סטנדרטיזציה ותחזוקה של תרבויות כבד כבד קנים ומעיים תלת-ממדיות לשימוש במחקר ביו-רפואי

שיטות ניסיוניות לקצור תאי גזע בוגרים ממעי כלבים ורקמות כבד כדי להקים תרביות אורגנויד 3D מתוארים. יתר על כן, טכניקות המעבדה כדי להבטיח צמיחה עקבית ולספק נהלי הפעלה סטנדרטיים כדי לקצור, biobank, ולהחיות תרבויות מעיים כלבים וכבד אורגנויד נדונים.

כלבים מפתחים מחלות רב-תכליתיות מורכבות המקבילות לבני אדם, כולל מחלות דלקתיות, מחלות מטבוליות וסרטן. לכן, הם מייצגים מודלים בעלי חיים גדולים רלוונטיים עם פוטנציאל תרגום לרפואה האנושית. אורגנוידים הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), מורכבים עצמית שמקורם בתאי גזע המחקים את המיקרואנטומיה והפיזיולוגיה של איבר המוצא שלהם. מודלים תרגומיים אלה במבחנה יכולים לשמש עבור יישומי חדירות וגילוי תרופות, הערכת טוקסיקולוגיה, וכדי לספק הבנה מכנית של הפתולוגיה של מחלות כרוניות רב-גורמיות. יתר על כן, אורגנוידים כלבים יכולים לשפר את חייהם של כלבים לוויה, מתן קלט בתחומים שונים של מחקר וטרינרי והקלה על יישומי טיפול מותאמים אישית ברפואה הווטרינרית. קבוצה קטנה של תורמים יכולה ליצור ביובנק של דגימות אורגנויד, מה שמפחית את הצורך בקצירת רקמות מתמשכת, שכן קווי תאים אורגנוידים יכולים להיות תת-תרבותיים ללא הגבלת זמן. להלן מוצגים שלושה פרוטוקולים המתמקדים בתרבות האורגנוידים של המעיים והכבד שמקורם בתאי גזע בוגרים. פרוטוקול בידוד אורגנויד כלבים מתאר שיטות לעיבוד רקמות והטבעה של התא מבודד במטריצה תומכת (מטריצת ממברנה חוץ-תאית solubilized). פרוטוקול התחזוקה של אורגנויד כלבים מתאר צמיחה ותחזוקה של אורגנוידים, כולל ניקוי והעברה יחד עם תזמון מתאים להתרחבות. פרוטוקול קצירת האורגנוידים והביו-בנקינג מתאר דרכים לחילוץ, הקפאה ושימור של אורגנוידים לניתוח נוסף.

מכרסמים הם המודל החייתי הנפוץ ביותר למחקר ביו-רפואי ^{ותרגום1}. הם שימושיים במיוחד לחקירת פתוגנזה מולקולרית בסיסית של המחלות, אם כי הרלוונטיות הקלינית שלהם למחלות רב-גורמיות כרוניות נחקרה ^{לאחרונה2}. מודל הכלבים מציג מספר יתרונות בהשוואה למכרסמים ^3,4. כלבים ובני אדם חולקים קווי דמיון במטבולומיקה ובמיקרוביום מעיים שהתפתחו עקב צריכת תזונה אנושית לאורך תקופות שונות של ביותם ^5,6,7. קווי דמיון בין אנטומיה ופיזיולוגיה של כלבים ופיזיולוגיה במערכת העיכול האנושית הם עוד אחת ^{הדוגמאות8}.

בנוסף, כלבים חולקים לעתים קרובות סביבות ואורח חיים דומים עם ^{בעליהם9}. תוחלת החיים הארוכה יותר של כלבים בהשוואה למכרסמים מאפשרת התפתחות טבעית של מצבים כרוניים ^רבים10. מחלות מעי דלקתיות או תסמונת מטבולית הן דוגמאות למחלות כרוניות רב-גורמיות החולקות קווי דמיון חשובים בין בני אדם לכלבים ^11,12. ניסויים פרה-קליניים של כלבים המערבים כלבים עם מחלות טבעיות יכולים להפיק נתונים אמינים יותר מאלה שנצברו ממודלים של ^{מכרסמים13}. עם זאת, כדי למזער את השימוש במחקר בבעלי חיים ולעמוד בעקרונות של 3Rs (להפחית, לעדן, להחליף)¹⁴, חלופות לבדיקות in vivo באמצעות אורגנוידים כלבים במבחנה 3D במבחנה ^{הופיעו15}.

