הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה במודל חולדה

הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה (BSCB) יכולה להיות מושגת בהצלחה עם מתן תוך ורידי של מיקרו-בועות ויישום אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU). פרוטוקול זה מפרט את פתיחת ה- BSCB באמצעות LIFU במודל מכרסמים, כולל הגדרת ציוד, הזרקת מיקרו-בועות, לוקליזציה של מטרות והדמיית הפרעה של BSCB.

אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU) משתמש בפעימות על-קוליות בעוצמות נמוכות יותר מאולטרסאונד ונבדק כטכנולוגיה נוירומודולטורית הפיכה ומדויקת. למרות שפתיחת מחסום דם-מוח בתיווך LIFU (BBB) נחקרה בפירוט, לא נקבעה עד כה טכניקה סטנדרטית לפתיחת מחסום דם-חוט השדרה (BSCB). לכן, פרוטוקול זה מציג שיטה לשיבוש מוצלח של BSCB באמצעות סוניקציה LIFU במודל חולדה, כולל תיאורים של הכנת בעלי חיים, ניהול מיקרו-בועות, בחירת מטרות ולוקליזציה, כמו גם הדמיה ואישור של שיבוש BSCB. הגישה המדווחת כאן שימושית במיוחד עבור חוקרים הזקוקים לשיטה מהירה וחסכונית כדי לבדוק ולאשר לוקליזציה של מטרות ושיבוש BSCB מדויק במודל של בעלי חיים קטנים עם מתמר אולטרסאונד ממוקד, להעריך את יעילות BSCB של פרמטרים סוניים, או לחקור יישומים עבור LIFU בחוט השדרה, כגון אספקת תרופות, אימונומודולציה, ונוירומודולציה. מומלץ למטב פרוטוקול זה לשימוש אישי, במיוחד לקידום עבודה פרה-קלינית, קלינית ותרגומית עתידית.

בדומה למחסום הדם-מוח (BBB), מחסום הדם-חוט השדרה (BSCB) מווסת את התנועה של מומסים, תאים ומרכיבי פלזמה במחזור לתוך פרנכימה של עמוד השדרה¹. תכונת הגנה זו היא תוצאה של מערכת מיוחדת של תאי אנדותל קשורים היטב, שאינם מגוננים, המרפדים את נימי עמוד השדרה². בדרך כלל, רק מולקולות ליפופיליות בעלות משקל נמוך עם מטען חיובי יכולות לחצות את שני המחסומים³. למרות מחקרים המצביעים על כך של- BSCB יש חדירות מעט גבוהה יותר מאשר ל- BBB, שני המחסומים מגבילים את מתן התרופות למערכת העצבים המרכזית⁴. מספר אסטרטגיות פותחו כדי להגביר את העברת התרופות ברחבי BSCB, כולל טכניקות להגברת הלחץ האוסמוטי בנימי עמוד השדרה, פיתוח תרופות המקיימות אינטראקציה עם קולטני ברדיקינין, ויצירת ננו-חלקיקים פונקציונליים⁵.

הפרעה BSCB יכולה להיות מושגת גם באמצעות מתן תוך ורידי של מיקרו-בועות (MBs) ואחריו סוניקציה של אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU)⁶. השדה האקוסטי שנוצר על ידי מתמר האולטרסאונד גורם לתנודות MB, שבתורן מפעילות לחץ על דופן האנדותל ומשחררות צמתים הדוקים⁷. התרופפות הצומת ההדוקה יוצרת רווחים חולפים בנימים, ומאפשרת למטפלים לחדור לתוך הפרנכימה של עמוד השדרה (איור 1). תהליך זה יכול גם ליצור fenestrations transendothelial, להגביר transcytosis, ו downregullate ATP קושרים קולטות טרנספורטרים, כגון P-glycoprotein ^8,9. יתרון מרכזי של טכניקה זו הוא היכולת למזער השפעות מחוץ למטרה על ידי הכוונת אזור המוקד של סוניקציה למיקום העניין בחוט השדרה. מספר ניסויים קליניים בדקו את היעילות של פתיחת BBB בתיווך LIFU לטיפול בפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כולל גליומות, טרשת אמיוטרופית צידית, מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. למרות ששיבוש BSCB בתיווך LIFU אינו מאופיין באופן נרחב כמו הפרעה BBB בתיווך LIFU, מספר קבוצות דיווחו על שיבוש BSCB מוצלח במודלים של מכרסמים, ארנבים וחזירים^10,11,12. בסך הכל, העניין בטכניקה גדל במהירות, במיוחד כאפיק בר קיימא לאספקת תרופות.

בפרוטוקול זה מתוארת טכניקה להפרעה BSCB בתיווך LIFU במודל חולדה. ההליך כולל תיאורים מפורטים של הכנת בעלי חיים, הגדרת ציוד LIFU, ניהול MB, לוקליזציה של מטרות ועקירת חוט השדרה. אישור של לוקליזציה של המטרה ושיבוש BSCB מוערך באמצעות אקסטרווזיה של צבע כחול אוונס (EBD) לתוך חוט השדרה. EBD היא תרכובת לא רעילה שנקשרת לאלבומין בסרום וניתן לזהות אותה על ידי צבעה הכחול העשיר באופן חזותי ואוטופלואורסצנטיות אדומה תחת מיקרוסקופ¹³.

השלבים המפורטים כאן מציעים חלופה מהירה וזולה למערכות LIFU מונחות אולטרסאונד מסורתיות (US) או תהודה מגנטית (MR). כתוצאה מכך, שיטה זו שימושית עבור חוקרים המעוניינים לבדוק ולאשר במהירות את יכולות המיקוד ושיבוש BSCB של מתמר LIFU שלהם לפני רכישת ציוד וחומרים נוספים או רודפים אחר יישומי LIFU בחוט השדרה, כגון אספקת תרופות, אימונומודולציה ונוירומודולציה.

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו ונערכו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (IACUC RA20M223). במחקר הנוכחי נעשה שימוש רק בחולדות בוגרות מסוג Sprague-Dawley (משקל ממוצע: 250 גרם; גיל: 11 שבועות).

