פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)_35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג'ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.

M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג'ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ"ג/מ"ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115⁺) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG_35-55) המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4⁺ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם¹. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג'ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4⁺ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE² ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינציה בחומר הלבן ההיקפי והתאוששות מופחתת לאחר שיא המחלה¹.

MOG-EAE מושרה על ידי חיסון עכברים רגישים עם הפפטיד MOG_35-55 באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA), ואחריו הזרקה תוך צפקית של רעלן שעלת. זה מגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח ומאפשר לתאי T ספציפיים למיאלין המופעלים בפריפריה להגיע למערכת העצבים המרכזית (CNS), שם הם יופעלו מחדש³. CFA ממלא תפקיד מפתח בהשראת EAE על ידי שיפור ספיגת האנטיגן על ידי תאים מציגי אנטיגן וביטוי ציטוקינים הקשורים לתגובות הומור ותאיות⁴. מנגנון זה נובע בעיקר מנוכחות של Mycobacterium tuberculosis מומת בשמן, שמרכיביו מספקים גירוי חזק למערכת החיסונית⁵. למעשה, השראת EAE קשורה ישירות לכמות המיקובקטריום הקיימת במהלך האתגר האנטיגני⁶.

התוספת של מיקובקטריה מומתת אחרת, כגון Mycobacterium butyricum, לאדג'ובנט⁷ של פרוינד, כמו גם ההשפעה של שילובים אדג'ובנטיים⁸, יכולה לווסת את המהלך הקליני של EAE וכתוצאה מכך להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות. תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), הסוכן האטיולוגי של מחלת ג'ון במעלי גירה, נקשר להפרעות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית 9 האנושית^{, שכן} מרכיביו האנטיגניים מסוגלים לעורר תגובה הומוריסטית ותאית חזקה בחולים עם טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה⁹. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מראים שיטה חלופית וניתנת לשחזור להשראת MOG-EAE על ידי החלפת M. tuberculosis ב- CFA ב- M. paratuberculosis.

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו (אישור מספר 290238) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לניסויים בבעלי חיים.

1. הערות כלליות על הניסוי

1. אחסן את העכברים בכלובים נפרדים במתקן בעלי החיים בתנאים מבוקרים, נטולי פתוגנים ב 23 ° C ± 2 ° C עם 50% ± 10% לחות, ומחזור אור / חושך של 12 שעות עם גישה אד libitum למזון ומים.
2. הזריקו לעכברים מלח חוצץ פוספט (PBS) ללא אנטיגן ו-CFA, והשתמשו בהם כבקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה.

2. הכנת אנטיגנים מיקובקטריאליים

1. לגדל את זן M. paratuberculosis K-10 במדיום נוזלי מידלברוק 7H9 מועשר ב-10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז), 0.005% טווין 80 ו-2 מ"ג/ליטר מיקובקטין J למשך שבועיים בצלוחיות תרבית רקמה T25 ב-37°C. להעריך את צמיחת המושבה באופן קבוע על ידי בדיקה חזותית.
   התראה: יש לטפל ב-M. paratuberculosis במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).
2. לגדל את תרבית ההעשרה 500 מ"ל בקבוק Erlenmeyer עם תרחיף של 1.7 × 10⁵ יחידות יוצרות מושבה (CFU) / מ"ל בנפח סופי של 200 מ"ל (אותו מדיום כמו שלב 2.1) באינקובטור רועד למשך שבוע אחד.
   הערה: מכיוון שאורגניזמים מזהמים עלולים להשפיע על התוצאות, יש לחסן את החיידקים על מדיה מוצקה Middlebrook 7H10 כדי לקבוע מורפולוגיית מושבה ולאמת טוהר על ידי ערכות זיהוי תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR) עבור M. paratuberculosis.
3. נטרלו את המתלים החיידקיים למשך 5-10 דקות ב-70°C ואת הצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות. שטפו את הגלולה הנשקלת ב-PBS פעמיים, שיבשו על ידי סוניקציה, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
4. מעבירים את הגלולה למיכל סטרילי ומקפיאים אותה עם קרח יבש או חנקן נוזלי. מעבירים מיד לתא ייבוש בהקפאה.
5. יבש בהקפאה (4 שעות ב -50 ° C תחת ואקום) M. paratuberculosis על פי מדריך המכונה.
6. בתום הליופיליזציה, הסר את מיכל הנירוסטה ממייבש ההקפאה והעבר אותו לספסל ניקוי ביולוגי. השתמש במרית נירוסטה כדי לעקור את גושי MAP המיובשים הנצמדים לדופן הפנימית של מיכל הנירוסטה וכתש אותם דק ככל האפשר.
7. שוקלים את התאים המרוסקים באמצעות איזון אלקטרוני ומניחים אותם ידנית בבקבוקון אספטי של 10 מ"ל בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
   הערה: צפיפות התאים כומתה כגרמים של משקל יבש לליטר דגימה. לאחר 3 שבועות, 1 מ"ג (משקל רטוב) של גלולת תא חיידק מכיל כ 2.5 × 10⁸ CFU.