אורגנוידים הם מבנים תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע תלת-ממדיים, אשר מסכמים מחדש את הפיזיולוגיה והמיקרואנטומיה של האיברים המקוריים ^{שלהם16,17}. טכנולוגיה זו תוארה לראשונה על ידי סאטו ואח ' בשנת ²⁰⁰⁹¹⁷ ואפשרה מחקרי הפריה חוץ גופית הניתנים לתרגום יותר בשורות תאי אפיתל מאשר היו אפשריים בעבר באמצעות תרביות תאים סרטניים 2D18,19,20. Organoids הם שימושיים במבחנה מודלים במבחנה בדיסציפלינות ביו-רפואיות רבות כגון טוקסיקולוגיה פרה קלינית21,22,23, ספיגה, או מחקרי חילוף חומרים24,25,26,27,28, כמו גם בגישות רפואיות מותאמות אישית29,30,31 . התרבות המוצלחת של אורגנוידים במעיים של כלבים תוארה לראשונה בשנת ²⁰¹⁹¹², ואילו אורגנוידים כבדיים שמקורם בכלב דווחו לראשונה על ידי Nantasanti ואח 'בשנת 201532. אורגנוידים כלבים שימשו מאז בהצלחה במחקרים לחקור enteropathies כרונית כלבים, גידולים סטרומליים במערכת העיכול, אדנוקרצינומה המעי ^הגס12, ומחלת ^{וילסון33,34}.

בעוד תאי גזע בוגרים ניתן לקצור באמצעות נמקים, הטכנולוגיה organoid לא תמיד דורש הקרבה של בעלי החיים. ביופסיות אנדוסקופיות ולפרוסקופיות, או אפילו שאיפות מחט עדינות של ^{איברים35}, הן מקור בר קיימא של תאי גזע בוגרים לבידוד אורגנויד ^אפיתל12. שימוש נרחב בטכניקות לא פולשניות כאלה בפרקטיקה הווטרינרית מקל על אפשרויות למחקר תרגומי הפוך (תרגום מידע מהפרקטיקה הקלינית הווטרינרית לפרקטיקה הקלינית האנושית ולהיפך)¹⁵. התקדמות נוספת של טכנולוגיית organoid ניתן להבטיח על ידי סטנדרטיזציה של תרבות organoid ושיטות תחזוקה. פרוטוקול האורגנויד המוצג כאן מבוסס בחלקו על עבודה שפורסמה בעבר של סקסנה ואח 'משנת ²⁰¹⁵³⁶, ושיטות הותאמו כדי להתאים לפרטים של תרבות האורגנויד של המעיים והכבד. זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקולי האורגנוידים של הכלבים מתוארת באיור 1.

פרוטוקול בידוד אורגנויד כלבים מציג שיטות להשגת דגימות מביופסיות אנדוסקופיות, לפרוסקופיות וניתוחיות, כמו גם נמקים. הוא מתאר את הטיפול הראשוני של דגימות רקמות ומתודולוגיות המשמשות להובלה למעבדה. החומרים והריאגנטים הדרושים לבידוד אורגנויד מסוכמים בסעיף 'הכנה לבידוד'. התהליך של בידוד תאי גזע בוגרים מדגימות רקמה מתואר עוד יותר בפירוט. לבסוף, תהליך ציפוי organoids לתוך מבנים דמויי כיפה באמצעות מטריצת ממברנה חוץ תאית solubilized נדון.

הפרוטוקול השני, פרוטוקול תחזוקת אורגנויד כלבים, מתאר שיטות של תיעוד ו culturing organoids. שינויים במדיה ותדירותם נדונים בסעיף זה. יתר על כן, מתוארים נהלי המעבדה כגון מעבר וניקוי תרביות התאים, החיוניים כדי להבטיח תחזוקה מוצלחת של אורגנוידים של כלבים תלת-ממדיים. מעבר מתאים הוא צעד קריטי בפרוטוקול, והתאמות אפשריות ופתרון בעיות של שלב זה נדונות בהמשך בכתב היד.

