בקרקע בכל שכפול כ-13, 7, 3, 5, 13, 15, 3, 8, 11 ו-7 מ"ג/ק"ג. אז ריכוז ה-PBAT הממוצע בקרקע יוערך כ-8.4 מ"ג/ק"ג עם סטיית תקן של 4.4 מ"ג/ק"ג. אם מחושבים תחילה ממוצע וסטיית תקן עבור ריכוזי PBAT של תמצית (10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 ו-5), יחושב ממוצע של 6.3 מ"ג/ק"ג וסטיית תקן של 3.3 מ"ג/ק"ג. לאחר מכן, ניתן ליישם את עקומת הכיול הן על ממוצע והן על סטיית תקן כדי להעריך את ריכוז ה-PBAT בקרקע: ממוצע של 8.4 מ"ג/ק"ג, סטיית תקן של 4.4 מ"ג/ק"ג.

כדי להעריך את היעילות של שיטה זו בכימות פולימר PBAT מהאדמה, נבנו עקומות כיול על ידי חילוץ PBAT מדגימות דוקרניות שנוצרו משלוש קרקעות שונות. עבור כל אחת משלוש הקרקעות (פרטים בטבלה 3), האדמה הועברה דרך מסננת של 2 מ"מ ולאחר מכן יובשה באוויר. דגימות דוקרניות נוצרו על ידי הוספת 0, 9, 18, 27 או 36 מ"ג של MP מבוסס PBAT ל-100 גרם אדמה יבשה (5 שכפולים של כל אחד). זה שווה ערך ל-0, 63, 126, 189 או 252 מ"ג/ק"ג של פולימר PBAT. MPS היו עשויים מחיפוי פלסטיק עם 70% PBAT במסה ועובי 50 מיקרומטר על פי הליך הטחינה המתואר ב-Astner et ^al.45 והיו קטנים מ-840 מיקרומטר. כדי ליצור כל עקומת כיול, PBAT חולץ מכל דגימה דוקרנית בהתאם להליך שהוגדר לעיל. לאחר מכן הושוותה ההתאוששות של PBAT לכמות ה-PBAT שנוספה לכל דגימה. שיעור ההתאוששות והכימות של PBAT נבדקו גם עבור NPs (קוטר ממוצע 780 ננומטר, אינדקס פוליפיזור 0.77, הוכן על פי Astner et ^al.45) בקרקע אחת (טיט מוצל).

עבור כל הקרקעות, לא זוהה PBAT בדגימות ללא תוספת PBAT, כלומר, לא נצפו תוצאות חיוביות כוזבות בשיטה זו. איור משלים 1 מציג ספקטרום שנאסף מאדמת טיט מוצלת שלא הכילה PBAT (ואכן הכילה DMB שנוסף במהלך תהליך ההכנה). שתי הפסגות האופייניות מהקליברנט הפנימי DMB קיימות, אך פסגות אופייניות ל-PBAT אינן קיימות. עבור קרקעות עם תוספת PBAT, היו קיימות חמש הפסגות האופייניות המשמשות לזיהוי PBAT. איור 2 מציג ספקטרום שנאסף מאדמת טיט מוצלת עם תוספת של 63 מ"ג/ק"ג של PBAT. כל שיאי ה-PBAT וה-DMB המשמשים לכימות נפתרים בבירור. איור משלים 2 מציג את האזור המותאם של הספקטרום המוצג באיור 2 עם פסגות משולבות מעל. בגלל החפיפה של פסגות 3, 3', 6 ו-6' עם אותות אחרים בספקטרום, חשוב לחשב את תכולת ה-PBAT על סמך האינטגרלים של פסגות מותאמות ולא על אינטגרלי שיא פשוטים. זה מסיר את השטח שנתרם על ידי מרכיבים אחרים של תמצית הקרקע ומשיאי PBAT חופפים. איור משלים 3 מציג את השפעות הדילול על הרזולוציה הספקטרלית של NMR. האיור מציג ספקטרום שנאסף מטיט חולי של אלקהורן עם תוספת של 252 מ"ג/ק"ג של PBAT. בפאנל A, לא ניתן לפתור את שיאי ה-PBAT של 3, 3', 6 ו-6' בטווח של 4.5 - 4.0 עמודים לדקה. איור משלים 3B מציג ספקטרום שנאסף מאותה דגימה לאחר שדולל ב-1:5 עם כלורופורם דוטראט נוסף. לאחר הדילול, ארבע הפסגות נבדלות, והאזור שלהן יכול להיות מתאים.