1. הרכבה והתקנה של אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה

1. לרכוש מערכת מתמרים אולטרסאונד ממוקד עם מפרט מספיק כדי להשיג פתיחת BSCB בחולדות. פרמטרים מוצעים מהספרות כוללים תדר מרכזי בין 0.25-4 מגה הרץ ויכולת הפקת לחצי שיא בין 0.2-2.1 מגפ"ס 10,14,15,16,17. ודא שהמערכת כוללת את ציוד הנהיגה/בקרה, הכולל לכל הפחות מחולל גל/אותות, כונן/מגבר הספק בתדרי רדיו (RF) ורשת תואמת (איור 2A).
   הערה: ההתקנה המתוארת כאן משתמשת במתמר רב-רכיבי זמין מסחרית עם תדר מרכזי של 250 קילו-הרץ וקוטר 64 מ"מ (איור 2B).
2. הדביקו את מחזיק הגשושית המודפס בתלת-ממד ואת חרוט המים על המתמר (איור 2C). יש לוודא אטם אטום למים בין החרוט למתמר.
   הערה: חרוט מותאם אישית ומחזיק בדיקה הגיעו עם המתמר המשמש בניסוי זה. החרוט ומחזיק הגשושית מצמידים למתמר באמצעות ברגים, המסופקים גם הם.
3. יש לעקר קרום פוליאסטר שקוף אקוסטית בעובי 50 מיקרומטר ולהדביק לתחתית חרוט המים באמצעות גומייה.
4. מלאו את חרוט המים במים נטולי גז ונטולי יונים, באמצעות צינורות הכניסה והיציאה. היזהרו להימנע מבועות אוויר בתוך החרוט, מכיוון שהן עלולות לשבש את הצימוד האקוסטי בין המתמר למטרה. קרום הפוליאסטר צריך להיות מנופח מעט.
   הערה: כדי להסיר בועות אוויר מהחרוט, הנחית את הבועות אל שסתום היציאה תוך מילוי החרוט במים דרך שסתום הכניסה. אם קיימות בועות קטנות רבות, סגרו את כל השסתומים וסובבו את החרוט עד שתישאר בועה אחת גדולה. כוונו את הבועה הזו לשסתום היציאה והמשיכו למלא את החרוט.
5. חבר את ציוד הנהיגה, הכולל את מחולל הגלים ומגבר כונן RF, למתמר. כבל המתמר יתחבר לצד הפלט של הרשת התואמת, ומחולל האותות/מגבר החשמל יתחבר לצד הקלט של הרשת התואמת. יש לחבר את הכבלים למספר הערוץ המתאים להם (איור 2D-G).
   הערה: במערכת המסחרית ששימשה במחקר זה, מחולל הגלים ומגבר כונן RF הם רכיבים של תפוקת הכוח המתמר (TPO) (איור 2D).
6. חבר את מחזיק הבדיקה לזרוע הסטריאוטקטית. הצמידו את הזרוע הסטריאוטקטית למכלול לוחית הקיבוע. זה יאפשר למתמר להיות ממוקם בדיוק מעל המכרסם במהלך סוניקציה.

2. הכנת בעלי חיים ולמינקטומיה כירורגית

1. מרדימים את החולדה בתערובת של איזופלורן ואוויר רפואי בתא אינדוקציה המחובר למכל מסנן פחם. הגדר את קצב זרימת הגז ל- 400 מ"ל לדקה ואת וופורייזר האיזופלורן בין 1.5%-2.5% להשראת הרדמה. משך הזמן המושקע בחדר לפני טשטוש מלא משתנה, אם כי הוא בדרך כלל נע בין 3-6 דקות.
2. רשמו את משקל החולדה המורדמת ובצעו בדיקת צביטת בוהן. אם נצפתה טלטול או תנועה בתגובה לצביטה, הניחו את החולדה בחזרה בתוך תא האינדוקציה למשך דקה נוספת וחזרו על בדיקת צביטת הבוהן. חזרו על הפעולה לפי הצורך כדי לוודא שהחולדה מורדמת באופן מלא.
3. הניחו כרית חימום וכרית ספיגה סטרילית על צלחת הקיבוע. הניחו את החולדה על כרית הסופג, מרחו משחת עיניים והניחו מדחום רקטלי לניטור טמפרטורת הגוף.
   הערה: במהלך ההליך הכירורגי, יש לעקוב אחר הטמפרטורה וקצב הלב של החולדה (באופן אידיאלי, קצב הלב צריך להיות בין 330-480 פעימות לדקה והטמפרטורה בין 35.9-37.5 מעלות צלזיוס)^18,19. התאימו את האיזופלורן או כרית החימום בהתאם כדי למנוע מוות בטרם עת. ניתן לכוון את כרית החימום לטמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס ויש להדליק ולכבות אותה לפי הצורך כדי לשמור על טמפרטורת הגוף האופטימלית.
4. מישוש הצלע האחרונה של החולדה, המחוברת לעמוד השדרה בחוליה ה-13^{של בית} החזה (T13). השתמש בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את הפרווה מהמשטח הגבי בין הצלע האחרונה לצוואר. נגבו את העור החשוף בגזה טבולה ב-10% יודופובידון.
5. יוצרים חתך בקו האמצע באמצעות מספריים בקשתית ומנתחים דרך הפאשיה עד לחשיפת התהליכים בעמוד השדרה והלמינה. הסר עצם עם פטמי עצם מוסטים ומספריים קשתית להב זוויתית עד לחשיפת חוט השדרה²⁰. אורך הלמינקטומיה והחתך משתנה בהתאם למספר המטרות השונות שיש לבצע סוניקציה. במחקר זה בוצעה כריתת למינקטומיה תלת שכבתית באמצעות חתך בקוטר 3 ס"מ.
   הערה: הימנע מלגעת או להפעיל לחץ על חוט השדרה בעת הסרת העצם כדי למנוע פציעה. אם הגפיים האחוריות של החולדה מטלטלות במהלך כריתת הלמינקטומיה, אז נעשה שימוש בכוח רב מדי על החבל או על שורשי העצבים.
6. הצמידו את החולדה לצלחת הקיבוע על ידי הידוק התהליכים בעמוד השדרה הסמוכים לכריתת הלמינקטומיה. משוך מעט את עמוד השדרה מתוח כדי למזער את העקמומיות לפני נעילת המלחציים.