3. הכנת תחליב MOG _35-55

1. טוחנים את תכולת בקבוקון אחד של M. paratuberculosis מיובש (10 מ"ג) לאבקה דקה עם מכתש ומזיק ומוסיפים 10 מ"ל לאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לקבלת תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -4°C.
2. לפני החיסון, לדלל את תמיסת המלאי לריכוז סופי של 4 מ"ג / מ"ל.
3. לדלל את הפפטיד MOG_35-55 ב ddH 2 O לריכוז סופי של₂מ"ג / מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
4. באמצעות הומוגנייזר, מערבבים את תמיסת MOG_35-55 (2 מ"ג/מ"ל) עם נפח שווה של אדג'ובנט (4 מ"ג/מ"ל) משלב 3.2 בצינור של 5 מ"ל עד ליצירת תחליב עבה. לאחר כל 10 שניות של ערבוב, מניחים את התמיסה על קרח במשך 20 שניות, ומסובבים את הצינור כדי לשחזר את כל התמיסה.
5. מעבירים את התחליב למזרק 1 מ"ל, מוציאים את כל האוויר ומוסיפים מחט 27 גרם. התחליב מוכן כעת להזרקה.
   הערה. מאז אובדן מסוים של תחליב צמיג של MOG_35-55 מתרחשת במהלך ההכנה, עדיף להכין 1.5 פעמים את הסכום הדרוש.

4. חיסון בעלי חיים

1. להרדים את בעלי החיים עם שאיפת isoflurane כדי למזער את הלחץ על בעלי החיים.
2. הזריקו את התחליב (200 μL המכיל 200 מיקרוגרם/עכבר של MOG_35-55) תת עורית לגב התחתון.
3. יש לתת מנה של רעלן שעלת (100 מיקרוליטר המכיל 200 ננוגרם/עכבר) תוך צפקית בימים 0 ו-2 לאחר החיסון.
   זהירות: לרעלן שעלת יש השפעה מדכאת, מרובה, על מערכת החיסון; יש להימנע מבליעה וממגע עם העיניים והעור.

5. הערכה קלינית

1. עקוב אחר העכברים מדי יום עבור משקל וסימנים קליניים. השתמש במערכת הניקוד הבאה: 0 = ללא סימנים קליניים; 1 = זנב רפוי; 2 = פגיעה ברפלקס הנכון וחולשת הגפיים האחוריות; 3 = שיתוק מוחלט של הגפיים האחוריות; 4 = שיתוק מלא של הגפיים האחוריות עם שיתוק חלקי של הגפיים הקדמיות; 5 = מת.
   הערה: עם התצפית הראשונית של סימנים קליניים, בעלי חיים מקבלים גישה מוגברת למים ולמזון. צ'או מכרסם מרוכך ומרטיב, ואז מונח על רצפת הכלוב מהופר המזון. במקרה של בעלי חיים מיובשים, תוספת נוזלים תת עורית מנוהל, או מכרסם צ'או slurry ניתן באמצעות gavage אוראלי. אם עכבר זקוק לסיוע מסוג זה במשך יותר משלושה ימים, תתבצע המתת חסד.
2. כדי להימנע או למזער כאב ומצוקה של בעלי חיים, השתמש בנקודות הקצה האנושיות הבאות: ירידה במשקל הגוף מעל 20%, ציון קליני ≥4.0, היעדר רפלקס התיקון בציון 3, וכאשר בעל החיים אינו מסוגל לגשת למזון או למים במשך 24 שעות.
   הערה: העכברים הומתו ביום ה-30 לאחר השראת EAE על ידי זריקות תוך-פריטוניאליות של פנטוברביטל (≥150 מ"ג/ק"ג).

קבוצות של עכברי C57BL/6 (סה"כ n = 15/קבוצה) חוסנו ב-MOG_35-55 בתחליב המכיל M. paratuberculosis או בשיטה הנפוצה עם CFA. כל קבוצות העכברים הפגינו מחלה מונופאזית חריפה המאופיינת בשיא נכות יחיד שנצפה לאחר 14-17 ימים, ואחריו החלמה חלקית של הסימפטומים במהלך 10 הימים הבאים (איור 1A). עכברים שחוסנו באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis, ללא קשר למין, הראו התפרצות מוקדמת יותר בין 8 ל-9 ימים לאחר החיסון, וחומרה גבוהה יותר בשלב החריף מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA (איור 1B). לא היה הבדל משמעותי במשקל הגוף בין הקבוצות (איור 1C). ניתוח ציטופלאורימטרי של תאי טחול מעכברי EAE ופעילות שגשוגית של לימפוציטים מסוג T שהוערכו על ידי ³שילוב H-thymidine בוצעו, כפי שפורסם בעבר¹¹. כל תאי הטחול של עכברי EAE, ללא קשר לאדג'ובנט שבו נעשה שימוש, הראו תגובת שגשוג חזקה לפפטיד MOG_35-55, בעוד שהם לא התרבו בתגובה לפפטיד הביקורת אובאלבומין (איור 1D). עכברי EAE שחוסנו נגד M. paratuberculosis הראו שיעור מוגבר של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+I-A/I-E⁺) ומונוציטים (CD11b⁺CD115⁺) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA במהלך השלב החריף של EAE (איור 1E). ניתוח היסטולוגי על-ידי המטוקסילין-אאוסין חשף הסננה דלקתית חד-גרעינית טיפוסית של כלי דם וקרום המוח במוח ובחוט השדרה (איור 1F).