הפרוטוקול האחרון הוא קצירת אורגנויד כלבים ופרוטוקול ביובנקינג המכיל שיטות להכנת אורגנוידים בוגרים להטמעת פרפין ושימור RNA. שיטות של דגימות אורגנויד biobanking באחסון חנקן נוזלי מתוארים גם כאן. לבסוף, נדונות הדרכים להפשיר דגימות קפואות ולתמוך בצמיחתן.

לסיכום, מאמר זה נועד לספק נהלי תרבות אורגנויד כלבים עקביים באמצעות סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין מעבדות. בעשותו כן, כתב היד נועד להקל על שחזור של נתונים הנגזרים ממודלים אורגנוידים כלבים כדי להגביר את הרלוונטיות שלהם במחקר ביו-רפואי תרגומי.

איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקולי אורגנויד כלבים. פרוטוקול בידוד האורגנויד הכלבי מתאר את הכנת החומרים הדרושים לבידוד אורגנויד, קצירת דגימת רקמה (באמצעות נמקים, אנדוסקופיים, לפרוסקופיים וביופסיות כירורגיות), והדרכה על פירוק תאים וציפוי של האוכלוסייה התאית. פרוטוקול התחזוקה של האורגנויד הכלבים דן בניקוי והעברה של תרבות האורגנויד. פרוטוקול קצירת אורגנויד וביו-בנקינג דן בהכנת דגימות אורגנויד להטמעת פרפין ואפיון אורגנויד נוסף. שיטות לביו-בנק תרביות אורגנויד והחיות אותן מאחסון בחנקן נוזלי נדונות גם הן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

המחקר אושר ובוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת איווה סטייט (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).

הערה: הסעיף הבא (שלבים 1-3) מתאר את פרוטוקול בידוד האורגנויד הכלבי.

1. הכנה לבידוד

1. צינורות הובלה: לפני בידוד אורגנויד (בדרך כלל 24 שעות לפני), מלא צינור חרוטי של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של תערובת עיט בינוני/תזונתי שונה של Dulbecco F-12 (DMEM/F12 מתקדם) מועשר ב-0.2 מ"ל של סטרפטוקוקוס עט.
2. לביופסיות לפרוסקופיות, חותכות או excisional, הכינו שלוש צינורות חרוטיים נוספים של 50 מ"ל. מלא צינורות אלה עם 10 מ"ל של פתרון כלאט מלא (1x CCS; ראה טבלה 1).
   הערה: עבור שלב 1.2, 2 mM N-Acetylcysteine (NAC) ב פוספט חוצץ מלוחים (PBS) יכול לשמש גם כפתרון מסורתי המשמש לקציר תאי גזע. לא נצפו הבדלים בעת שימוש 1x CCS או NAC ב- PBS. שני הפתרונות מתווספים לשחרור תאים בפתרון.
3. שמור את הצינורות ב 4 °C (60 °F) לילה ולהעביר את הצינורות על קרח למשך שארית הפרוטוקול.
4. הכינו חמישה צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל עם 5 מ"ל של 1x CCS, צינור צנטריפוגה אחד 15 מ"ל עם 3 מ"ל של 1x CCS, צינור צנטריפוגה ריק אחד 15 מ"ל (צינור supernatant), וצינור צנטריפוגה אחד 15 מ"ל עם 5 מ"ל של 1x CCS ו 2 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS).
   הערה: ניתן להכין את האמור לעיל לפני יום הבידוד אם יעובדו דגימות מרובות. להמחשה, ראו את פריסת צינור הבידוד באיור 2.
5. ביום הבידוד, הכינו צלחת פטרי, אזמל, דלי קרח ו-DMEM/F12 מתקדם קר בארון הבטיחות הביולוגית. מניחים את המספר הנדרש של לוחות תרבית תאים של 24 בארות באינקובטור (37 °C (37 °C (5° פרנהייט; 5% _CO2 אטמוספרה) כדי להתחמם מראש.
6. מניחים מטריצת ממברנה חוץ-תאית סולובית (ECM; ראה טבלת חומרים) על קרח כדי להתחיל להפשיר.
   הערה: שקיעה בקרח מגנה מפני הפשרה מהירה ומסייעת במניעת התגבשות. קופסה של טיפים פיפטה ניתן להציב במקפיא כדי לסייע ציפוי ECM solubilized.
7. פרצ'יל צנטריפוגה עד 4 מעלות צלזיוס.
8. העבר מדיה מלאה עם גורמי גדילה "CMGF +" או "מדיה אורגנויד" (ראה טבלה 1 להרכב) מהמקפיא / המקרר לאמבט מים של 37 °C (37 °F). יש להימנע מחשיפה ישירה לאור במידת האפשר.