3. לוקליזציה של מטרות באמצעות הנחיית לייזר

1. התאימו את מיקום המתמר עם הזרוע הסטריאוטקטית עד שהוא ממוקם בדיוק מעל כריתת הלמינקטומיה (איור 3A). המסגרת מאפשרת תנועה בצירי x, y ו-z, כמו גם סיבוב של 180° במישור האנכי וסיבוב של 360° במישור האופקי.
2. הצמידו את מכשיר הלייזר לתחתית חרוט המים והורידו אותו עד שנקודת הלייזר נראית לעין. התאימו את המיקום הצידי של המתמר עד שנקודת הלייזר תהיה מעל המיקום שהוא היעד להפרעה ב-BSCB (איור 3B,C).
   הערה: קובץ תכנון בעזרת מחשב (CAD) עבור מכשיר הלייזר כלול בסעיף המשלים (איור משלים 1).
3. הסירו את מכשיר הלייזר ומלאו את החלל שבין החרוט לחוט השדרה בג'ל אולטרסאונד נטול גז (איור 3D). לצימוד מקסימלי, יש לוודא שאין בועות אוויר בג'ל.
   הערה: במחקר זה, המתמר עם חרוט מים מודבק הונמך עד הממוקם 1 ס"מ מעל הכבל. מכיוון שאורך חרוט המים היה 30 מ"מ, המרחק הכולל מהמתמר לכבל היה 40 מ"מ. חרוט המים הונח במרחק של 1 ס"מ מחוט השדרה מכיוון שהעור, הפאשיה והשרירים של החולדה משני צדי החתך מונעים מגע ישיר בין קצה החרוט לחבל. שימוש במספרים על ציר ה-y של הזרוע הסטריאוטקטית עשוי להיות מועיל במעקב אחר המרחק האנכי שבו החרוט נמצא במרחק של 1 ס"מ מהכבל, במיוחד מכיוון שהג'ל יקשה על אישור חזותי של מרחק החרוט מהכבל.
4. הגדר את הפרמטרים עבור סוניקציה ב- TPO. ניתן להשתמש בטווח ערכים כדי להשיג הפרעה מוצלחת של BSCB. לקבלת עוצמה מרבית, הגדר את תדר הסוניקציה קרוב לתדר המרכזי של המתמר. הערכים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.
   הערה: הפרמטרים המפורטים כאן הותאמו מעבודה קודמת עם LIFU, עם תדר מרכזי של 500 קילוהרץ, משך פרץ טון של 500 μs, מחזור עבודה של 50%, וזמני סוניקציה של 5 או 10 דקות כדי לבצע נוירומודולציה בטוחה של חוט השדרה של מכרסם²¹. בהתבסס על מחקרים שהשיגו בהצלחה שיבוש BSCB, פרמטרים אחרים שניתן להשתמש בהם הם תדרים מרכזיים בין 500 kHz-1 MHz, לחצים של 0.2-2.1 MPa, אורכי פרץ של 10-25 ms, וזמני סוניקציה של 2-5 דקות 6,10,11,22.

טבלה 1: פרמטרי סוניקציה המשמשים לשיבוש BSCB.

4. ניהול מיקרו-בועות

1. הכן פתרון MB בהתאם להוראות שסופקו על ידי היצרן. הימנעו מהחדרת אוויר לתמיסה.
   הערה: ה-MB שבירים ומתגבשים יחד בסמוך לחלק העליון של הבקבוקון/מזרק אם משאירים אותם ללא תזוזה למשך מספר דקות. נערו את הבקבוקון והמזרק באופן קבוע כדי למנוע פיזור לא אחיד של MBs. תוחלת החיים של MBs קצרה; עיין במדריך היצרן כדי לקבוע את זמן התפוגה.
2. יש להכניס צנתר ווריד זנב 22 גרם ולשטוף עם 0.2 מ"ל של מי מלח הפריניזציה (500 IU/mL)²³. כדי להגדיל את הסיכויים לצנתור ורידי זנב מוצלח, טובלים את הזנב במים חמים ומניחים חוסם עורקים בבסיס הזנב כדי להגדיל את קוטר הווריד.
   הערה: ניתן לבצע צנתור ורידים בזנב לפני כריתת בעלי חיים, מיקום ומיקוד כדי לחסוך זמן מחקר.
3. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג של 3% EBD לתוך הצנתר. סומק עם 0.2 מ"ל של מלוחים heparinized. הגפיים והעיניים של החולדה יהפכו כחולות. אשרו צנתור וריד זנב מוצלח על-ידי בדיקת שינוי צבע כחול בווריד עמוד השדרה הגבי של החולדה (איור 4).
   הערה: EBD ניתן להזרקה הרבה לפני הזרקת MB ולא ישפיע על סוניקציה. בנוסף, מכיוון שמנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) לא אישר כיום סוניקציה עם תרופות שכבר נמצאות במערכת, EBD יכול להינתן גם לאחר סוניקציה. זה יגרום לפחות ספיגת צבע, אבל עשוי להיות רלוונטי יותר מבחינה קלינית.
4. להזריק בולוס 0.2 מ"ל של MB לתוך הצנתר ולשטוף עם 0.2 מ"ל של מלוחים heparinized. התחל את הסוניקציה 1-2 דקות לאחר הזרקת MBs. ההתקנה המשמשת כאן אינה אוספת משוב סוני בזמן אמת.
   הערה: מחקרים על הפרעה BSCB משתמשים בדרך כלל בריכוז גבוה יותר של MBs מהמצוין עבור הדמיה אבחנתית. ריכוזים מסוימים של מותגי MB נפוצים המשמשים להפרעות BBB ו-BSCB בדגמי חולדות כוללים 0.02-0.2 מ"ל/ק"ג ובולוסים של 200 מיקרוליטר 10,15,24,25.