איור 1: תוצאות EAE מייצגות. (A) ציונים קליניים של עכברים המוערכים מדי יום; (ב) הבדלים במהלך המחלה; (ג) משקל הגוף; (D) תגובת שגשוג של תאי T לפפטיד MOG_35-55 ; (E) אוכלוסיות תאי חיסון בטחול במהלך השלב החריף; (F) תמונות היסטולוגיות של קטעי חוט השדרה (הגדלה פי 4) מוכתמים בהמטוקסילין-אאוסין (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) במהלך השלב החריף. החיצים מצביעים על חדירות דלקתיות. הנתונים מראים תוצאות משולבות של שלושה ניסויים עצמאיים (n = 5 עכברים/קבוצה/ניסוי). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן המחושבת באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של בונפרוני או מבחן Mann-Whitney U. קיצורים: EAE = אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית; MOG = מיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין; PBS = מלח חוצץ פוספט; CFA = להשלים את האדג'ובנט של פרוינד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG_35-55 המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis¹⁰. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקובקטריה¹¹. למעשה, בניגוד למיקובקטריה אחרים, M. paratuberculosis מייצר אנטיגן lipopentapeptide על פני דופן התא במקום glycopeptidolipids¹¹. ליפופנטפטיד זה לא הגיב בהצלבה עם מינים קרובים אחרים והוכח כמטרה לתגובה הומורלית ספציפית חזקה בחולים עם הפרעות אוטואימוניות¹². מיקובקטריה היא בעלת דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן, הממלאים תפקידים שונים בתגובות חיסוניות⁹. לדוגמה, לאחרונה הראינו כי חיסון אוראלי עם M. paratuberculosis מגביר את חומרת MOG-EAE¹³, בעוד חיסון עם bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 נראה שיש תפקיד מגן בהתקדמות של מודלים פעילים וספונטניים EAE¹⁴.

מגבלות אפשריות של הפרוטוקול כוללות את הקורס המונופאזי המוגבל עצמית של EAE, שעלול להפוך לכרוני אם מוכפלים ריכוזי המיקובקטריום ברעלן האדג'ובנט והשעלת. היבט זה חשוב מאוד לשקול, במיוחד כאשר לומדים את ההיבט הנוירודגנרטיבי של EAE באמצעות עכברי נוקאאוט, שכן היעדר שלב ההתאוששות עלול להיגרם על ידי מינונים גבוהים של ריאגנטים בשימוש ולא על ידי חוסר תפקוד של גנים מסוימים. יתר על כן, למרות שניתן ליישם את הפרוטוקול המתואר לעיל על פרוטוקולים אחרים של EAE על ידי שינוי הזנים והגיל של עכברים או סוג וכמות החלבון, כדי להבטיח שניסויי EAE מבוצעים בצורה נכונה מבחינה מתודולוגית, יש להתאים קבוצות ניסוי לגיל ולמין.

מכיוון ששכיחות המחלה עשויה להשתנות, ההמלצות לפתרון בעיות הן: ריכוז M. paratuberculosis האופטימלי יכול לנוע בין 2 ל 4 מ"ג / מ"ל, ומחבר תלת כיווני יכול לשמש לערבוב כמויות קטנות של האנטיגן בשלב המימי. תיארנו שיטה להכנת האמולסיה באמצעות הומוגנייזר; עם זאת, שיטה חלופית ופשוטה לערבוב כמויות קטנות של אנטיגן בשלב המימי, בשלב השמן, כוללת שימוש בהתאמת מחבר תלת-כיוונית, שאליה מחוברים שני מזרקי זכוכית. לסיכום, זיהינו את M. paratuberculosis כמועמד אדג'ובנטי חזק בהשראת EAE פעיל. מחקרים נוספים על אופן הפעולה וסוג החסינות המושרה במינים שונים של בעלי חיים יגבירו את הביטחון באפשרות לאמץ שיטה חלופית זו כדי להבין את מנגנון הדלקת העצבית.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).