עקומות הכיול השתנו בין שלוש הקרקעות שבדקנו. איור 4 מציג את ריכוזי ה-PBAT המשוערים של כל קרקע בהתבסס על ה-PBAT שנמדד (C_PBAT,m) בכל תמצית בהשוואה לכמות ה-PBAT בפועל (C_PBAT,a) שנוספה לאדמה. כמות ה-PBAT שהתאוששה מקרקעות טיט מוצלות הייתה בקורלציה חזקה עם כמות ה-PBAT שנוספה (r² = 0.99). עבור משוואת עקומת הכיול C_{PBAT, m} = m*C_{PBAT, a}, m = 0.76 ± 0.02 (ממוצע ± שגיאת תקן אחת), ו-m היה שונה משמעותית מאפס (df = 24; F = 2000; עמ' < 1*^10-16). PBAT התאושש ביעילות של η = 76% ± 10% (ממוצע ± סטיית תקן אחת) מקרקע זו. יעילות השאיבה מהקרקע המוצלת לא נמצאה בקורלציה עם כמות ה-PBAT בדגימות (r² = 0.009; p = 0.7). NP התאושש ביעילות של η = 59% ± 8% (ממוצע ± סטיית תקן אחת). איור 5 מציג את יעילות החילוץ של חברי פרלמנט ו-NPs מהטיט המוצל; היעילות הייתה נמוכה משמעותית עבור NP (p = 0.0002). כמות ה-PBAT שהתאוששה מהטיט של לוס אוסוס הייתה בקורלציה פחות חזקה עם כמות ה-PBAT שנוספה (r² = 0.85) מאשר באדמה המוצלת. עבור משוואת עקומת הכיול C_PBAT,m = m*C_PBAT,a, m = 0.57 ± 0.05 (ממוצע ± שגיאת תקן אחת), ו-m היה שונה משמעותית מאפס (df = 23; F = 100; p = 8*^10-11). PBAT התאושש ביעילות של η = 57% ± 22% (ממוצע ± סטיית תקן אחת) מקרקע זו. יעילות המיצוי באדמת לוס אוסוס לא נמצאה בקורלציה עם כמות ה-PBAT בדגימות (r² = 0.01; p = 0.6). כמות ה-PBAT שהתאוששה מהטיט החולי של אלקהורן הייתה בקורלציה חזקה עם כמות ה-PBAT שנוספה (r² = 0.88). עבור משוואת עקומת הכיול C_{PBAT, m} = m*C_{PBAT, a}, m = 0.70 ± 0.05 (ממוצע ± שגיאת תקן אחת), ו-m היה שונה משמעותית מאפס (df = 23; F = 200; p = 5*^10-12). PBAT הוחזר ביעילות של η = 70% ± 14% (ממוצע ± סטיית תקן אחת) מקרקע זו. יעילות המיצוי לא נמצאה בקורלציה עם כמות ה-PBAT בדגימות (r² = 0.006; p = 0.7) עבור אדמת אלקהורן.