5. מיצוי חוט השדרה ועיבוד רקמות

1. לאחר השלמת הסוניקציה, לנקב את החולדה עם 100 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS) עד הדם זורם צלול לחלוטין. הכבד, שהוא צבע כחול עשיר בשל הצבע, צריך לדהות לחום בהיר^{כחול 26}.
   הערה: מטרת הזלוף היא להסיר עודפי דם מכלי הדם של חוט השדרה. מאז EBD נקשר אלבומין, זה גם מסיר EBD עודף. זה מבטיח שכל EBD שזוהה חזותית או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחוט השדרה הוא מאקסטרווציה של צבע לתוך פרנכימה בעמוד השדרה.
2. ניקוב טרנסקרדיאלי עם 100 מ"ל של קור 4% paraformaldehyde (PFA). הגפיים של החולדה יתעוותו במהלך הקיבוע הזה אם נעשה ביסודיות. זילוח זה עם PFA מרדים את החולדה.
3. הסר את חוט השדרה והנח אותו ב- 4% PFA ב- 4 ° C למשך הלילה. החלף את ה- PFA ב- PBS למחרת.

6. הדמיה של הפרעה BSCB

1. בודד קטע של 2 ס"מ המקיף את מיקום הסוניקציה באמצעות סכין גילוח. פצלו את החלק לאורך קו האמצע עם הלהב ואת החתך למקטעים בעובי 10 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. להדמיה של שדה בהיר, יש לכתם עם כתם המטוקסילין-אאוסין (H&E).
   הערה: דגימות חוט השדרה H&E שהוצגו במחקר זה היו מוכתמות בהמטוקסילין במשך 3 דקות ובאוזין למשך דקה²⁷.
2. עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, deparaffinize שקופיות המכילות את קטעי חוט השדרה ואת counterstain עם 25 μL של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מומס בתווך הרכבה (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). יש לדגור ב-4°C למשך 10 דקות לפחות. יש להימנע משימוש באור כדי למנוע הלבנה.
   הערה: ניתן להחליף את הפראפיניזציה באמצעות קריוסטט לקבלת חלקים קפואים.
3. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצלם את כל השקפים. EBD autofluorescence (עירור: 470 ננומטר ו 540 ננומטר; פליטה: 680 ננומטר) נראה בערוץ האדום, בעוד DAPI נמצא בערוץ הכחול. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לצלם את שקופיות H&E.
   הערה: למרות שפרוטוקול זה תיאר הליך שאינו הישרדותי, הוא בוצע גם באמצעות טכניקות כירורגיות הישרדותיות. לניתוח הישרדות, יש לחטא את העור לפני החתך ב-3 יישומים מתחלפים של יודופובידון ולתת בופרנורפין תת עורית (0.05 מ"ג/ק"ג) לפני הניתוח. המשך לספק buprenorphine תת עורי כל 12 שעות לפחות 3 ימים לאחר הניתוח, עם ימים נוספים אם החולדה מראה סימני כאב. אם מתרחשת פגיעה בחוט השדרה, חולדות עשויות להציג אצירת שתן או הליכה לא תקינה. זה יתבטא כגרירה או עיכוב בתנועה של הגפיים האחוריות או שלפוחיות מוחשיות ונפוחות. במקרה כזה, יש לשכן חולדות עם ג'ל מים מועשר תזונתית למזון ולחות ולהוציא ידנית את שלפוחית השתן פעמיים ביום עד להתאוששות הרפלקס. אם יש שיתוק מוחלט של הגפיים האחוריות או כאב בלתי נסבל, להרדים את החולדה.

מאמר זה מדגים כי היישום המקביל של סוניקציית LIFU וניהול MB הוא טכניקה יעילה להפרעה מקומית של BSCB. פתיחת ה- BSCB מסומנת על ידי נוכחות של אקסטרווסציה EBD לתוך פרנכימה בעמוד השדרה. השינויים ניכרים הן חזותית והן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כלי הדם של חוט השדרה נראים לאחר למינקטומיה ומראים את וריד עמוד השדרה האחורי עם מספר כלי דם קטנים יותר המקרינים לרוחב (איור 4A). הזרקה תוך ורידית של EBD דרך צנתר וריד הזנב גורמת לכך שכלי הדם הזה מועשר בצבע כחול (איור 4B). זוהי נקודה טובה בהליך כדי לוודא כי למינקטומיה לא גרמה לקרע של כל כלי דם בעמוד השדרה, כמו זה יגרום דם כחול איגום על הטבור. לאחר סוניקציה, כתם כחול אמור להיראות מעל מיקום המטרה, מה שמצביע על אקסטרווציה של EBD לתוך הפרנכימה הלבנה עקב הפרעה ב-BSCB (איור 4C). גודלה של נקודה זו משתנה בהתאם למספר גורמים, כולל גודל אזור המוקד של המתמר ומשך הזמן לאחר סוניקציה. כדי להגדיל את הסיכויים לראות אקסטרווזיה של EBD, יש להאריך את משך הזמן בין סוניקציה לעקירת חוט השדרה.

למרות שזילוח PFA אינו צעד הכרחי לביצוע לפני מיצוי חבל הטבור וניתוח רקמות לאחר מכן, הוא מסיר דם מהדגימה ומגביר את הניגוד בין פרנכימה עמוד השדרה הלבן לבין האזורים המוכתמים ב- EBD הכחול. כל החולדות שקיבלו ניהול MB וסוניקציה של LIFU מראות אקסטרווזיה לכאורה של EBD לתוך חוט השדרה, בעוד שבקרות שליליות שקיבלו MBs ו- EBD ללא סוליקציה LIFU לא. תמונות מייצגות מוצגות באיור 5. חתכי קשת דרך הרקמות מגלים כי אקסטרווסציה EBD הוא לא רק שטחי, אלא משתרע היטב לתוך החבל עצמו. זה צפוי, מכיוון שאזור המוקד של המתמר המשמש במחקר זה גדול מקוטר חוט השדרה של החולדה. לפעמים, כמויות קטנות של דימום ניתן לראות חתכים sagittal. זה יכול להיות בגלל laminectomy או סוניקציה אולטרסאונד. אם הדימום קרוב לפריפריה הגבית של החבל, סביר יותר להניח שהוא נובע מכריתת הלמינקטומיה.

כדי להעריך עוד יותר את האקסטרווסציה של EBD, חלקי חוט השדרה הקשת הוכתמו ב- DAPI (סמן גרעיני) וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל המיתרים שקיבלו סוליקציה של LIFU (n = 3) הראו עוצמה גדולה יותר באופן משמעותי של EBD autofluorescence (p = 0.016) מאשר מיתרים שלא קיבלו סוניקציה, עם עוצמות דומות של DAPI בשניהם (איור 6). ניתוח H&E גילה גם כי לא היה נזק עצבי, דימום או נגעים בחללים הקיימים במקומות הסוניים, מה שתומך בבטיחות של הליך זה. דוגמאות למיתרים פגועים כתוצאה מטיפול לקוי בניתוח וסוניקציה בעוצמה גבוהה מוצגות כהשוואה. דימום, נזק לרקמות, נגעים חלל, vacuolization אפשרי מסומנים. למרות שדוגמת הסוניקציה בעוצמה גבוהה אינה מראה דימום, זה דווח גם כהשפעה של הפרעה באולטרסאונד.

יתר על כן, ניתוח התנהגותי נערך על חולדות שקיבלו MBs, EBD, ו LIFU סוניקציה. למרות ששיטה זו אינה שוללת לחלוטין נזק לרקמות, היא בודקת אם התרחשו ליקויים מוטוריים עקב הליך זה. חולדות תועדו הולכות בכלוב במשך 5 דקות בכל יום במשך תקופה של 5 ימים, ותפקוד המוטוריקה דורג על בסיס סולם לוקומוטור באסו ביטי ברסנהאן (קובץ וידאו משלים 1). כל החולדות (n = 5) קיבלו את הציון הגבוה ביותר לפני סוניקציה, פוסט-סוניקציה וכל יום בתקופת ההישרדות (איור 7).

לבסוף, ההשפעות התרמיות של פרמטרי הסוניקציה ששימשו במחקר זה נמדדו באמצעות שתי דגימות חוט שדרה של חולדות ex vivo ובדיקת מדחום דיגיטלי עם קצה דק שהוחדר לכבל.  הטמפרטורה של דגימות חוט השדרה הייתה במעקב במשך 5 דקות לפני, במהלך ואחרי סוניקציה, במשך 15 דקות בסך הכל. נצפו שינויים מזעריים בטמפרטורה. למעשה, היה שינוי של ≤1.3 מעלות צלזיוס כתוצאה מסוניקציה בשתי הדגימות, מה שהפחית את הסבירות לפגיעה היפרתרמית כתוצאה מסוניקציה (איור 8).