יתר על כן, שיטה זו יושמה כדי לכמת את ה-PBAT בקרקע מסדרת אלקהורן. בניסוי זה, אדמת אלקהורן נאספה משני אתרים בתוך שדה חקלאי, סוננה דרך מסננת של 2 מ"מ, ולאחר מכן יובשה באוויר. האדמה עורבבה עם חיפויי MPS מבוססי PBAT (נוצרו כמתואר לעיל, קוטר < 840 מיקרומטר), עם 50 מ"ג MPS ו-150 גרם אדמה יבשה בכל מזוקוסמוס (250 מ"ג/ק"ג PBAT) ליצירת 5 מזוקוסמוס עם MPS מעורבבים באדמה מאתר A ו-5 עם MPS מעורבבים באדמה מאתר B (10 בסך הכל). חמישה מזוקוסמוסים המורכבים מאדמה מכל אתר ללא תוספת MPS שימשו כבקרה שלילית (10 בסך הכל). מזוקוסמוס הודגר במשך 6 חודשים כדי לחקור את הפירוק הביולוגי של חברי הפרלמנט המבוססים על PBAT. במהלך הדגירה, נשימת הקרקע המצטברת נמדדה באמצעות ריכוזי CO₂ (באמצעות מנתח גז אינפרא אדום) ושימשה לכימות פירוק PBAT. כמות הפלסטיק שנותרה במזוקוסמוס בסוף הדגירה חושבה כ

C_{Frac מפלסטיק, סופי} = [m_{פלסטיק, i} / C_{פלסטיק frac} - (C_{CO2, פלסטיק נוסף} - C_{CO2 ללא פלסטיק}) *_{m אדמה יבשה}]/(m_{פלסטיק, i}/C_{פלסטיק frac})

כאשר m_{אדמה יבשה} היא כמות האדמה בכל צנצנת דגירה, C_{frac פלסטיק} הוא תכולת הפחמן של המיקרופלסטיק המוסף, C_{CO2, פלסטיק נוסף} הוא הכמות המצטברת של CO₂ המיוצר במזוקוסמוס עם פלסטיק נוסף לגרם אדמה יבשה, C_{CO2 ללא פלסטיק} הוא כמות ה-CO_{2 המיוצר} במזוקוסמוס ללא תוספת פלסטיק לגרם אדמה יבשה, _{ו-m פלסטיק, i} היא המסה הראשונית של הפלסטיק שנוסף.

השתמשנו באתחול כדי להעריך מרווחי סמך עבור פלסטיק שנותר בקרקעות A ו-B על ידי חישוב פלסטיק שנותר עם 10,000 תת-דגימות תיאורטיות של זיווגים אקראיים של 10 המזוקוסמוס הניסיוני מכל אתר. באתר A, ממוצע הפלסטיק המשוער שנותר מנתוני הנשימה היה 86%, עם טווח רווח בר-סמך של 95% בין 62 ל->100%. באתר B, ממוצע הפלסטיק המשוער שנותר היה 98%, עם טווח רווח בר-סמך של 95% בין 79 ל->100%. בתום 6 החודשים, תכולת PBAT נמדדה גם על ידי שיטת המיצוי והכימות של NMR המתוארת בכתב יד זה (n = 5 עבור אתר A ו- n = 4 עבור אתר B). באתר A, ממוצע הפלסטיק המשוער שנותר מנתוני NMR היה 79%, עם רווח בר-סמך של 95% (ממוצע ± 1.96xSE) שנע בין 71% ל-87%. באתר B, ממוצע הפלסטיק המשוער שנותר היה 88%, עם טווח רווח בר-סמך של 95% בין 71% ל-100%. איור 6 מציג את מרווחי הסמך עבור תכולת הפלסטיק של האדמה משני האתרים המוערכים על ידי שתי השיטות השונות. הערכות תכולת הפלסטיק משתי השיטות נראות עקביות הדדית בהתבסס על החלק הגדול של החפיפה בין כל זוג מרווחי סמך.

איור 1: סקירה ויזואלית של הליך המיצוי והכימות של פוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ¹ספקטרום H-NMR שנאסף בממס כלורופורם דוטראט עם ספקטרומטר MHz 500 על תמצית מאדמת טיט מוצלת עם MPS פוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT). 1,4-Dimethoxybenzene (DMB) נוסף לתמצית כקליברנט פנימי לפני ניתוח NMR. גם פסגות אופייניות של PBAT וגם DMB קיימות בספקטרום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מבנים של פוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT) ו-1,4-דימתוקסי בנזן (DMB) עם פרוטונים מסומנים. המבנים המתאימים מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2. (A) מבנה של יחידת BA-BT אחת של PBAT. (B) המבנה של שלישיות T-B-T, T-B-A ו-A-B-A מ-PBAT. (ג) מבנה ה-DMB. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ריכוזי PBAT שנמדדו על ידי ¹H-QNMR בתמציות בממס כלורופורם דוטראט מאדמת טיט מוצלת, טיט לוס אוסוס וטיט חולי אלקהורן המכיל כמויות ידועות של PBAT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: יעילות מיצוי של PBAT MPS ו-NPs מדגימות דוקרניות באדמת טיט מוצלת. התאוששות PBAT נמוכה משמעותית עבור NPs (p = 0.0002). הקו האמצעי של כל תיבה מייצג את הממוצע של נקודות הנתונים הנמדדות, בעוד שהגבולות העליונים והתחתונים של התיבה משקפים Q3 ו-Q1, בהתאמה. הגבולות העליונים והתחתונים של השפם משקפים את נקודות הנתונים המקסימליות והמינימליות, בהתאמה. נקודות נתונים בודדות מוצגות בתוך הקופסה והשפם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תכולת הפלסטיק של שתי קרקעות אלקהורן נמדדה על ידי נשימת דגירה מצטברת ועל ידי מיצוי ממס בשילוב עם NMR. עבור תכולת פלסטיק הנמדדת על ידי נשימה, הסורגים מייצגים מרווח בר-סמך של 95%. עבור תכולת פלסטיק הנמדדת על ידי NMR, הפסים מייצגים רווח בר-סמך של 95% המבוסס על פי שניים משגיאת התקן מעל ומתחת להערכה הממוצעת (n = 5 עבור אתר a ו- n = 4 עבור אתר b). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ¹שיאים ספקטרליים של H-NMR של פוליבוטילן אדיפט טרפתלט (PBAT) בממס כלורופורם דוטראט. המימנים המיוחסים לכל שיא מסומנים באיור 3. הקצאות השיא מבוססות על Herrera et ^al.27.

טבלה 2: ¹שיאי H-NMR של 1,4-דימתוקסי בנזן (DMB) בממס כלורופורם דוטראט. המימנים המיוחסים לכל שיא מסומנים באיור 3B. הקצאות השיא מבוססות על Nelson et ^al.33.

טבלה 3: מאפיינים של שלוש הקרקעות ששימשו להדגמת שיטת מיצוי PBAT.

איור משלים 1: ספקטרום ^{H-NMR 1}שנאסף בממס כלורופורם דוטראט עם ספקטרומטר של 500 מגה-הרץ על תמצית של טיט מוצל ללא פולימר PBAT. פסגות אופייניות ל-PBAT אינן קיימות, בעוד ששיאי DMB (שנוספו כקליברנט פנימי) כן. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: אזור מותאם של ספקטרום ¹H-NMR כפי שמוצג באיור 4. הספקטרום נאסף בממס כלורופורם דוטראט. הרקע הירוק מראה את אזור הספקטרום שהיה מתאים. קווים סגולים מציגים את הפסגות המותאמות ואילו קווים אדומים מראים את השגיאה (חלקים מאותות הספקטרום אינם כלולים בפסגות מותאמות). פסגות PBAT 5, 6, 6', 3' ו-3 כלולות בהתאמה יחד עם פסגות DMB A ו-B. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: ^{ספקטרום H-NMR 1}בממס כלורופורם דוטראט שנאסף עם ספקטרומטר של 500 מגה-הרץ על תמצית של טיט חולי אלקהורן עם חברי פרלמנט PBAT. גם פסגות אופייניות של PBAT וגם DMB קיימות בספקטרום. (A) לא ניתן להבחין בשיאי PBAT כדי לכמת את הפולימר. אם תמציות דגימה מייצרות ספקטרום כזה, יש לדלל את הדגימה ולאחר מכן להשתמש בה כדי לאסוף ספקטרום חדש ^{של 1}H-NMR. (B) אותה תמצית מדוללת כך שכל הפסגות הספקטרליות נפתרות בבירור. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