איור 1: מנגנון פתיחת מחסום דם-חוט שדרה ממוקד אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה. (A) סקירה סכמטית של סוניקציה של אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU) של חוט השדרה של חולדה. (B) המנגנון לפתיחת מחסום דם-חוט השדרה (BSCB) באמצעות סוניקציה LIFU של מיקרו-בועות תוך ורידי (MBs). MBs מתנודדים בתגובה ל-LIFU, וגורמים להתרחבות של צמתים הדוקים בין תאי אנדותל. הפרעה זו של BSCB מאפשרת אקסטרווציה של ננו-חלקיקים, תרופות טיפוליות, או צבע כחול אוונס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: התקנה וקישוריות של ספסל אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה. (A) ייצוג סכמטי המציג רכיבי אולטרסאונד ממוקדים טיפוסיים. (B) תמונת סקירה כללית של מערך האולטרסאונד הממוקד, כולל: 1. תפוקת כוח מתמר (TPO), 2. רשת תואמת, 3. מתמר LIFU, 4. הכלי הסטריאוטקסי, 5. מלחציים ניידים. (ג) מתמר, כולל: 1. מחזיק בדיקה, 2. מתמר טבעת, 3. חרוט מים, 4. צינור כניסת מים, 5. צינור יציאת מים, 6. קרום מאובטח בגומייה. (ד) חזית ה-TPO, כולל: 1. מארז מסוכך RF, 2. לוח תצוגה קדמי רגיש למגע עם תפריט מתכוונן, 3. ידית מסתובבת לכוונון פרמטרים, 4. מתג פלט הפעלה/עצירה. (ה) גב ה-TPO, כולל: 1. מחברי פלט ערוץ, 2. הארקה, 3. יציאת קלט USB לבקרת תוכנה, 4. הדק פנימי, 5. מחבר פלט סנכרון, 6. שקע קלט חשמל ואספקה, 7. מתג הפעלה/כיבוי. (F) פלט רשת תואם, עם חוטים תואמים למספרי ערוצים. (G) כניסת XDR תואמת ברשת, עם חוטים תואמים למספרי ערוצים לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: לוקליזציה של מטרות עם הנחיית לייזר . (A) זרוע סטריאוטקטית עם טווח תנועה בכל שלושת הצירים ויכולות סיבוב. הוא מודבק על לוחית הקיבוע למטה. (B) מכשיר לייזר לזיהוי אזור המוקד. הלייזר ממוקם על קצה המתמר ונמצא בקו אחד עם אזור המוקד. (C) איור המראה את הלייזר על חוט השדרה החשוף, המציין שאזור המוקד של המתמר מופנה כעת למיקום זה. (D) מורידים את המתמר עד שקצה החרוט נמצא 1 ס"מ מעל הכבל, וממלאים את הרווח בג'ל כדי להבטיח צימוד מקסימלי. המרחק מהמתמר לחוט השדרה הוא 40 מ"מ (מרחק מוקד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אקסטרווזיה של צבע כחול אוונס בחוט השדרה לאחר סוניקציה . (A) תמונה של חתך T9-T11 למינקטומיה של חולדה, עם חוט השדרה החשוף והווריד הגבי האחורי נראים בבירור. (B) הרקמה שמסביב וכלי הדם של חוט השדרה הופכים כחולים לאחר הזרקה תוך ורידית של צבע כחול אוונס (EBD). (C) החדרת EBD לפרנכימת חוט השדרה באתר הסוניקציה, דבר המצביע על הפרעה ב-BSCB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: חילוץ חוט השדרה והדמיה של פתיחת BSCB לאחר זילוח. (A) חוט השדרה נכרת מחולדת ביקורת ללא טיפול LIFU. חולדה זו קיבלה רק MBs ו- EBD. פרוסה אמצעית של החוט המשובצת בפרפין מוצגת בכניסה, ולא נראית חריגה של EBD. (B) חוט השדרה נכרת מחולדה עם טיפול LIFU. חולדה זו קיבלה גם MBs ו- EBD. העמודה של אקסטרווסציה EBD גלויה ומקומית לאזור הסוניקציה. פרוסה אמצעית של החוט המשובצת בפרפין מוצגת בכניסה, עם חץ המצביע על ריכוז EBD הנראה בתוך המיקום הסוניקטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: איתור והערכה של פתח BSCB. (A) חוט השדרה המוכתם ב-DAPI (סמן גרעיני, כחול). Autofluorescence EBD מינימלי (אדום) גלוי. חולדה זו לא קיבלה LIFU. (B) חוט השדרה המוכתם ב-DAPI (סמן גרעיני, כחול). ניתן לראות אוטופלואורסצנטיות EBD מקומית (אדום) במיקום היעד הסוני. חולדה זו קיבלה LIFU ו-MBs. (C) חוט השדרה של חולדה ללא LIFU מוכתם בהמטוקסילין (כתם חומצת גרעין) ואאוזין (כתם חלבון לא ספציפי) (H&E). לא נראים נזק עצבי, דימום או נגעים בחלל. (D) חוט השדרה של חולדה עם LIFU מוכתם ב-H&E. לא נראים נזק עצבי, דימום או נגעים בחלל. (E) חוט השדרה של חולדה עם פגיעה כירורגית מוכתמת ב-H&E. החיצים מצביעים על דימום רב ונזק לרקמות. (F) חוט השדרה של חולדה שניזוק כתוצאה מסוניקציה בעוצמה גבוהה המוכתם ב-H&E. חצים מצביעים על נגעים בחלל, והכניסה מראה אפשרות להתוודות. (G) גרפים עמודות המראים את עוצמת DAPI ו-EBD בחוט השדרה של חולדות עם וללא סוליקציית LIFU. יש הרבה יותר עוצמת EBD בחוט השדרה LIFU בהשוואה לביקורת השלילית (p = 0.016), למרות עוצמת DAPI דומה (p > 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: בדיקה התנהגותית לפני ואחרי סוניקציה . (A) מתקן באסו, ביטי, ברסנהאן, שבו תועדו חולדות הולכות במשך 5 דקות מלמטה. (B) תמונת סטילס מסרטון מוקלט. סרטון זה שימש כדי לדרג את הקואורדינציה המוטורית וההליכה של החולדה בסולם באסו, ביטי, ברסנהאן. (C) Boxplot (n = 5) לא מראה שינוי בציונים המוטוריים לפני סוניקציה, פוסט-סוניקציה, או במהלך תקופת הישרדות של 5 ימים בחולדות שקיבלו MBs וטיפול LIFU (p > 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: ניתוח טמפרטורה באמצעות חוטי שדרה ex vivo . גרף המתאר שינויי טמפרטורה בשתי דגימות של חוט השדרה ex vivo למשך 5 דקות לפני, במהלך ואחרי סוניקציה. הפרמטרים המשמשים לסוניקציה מפורטים בטבלה 1. עבור מדגם 1, הטמפרטורות הממוצעות לפני, במהלך ואחרי סוניקציה היו 21.9 °C ± 0.1 °C (75 °F), 22.1 °C ± 0.1 °C (75 °F) ו-22.0 °C ±-0.1 °C (75 °F), בהתאמה. עבור מדגם 2, הטמפרטורות לפני, במהלך ואחרי סוניקציה היו 21.9 ° C ± 0.1 ° C, 22.5 ° C ± 0.3 °C ו- 22.4 ° C ± 0.2 ° C, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: קובץ CAD של מנגנון מיקוד לייזר. (A) מבט על מכשיר הלייזר מלמטה. כל לייזר יכול להיות ממוקם בתוך החור המרכזי באמצע. (B) מבט רוחבי על מכשיר הלייזר. (C) מידות מכשיר הלייזר, עם יחידות באינצ'ים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ וידאו משלים 1: סרטון של חולדה הולכת במכשיר באסו, ביטי, ברסנהאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

כאן מתוארים הציוד והצעדים הדרושים להפרעה יעילה וממוקדת של BSCB באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU) בשילוב עם מתן מיקרו-בועות (MB). פרוטוקול זה גמיש וניתן לייעל אותו לשימוש אישי עם מתמרים בעלי מפרטים שונים. טכניקות אחרות לשיבוש BSCB בתיווך LIFU מסתמכות על שימוש במערכות מונחות דימות תהודה מגנטית (MRI) ללוקליזציה של מטרות, שהוא משאב יקר¹⁶. יתרונות הטכניקה המוצגת כאן טמונים באישור חזותי מהיר בזמן אמת של שיבוש BSCB וקלות המיקוד בשל אופיו הפתוח של ההליך. יתר על כן, מכשיר הלייזר פשוט לשימוש ולבנייה, וקובץ CAD כלול בחלק המשלים. כתוצאה מכך, חוקרים המעוניינים לבצע בדיקות ראשוניות על יכולות המיקוד של מתמר LIFU שלהם במודל של בעלי חיים קטנים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה ככלי לאישור מהיר של מיקום אזור מוקד מעל מיקום מעניין. טכניקה זו עשויה לשמש גם מעבדות המתחילות לחקור יישומים קליניים של LIFU, כגון אספקת תרופות, לפני השקעה בשיטות הנחיה מורכבות יותר כמו מערכות US או MR. נכון לעכשיו, שיטות מונחות ארה"ב מציגות נתיב מבטיח וחסכוני יותר בהשוואה למערכות MR, אם כי האחרונות נראות לעתים קרובות יותר בספרות.