אנו מציעים שיטה למיצוי ממס של PBAT מהאדמה יחד עם ¹H-NMR כדי לכמת PBAT בתמצית. מרכיבי המפתח של תהליך המיצוי כוללים את טכניקת המיצוי והציוד, הממס המשמש למיצוי ודרישות הזמן. בחרנו להשתמש בטכניקת מיצוי הדורשת ציוד פשוט וזול יחסית (צנצנות זכוכית, חרוזי זכוכית ושולחן שייקר) בהשוואה למיצוי סוקסלט ומיצוי ממס מואץ (ASE) שהודגמו על ידי נלסון ^{ואחרים.33}. המטרה של שיטה זו היא שניתן יהיה לחלץ דגימות רבות במקביל למהירות בעיבוד דגימות קרקע בתפזורת. יתרון נוסף של מיצוי ניעור ממס פשוט הוא שניתן להכיל כמויות גדולות יותר של אדמה בהשוואה לגישות Soxhlet או ASE, מה שמאפשר עיבוד קל יותר של דגימות מייצגות סביבה^13,36. בחרנו את תמיסת הממס כלורופורם-מתנול על סמך התוצאות המוצלחות שהוצגו על ידי נלסון ואחרים.33 והזמינות של כלורופורם דוטראט כממס ¹H-NMR. בדקנו אולטרה-סאונד של תערובות ממס-מטריצה המתאימות לפרוטוקול המתואר ב-Nelson et ^al.33 בהשוואה לשיטת ניעור הממס הפשוטה ולא מצאנו הבדל משמעותי בשיעורי ההתאוששות של PBAT בין שתי השיטות. מצאנו ש-8 שעות של טלטול ב-200 סל"ד הספיקו כדי לשבור אגרגטים של אדמה ב-100 גרם של מטריצת אדמה עבור שלוש הקרקעות שבדקנו, בעוד שזמני טלטול קצרים יותר או מהירויות רעידה נמוכות יותר לא היו מספיקים. לאחר מכן נדרשה שקיעה כדי להחזיר ממס ללא חלקיקי אדמה. התאוששות PBAT נבדקה עם פלסטיק בגודל ננו, וההתאוששות הייתה נמוכה משמעותית מזו של חברי פרלמנט. משמעות הדבר היא שהשיטה עשויה להזדקק לפיתוח נוסף כדי לכמת במדויק דגימות סביבתיות של NPs לא ידועים, אך שחזור חלקי ומדידה של NPs עדיין בעלי ערך בהשוואה לשיטות אחרות מוגבלות בגודל, למרות שלא ניתן להשיג מידע על גודל החלקיקים בשיטה זו.

בעוד שנלסון ואחרים ³³ דיווחו על יעילות מיצוי קרובה ל-100% עבור שיטת מיצוי אולטרסאונד, מצאנו שאולטרסאונד ושיטת המיצוי מבוססת השייקר המתוארת כאן הובילו שניהם ליעילות מיצוי נמוכה משמעותית מ-100%. אנו מאמינים שזה עשוי לנבוע מהשפעות של בליה סביבתית, כולל פוטו-חמצון על חיפוי הפלסטיק. נלסון ואחרים ^הבחינו ביעילות מיצוי מופחתת משמעותית עבור MPS PBAT מוקרני UV בהשוואה לחומר שאינו בליה. הפלסטיק שהשתמשנו בו כדי לבחון את שיטת הכימות הזו עבר בליה בשדה באור השמש במשך עונת גידול שלמה לפני שעובד לחברי פרלמנט. למרות מייצבי הפוטו שנוספו ליריעות חיפוי פלסטיק מסחריות, מבנה הפולימר של החיפוי משתנה עקב קרינת UV (למשל, קישור צולב בשרשרת המגדיל את תכולת הג'ל של החומר)⁴⁶ בתנאי בליה סביבתיים ופירוק הפולימר יכול לשנות את ספקטרום התמ"ג שלו⁴⁷. זה עשוי לתרום לשיעורי ההתאוששות הנמוכים יותר של PBAT שראינו בהשוואה לנלסון ^{ואחרים.33}. מצאנו גם שיעילות מיצוי PBAT השתנתה בין שלוש הקרקעות שבדקנו. האדמה המוצלת מכילה בעיקר חרסיות בעלות פעילות נמוכה, בעוד שבשתי הקרקעות האחרות יש חרסיות סמקטיטיות (לוס אוסוס) ומעורבות וסופר-אקטיביות (אלקהורן). ייתכן שנוכחות של פעילות גבוהה ומינרלים חרסיתיים של 2:1 עיכבה את מיצוי הממס של PBAT מקרקעות אלה^33,48 מה שהוביל להתאוששות הנמוכה יותר של PBAT שראינו. אנו ממליצים על מחקר נוסף החוקר קשרי פלסטיק-מינרלים בקרקע עבור MPs ו-NPs מתכלים, כולל PBAT, כמו גם MPS ו-NPs פולימרים קונבנציונליים שאינם מתכלים. זה חשוב גם כדי להבין כיצד ניתן להפיק ולמדוד פולימרים MP מהאדמה, וגם כדי להבין כיצד הם עשויים להתפרק ביולוגית או להשפיע על מערכות אדמה.

מרכיבי המפתח בתהליך רכישת ספקטרום ה-NMR כוללים את חוזק המגנט של המכשיר, מספר הסריקות בשימוש, זמן הרפיית הדגימה בין הסריקות וזמן המדידה הכולל לכל דגימה. השתמשנו בספקטרומטר של 500 מגה-הרץ; עוצמות שדה מגנטי גבוהות יותר מספקות רגישות ורזולוציה גבוהות יותר בספקטרום NMR. ניתן להגדיל את יחס האות לרעש הספקטרלי על ידי איסוף סריקות חוזרות ונשנות של אותה דגימה והוספתן יחד. איסוף n סריקות יגדיל את יחס האות לרעש בפקטור של √n אך יגדיל את זמן המדידה בפקטור של n²⁹. המשמעות היא שאם יש צורך ביחס אות לרעש גבוה יותר כדי לכמת PBAT בדגימה, ניתן להגדיל את מספר הסריקות במחיר של זמני ריצה ארוכים יותר של הדגימה. יש צורך ביחס אות לרעש של 150 עבור אות מסוים כדי לשמור על שגיאה <1% בכימות⁴⁴. על פי פרמטרי הרכישה שלנו (מכשיר, בדיקה, מספר סריקות), היה צורך בסביבות 5 מ"ג PBAT לדגימה (או 50 מיקרוגרם PBAT למ"ל תמצית) כדי להשיג יחס אות לרעש של 150 ובכך שגיאה של <1% בכימות; ריכוז זה הוא ספציפי למערך איסוף הנתונים שלנו. ריכוז PBAT זה גבוה מגבולות הכימות שהושגו על ידי אחרים המשתמשים ^ב-1H-NMR כדי לכמת סוגים אחרים של MPS בהיעדר קרקע^16,24, מה שמדגים את ההשפעה של חומר אורגני בקרקע ותרכובות אחרות שחולצו במשותף על שיטת הכמות. הטווח הניתן לכימות של PBAT מוגבל גם בקצה העליון בגלל התרחבות הקו שנראית בריכוזי PBAT הגדולים מ-25 מ"ג לדגימה (250 מיקרוגרם PBAT למ"ל תמצית), מה שהוביל לחפיפת שיא PBAT כמתואר בתוצאות המייצגות ומוצג באיור משלים 3. עם זאת, שיטה זו מאפשרת גמישות בתגובה למגבלות אלו על מנת להבטיח שהדגימות ניתנות לכימות. ניתן להגדיל או להקטין את כמות האדמה המשמשת ליצירת תמציות וניתן לדלל ולנתח מחדש את התמציות כדי להתאים את ריכוז ה-PBAT לטווח האופטימלי.