ישנם מספר שלבים קריטיים בהליך זה שיש לבצע בזהירות כדי להבטיח הפרעה מוצלחת של BSCB. זה הכרחי כדי למנוע הפעלת לחץ מיותר על חוט השדרה במהלך למינקטומיה כירורגית. מניפולציה פיזית רבה מדי של הכבל מגדילה את הסבירות לנזק ל- BSCB. הנזק מופיע ככתם חום כהה בתוך החוט לאחר החילוץ עקב דימום ואקסטרווזיה מוגברת של EBD. יתר על כן, יש להבטיח צימוד מקסימלי בין המתמר לבין חוט השדרה החשוף. כתוצאה מכך, יש להקפיד להסיר בועות מחרוט המים וג'ל האולטרסאונד. לא אמורים להיות רווחים בין תחתית חרוט המים לבין הכבל כדי להבטיח שידור מלא של הגל האקוסטי. במהלך צנתור ורידי הזנב, יש להימנע מהעברת אוויר בטעות יחד עם תמיסות מי מלח, EBD או MB שעברו הפריניזציה. הזרקת אוויר מגדילה מאוד את הסיכוי לתסחיף ריאתי שיגרום למוות מכרסמים לפני סיום ההליך²⁸.

בעיה נפוצה שעלולה להיתקל במהלך הליך זה היא כישלון של הזרקת EBD מוצלחת. עבור אנשים עם ניסיון מינימלי בצנתור ורידי זנב, ביצוע שלב זה לפני כריתת למינקטומיה, מיקום או מיקוד בעלי חיים יחסוך זמן. EBD יכול גם להיות מוזרק הרבה לפני הזרקת MB מבלי להשפיע על סוניקציה. שימוש בחוסם עורקים ובאמבט מים חמים המוצעים בפרוטוקול זה יסייע להרחיב את ורידי הזנב ולהגדיל את אחוזי ההצלחה. יתר על כן, התייבשות חולדות מפחיתה את הסיכוי למיקום נכון של הצנתר. הזרקת מי מלח תוך צפקית 10-15 דקות לפני צנתור ורידים בזנב עשויה לעזור. במהלך הצנתור יש להתחיל 2 מעל קצה הזנב ולנוע בכיוון קאודלי לגולגולתי. תנועה בכיוון ההפוך מקטינה את הסיכוי להצלחה עקב קריסת ורידים פוטנציאלית או דימום.

אתגר נפוץ נוסף קשור להיעדר אקסטרווציה של EBD למרות הסוניקציה. זה עשוי להצביע על כך שהפרמטרים המשמשים לסוניקציה אינם מספיקים להפרעה BSCB. לדוגמה, אם תדר הסוניקציה מוגדר בערך שונה מאוד מהתדר המרכזי של המתמר, עוצמת הסוניקציה תהיה נמוכה מכדי לנדנד MBs ולגרום להתרופפות צומת הדוקה. יתר על כן, ככל שיהיו יותר ממשקים בין המתמר לחוט (למשל, חרוט מים, ממברנה, ג'ל, בועות אוויר במים/ג'ל), כך עוצמת הסוניקציה האמיתית תהיה נמוכה יותר במטרה. מזעור ממשקים אלה, כגון על ידי שימוש בג'ל נטול גז והסרה יסודית של בועות בתוך החרוט, יסייע להעביר את מלוא הפוטנציאל של הסוניקציה. הפרוטוקול גם מעודד הארכת הזמן בין סוניקציה לזילוח כדי לאפשר זמן רב יותר לאקסטרווזיה של EBD לתוך פרנכימה בעמוד השדרה. למרות ששיבוש BSCB הוא הליך חולף, הפערים קיימים במשך מספר שעות לפני הסגירה. זמן המתנה ארוך מגדיל את החשיפה לאיזופלורן, אך גם גורם לאקסטרווזיה גדולה יותר של EBD בכבל. לחלופין, אקסטרווזיה EBD עשויה להיות נוכחת למרות שאין סוניקציה עם LIFU. כדי לפתור בעיה זו, יש לנקוט בזהירות במהלך כריתת הלמינקטומיה כדי למנוע נזק מקרי ל- BSCB. פתרונות אפשריים כוללים הרמת עמוד השדרה של החולדה במהלך הידוק כדי להגדיל את כמות המרווח בין הלמינה לכבל, כמו גם כריתת למינקטומיה קצרה יותר. זילוח PFA יסודי גם מפחית את כתמי הרקע על ידי הסרת דם מועשר ב- EBD מכלי הדם בתוך חוט השדרה. במהלך זילוח הלב יש להקפיד על מניעת קרע מקרי של הלב, אשר יכול לגרום לדליפה של PBS או PFA.

חשוב לציין כי מחקר זה מייצג חוויה של מרכז יחיד להפרעה BSCB בתיווך LIFU. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו בודק או מייעל פרמטרים שונים של אנרגיית סוניקציה וריכוזי MB. כתוצאה מכך, החוקרים מעודדים לחקור פרמטרים וריכוזים שונים בעת ביצוע טכניקה זו כדי לייעל את לוקליזציה המטרה ואת שיבוש BSCB לצרכי המחקר הספציפיים שלהם, במיוחד אם התוצאות הראשוניות מייצרות תופעות לוואי כלשהן. קבוצות שרוצות שלא לראות שינויי טמפרטורה, למשל, יכולות לבדוק פרמטרים שונים עד שהן מוצאות קבוצה שעונה על קריטריון זה ומשיגה הפרעה מספקת של BSCB. יתר על כן, ניתן לערוך ניסויים נוספים כדי לאשר את הבטיחות של טכניקה זו. לדוגמה, ניתן להגדיל את גודל הדגימה, להאריך את תקופת ההישרדות, ולבצע מחקרי אלקטרומיוגרפיה / ניתוח הליכה. עבור הישרדות ארוכה יותר, חשוב לזכור כי כמה מחקרים מראים כי מינונים גבוהים של EBD יכול לפעמים לגרום רעילות מערכתית כרונית, ולכן מינון נמוך יותר עשוי להיות זהיר²⁹.