מרכיבי המפתח בתהליך לכימות PBAT על סמך ספקטרום NMR כוללים את הפסגות המשמשות לכימות PBAT, השימוש בהתאמת קו לחישוב אזורי שיא ועקומת הכיול. מבחינה רעיונית, ניתן להשוות כל זוג של פסגות PBAT ו-DMB כדי לחשב את היחס בין שתי התרכובות במדגם. מצאנו את התוצאות המדויקות ביותר כאשר חישבנו את יחס BT: DMB כממוצע של אזורי השיא של 5: A ואזורי השיא של 5:B (מנורמל על ידי מספר הפרוטונים שלהם). שיא PBAT 5 מספק רק כימות של מונומר 1,4-בוטנדיול-טרפתלט (BT), כך שהשטח של 3 ו-3' פסגות (המייצג את המונומר 1,4-בוטנדיול-אדיפט, או BA) הושווה לשטח של 6 ו-6' פסגות (המייצגות את מונומר BT) כדי לכמת את קבוצות ה-BA הקיימות במדגם. סכום ה-BT וה-BA נוספו יחד כדי לייצג את הסכום הכולל של ה-PBAT שנותר. לא ניתן היה להשתמש בשיא PBAT 1 או 2 בכימות BA עקב הפרעה של תרכובות מיצוי משותף (המשוערות כחומר אורגני בקרקע), שיצרו מספר פסגות רחבות בטווח של 2.7-0.7 ppm חקרנו את הסרת האותות הלא רצויים הללו מהספקטרום עם תיקון רקע (כלומר, הפחתת ספקטרום ריק מכל ספקטרום דגימה), אך מצאנו שיצירת ספקטרום רקע ודגימה מקבילים ללא שימוש בקליברנט אינה אמינה. התאמת קו שימשה לחישוב שטח הפסגות המותאמות במקום לשלב את הפסגות הספקטרליות ישירות. בשל החפיפה בין פסגות PBAT 3 ו-3' ובין 6 ל-6', זה סיפק הערכות מדויקות יותר של תכולת PBAT על סמך ניתוח ראשוני. אנו ממליצים ליצור עקומת כיול כדי לקחת בחשבון שיעורי התאוששות משתנים של PBAT מקרקעות שונות. שיעורי ההתאוששות של PBAT היו שונים באופן משמעותי עבור זוג אחד, מתוך שלוש הקרקעות שבדקנו, כפי שעולה ממרווחי הסמך הלא חופפים של 95% עבור שיפוע עקומת הכיול. התאוששות PBAT בקרקע שלישית לא הייתה שונה באופן משמעותי מאף אחת מהשתיים האחרות. בהיעדר הבנה מכניסטית של האופן שבו הרכב הקרקע משפיע על התאוששות PBAT, אנו ממליצים ליצור עקומות כיול כדי להעריך את התאוששות PBAT בכל סדרת קרקע מעניינת ועבור כל אופק בתוך פרופיל קרקע. אם נמצא כי עקומות הכיול דומות סטטיסטית בין קרקעות, ניתן לנתח בקלות את הקרקעות בשילוב.