מגבלה נוספת של הליך זה היא האופי הפולשני של כריתת הלמינקטומיה (הנדרשת לכל טכניקה המשתמשת ב- LIFU לפתיחת BSCB מכיוון שאולטרסאונד אינו יכול לחדור דרך העצם). ניתן להפחית את האופי הפולשני של הליך זה על ידי הגבלת אורך הלמינקטומיה. ביצוע כריתת הלמינקטומיה בחוליות החזה העליונות, שהן קצרות ודקות יותר, יכול להפחית את הזמן הדרוש לכריתת למינקטומיה מתחת ל -10 דקות. בשל אופיים השברירי של MBs, כמו גם מחצית החיים הקצרה שלהם, הזמן מוגבל במהלך פרוטוקול זה. הזרקת MBs צריכה להתרחש 1-2 דקות לפני הטיפול ב- LIFU, ו- MB חדשים צריכים להינתן לפני כל סוניקציה אם מבוצעים טיפולי LIFU מרובים. עבור ניסויים הכוללים הפרעה BSCB עבור חולדות מרובות, ייתכן שיהיה צורך להכין מספר בקבוקוני MB. מכיוון שמיקרו-בועות הן יקרות, עדיף לשנות את זרימת העבודה הכירורגית כדי למזער את הזמן בין הסוניקציות כדי לשמר את מספר ה-MB שבהם נעשה שימוש.

הטכניקה המתוארת כאן היא בעיקר לשימוש כפרוטוקול מחקר. למרות שמנגנון מיקוד הלייזר לא יחליף את שיטות המיקוד המסורתיות בכל ההגדרות הקליניות, הוא עשוי להיות שימושי במצבים אחרים. עבור ניתוחים לא פולשניים, שיטות MRI מסורתיות יכולות לשמש באופן אמין עבור מיקוד³⁰. עבור ניתוחים פולשניים הכוללים כריתת למינקטומיה, ניתן להשתמש במכשיר נקודת הלייזר המתואר בפרוטוקול זה כדי למקם במהירות את מרכז אזור המוקד של סוניקציה על פני אזור מסוים (למשל, גידול או אתר של פגיעה בעמוד השדרה) למטרות מתן תרופות או טיפול אימונומודולטורי תוך השלמת כל הנחיית MR שתתרחש.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר טכניקה יעילה ומוצלחת לשיבוש BSCB וכולל מספר אפשרויות לאישור פתיחת BSCB, הן בזמן אמת והן לאחר עיבוד. עם BSCB מתפקד כמחסום כניסה לתוך parenchyma חוט השדרה, הפרעה של BSCB היא שיטה אפשרית כדי לשפר את מתן הטיפולים. לדוגמה, Weber-Adrian et al. השתמשו ב- LIFU בתדר של 1.114 MHz ובאורך פרץ של 10 ms כדי לתווך העברת גנים לעמוד השדרה הצווארי⁶. באופן דומה, Smith et al. הראו כי LIFU עם תדר של 580 kHz, לחצי שיא אקוסטיים ממוצעים סביב 0.46 MPa, ואורך פרץ של 10 ms יכול לסייע בהעברת נוגדן חד שבטי, trastuzumab, לחוט השדרה במודל מכרסם של גרורות leptomeningeal¹⁰. רוב המחקרים התמקדו בשימוש ב- LIFU, במקום HIFU, בשל יכולתו של LIFU לחדור באופן זמני את ה- BSCB תוך הימנעות מנזק לרקמת הבסיס. בדרך כלל, LIFU משתמש בעוצמות שבין 0.125-3 W/cm 2, בעוד HIFU משתמש בעוצמות בין 100-10,000 W/cm² ומעלה³¹. כתוצאה מכך, HIFU מפעיל את השפעותיו בעיקר באמצעות רקמת חימום, בעוד LIFU, עם ניהול משותף של MBs, עובד באמצעות אפקטים קוויטציה מכנית. ניהול משותף של טיפולים עם MBs יכול לגרום לאקסטרווזיה גדולה יותר של התרופה לתוך פרנכימה בעמוד השדרה, כמו גם את הפוטנציאל לטעון MBs עם תרופה וליזה MBs עם אולטרסאונד למתן תרופות ממוקד.

ניתן לשנות את פרמטרי הסוניקציה, ריכוז MB וסוג המתמר המשמשים במחקר זה בהתאם לצרכי הניסוי. לדוגמה, מתמר עם אזור מוקד קטן יותר עשוי להיות עדיף לניסויים שבהם נדרשת שליטה רבה יותר על מיקוד מקומי, בעוד שמתמר בעל הספק גבוה יותר עשוי לשמש לניסויים הדורשים הפרעה חזקה בזמן קצר יותר. בשל הגמישות שמציע פרוטוקול זה, קיים פוטנציאל גדול לשימוש במחקר פרה-קליני, קליני ותרגומי.

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי. אמיר מנבצ'י מלמד ומייעץ עבור BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, והוא ממציא במספר טכנולוגיות FUS הממתינות לפטנט. בטי טיילר קיבלה מימון מחקר מה-NIH והיא בעלים שותפה של האצת טיפולים משולבים (כולל מניות או אופציות). Ashvattha Therapeutics Inc. גם רשמה את אחד הפטנטים שלה והיא בעלת מניות של Peabody Pharmaceuticals. ניקולס תיאודור מקבל תמלוגים ומחזיק במניות גלובוס מדיקל. הוא יועץ לגלובוס מדיקל וכיהן בוועדה המדעית המייעצת / משרד אחר של גלובוס מדיקל. לשאר המחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

נתמך על ידי T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (נ.ט., נ.ו.ט., א.מ., ק.ק.ל.); R01 HL139158-01A1 ו-R01 HL071568-15 (N.V.T.); ג'ונס הופקינס ICTR תוכנית חוקרים קליניים (KL2) (A.M). כמה דמויות נוצרו עם BioRender.com.