אנו מאמינים ששיטה זו יכולה לספק כלי רב ערך למעוניינים לכמת PBAT MPS ו-NPs בקרקע, במיוחד לכימות PBAT במספר רב של דגימות שנאספו בקרקעות דומות, למשל, במחקר שדה ארוך טווח של פירוק ביולוגי של פלסטיק. שיטת NMR לכימות חברי פרלמנט מהקרקע היא בעלת ערך מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים בעלי גישה ומומחיות בתמ"ג לתרום לעמידה בצרכים של התחום המתפתח על ידי מענה על שאלות חשובות לגבי נוכחותם והתנהגותם של חברי פרלמנט במערכות קרקע. בעוד שגישה למכשור ומומחיות תהיה ככל הנראה חלק מהדאגות המעשיות הראשונות המגבילות את בחירת החוקרים בטכניקות כמות, NMR אינו הכלי היעיל או המתאים ביותר לכימות מיקרופלסטיק מהקרקע בכל התנאים. לא ניתן לקבל מידע על צורת וגודל החלקיקים בטכניקת מיצוי ממס; אם הצורה והגודל של MP מעניינים, החוקרים יקבלו שירות טוב יותר על ידי טכניקה לזיהוי חלקיקי MP בודדים כמו FTIR או ספקטרוסקופיה של ראמאן. יתרון אחד של שיטות מיצוי ממס כמו אלה שהוצגו כאן וב-Nelson et ^al.33 בהשוואה לגישות כימות MP אחרות כמו FTIR, או ספקטרוסקופיה של ראמאן הוא שמבחינה רעיונית אין מגבלת גודל ל-MPS ו-NPs שניתן לכמת; מיצוי ממס עשוי להיות מועיל ביותר כאשר אין צורך במידע על גודל החלקיקים או כאשר קשה מדי להפריד חלקיקים מעניינים באמצעים אחרים. פירוליזה GCMS עשויה להיות בעלת ערך מכיוון שיש לה רגישות גבוהה יותר מ-NMR, אך התוצאות כפופות גם להשפעות מטריצה כפי שסביר להניח שמיצוי ממס PBAT.

אנו מקווים שעבודה נוספת תשפר את החוסן של שיטה זו על ידי התייחסות למרכיבי הקרקע המשותפים המפריעים לרזולוציה השיא של PBAT בספקטרום ה-NMR. נדרשת גם עבודה נוספת כדי לבסס את הקשר בין בליה פלסטית PBAT ויעילות מיצוי באמצעות שיטה זו, אולי מלווה בהבנה מפורטת יותר של תוצרי פירוק PBAT וספקטרום ¹H-NMR שלהם. בהתבסס על התוצאות שלנו ושל Nelson et ^al.33, הליך כימות זה מתפקד בצורה הטובה ביותר לכימות פלסטיק PBAT לא בליה בקרקעות עם חומר אורגני נמוך וללא חרסיות בעלות פעילות גבוהה. בעוד שהשתמשנו בשיטה זו רק כדי לכמת MPS מבוססי PBAT מהאדמה, מיצוי הממס ^והליךכימות 1 H-NMR יכולים להיות שימושיים לכימות MPS ו-NPs אחרים מקרקעות נוספות^26,49. הרחבת השיטה ל-MPS העשויים מפולימר אחר מחייבת הבטחת מסיסות הפולימר בממס וזיהוי שיאי NMR אופייניים מהפולימר בממס הנבחר. ייתכן שיהיה צורך לבחור קליברנט פנימי חדש המסיס בממס הנבחר ואשר אינו מייצר פסגות החופפות לאלו של הפולימר המעניין⁴².

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודה ל-USDA-NIFA על מימון פרויקט זה באמצעות פרס מספר 2020-67019-31167 ל-SMS ולתוכנית יוזמות המחקר לתכנון אסטרטגי של אוניברסיטת טנסי (SPRINT) למענק פנימי DGH ו-SMS. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים, הניתוח, הפרשנות, כתיבת הדו"ח או ההחלטה להגיש את המאמר לפרסום.