איור 2: פריסת צינור בידוד. ההתקנה המומלצת לקצירת רקמות כוללת 10 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם ו-0.2 מ"ל של סטרפטוקוקוס של עט בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. בנוסף, שלושה צינורות 50 מ"ל מלא 10 מ"ל של 1x CCS נדרשים ביופסיות כירורגיות או נמקים. פריסת צינור מומלצת עבור צעדי בידוד כוללת חמישה צינורות המכילים 5 מ"ל של 1x CCS לשימוש במהלך שלבי שטיפה CCS CCS. הצינור הראשון משמש צינור מדגם המכיל את הרקמה הטחונה, ואת הצינורות הנותרים לשמש מאגרים של 1x CCS שיתווספו לצינור הראשון. הצינור השישי מכיל 3 מ"ל של 1x CCS לשטיפת הרקמה הנותרת מצינור הדגימה בעת העברה לצלחת של 6 בארות. ששת הצינורות האלה ישמשו לפני שלב הדגירה של EDTA. צינור עם 5 מ"ל של 1x CCS ו 2 מ"ל של FBS משמש צינור מדגם לאחר דגירה EDTA, ו supernatant מצינור זה מועבר עם תאי גזע לתוך צינור ריק למשך שארית הבידוד. יש לשמור על צינורות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני תחילת הבידוד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. קצירת רקמות

1. ניתן לרכוש ביופסיות אנדוסקופיות מעיים ולפרוסקופיות (קוטר 2.8 מ"מ) באמצעות מלקחיים ביופסיים גדולים. קציר לפחות שמונה דגימות אנדוסקופיות לכל אתר מעיים.
2. לאסוף דגימות ישירות לתוך צינורות תחבורה ולהניח אותם על קרח.
3. עבור ביופסיות כירורגיות ונמקים, חתיכות רקמת קציר עם גודל של 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ ומניחים אותם בצינור CCS 1x הראשון.
   הערה: עבור ביופסיות מעיים, להסיר את כל תכולת המעיים הנותרת ולגרד את שכבת הרירית עם אזמל כדי להסיר villi. אם הדגימות בשפע, ניתן לאסוף ביופסיות נוספות בקריוביות המכילות ריאגנט אחסון RNA (1 מ"ל) או מוטבע פרפין להשוואה עתידית בין organoids לבין רקמת המקור שלהם. במקרה של נטילת ביופסיות לניתוח TEM, לא לגרד את villi ולאחסן מדגם בחומר משמר (3% paraformaldehyde ו 3% glutaraldehyde ב תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)) ולאחסן ב 4 °C (4 °C (60 °F500).
4. לנער את צינור CCS 1x במרץ עבור ~ 30 s, ולאחר מכן להעביר את המדגם לצינור CCS 1x חדש באמצעות מלקחיים. חזור על תהליך זה פעמיים.
5. העבר את הדגימה מצינור CCS 1x האחרון לצינור התחבורה (DMEM / F12 + סטרפטוקוקוס עט מתקדם) והחזר את הדגימה למעבדה.
   הערה: דגימות שטופלו מראש בדרך זו יכולות להישלח גם במהלך הלילה על קרח (לא לשלוח על קרח יבש).

3. בידוד אורגנויד

הערה: בצע בידוד באמצעות טכניקות אספטיות בארון בטיחות ביולוגית. ראו איור 3 לזרימת עבודה של בידוד אורגנויד כלבים.

1. לנער דגימת רקמה בצינור התחבורה עבור ~ 30 s ולהסיר supernatant מוגזם עד שיש 0.5 מ"ל נשאר בצינור על ידי צנרת איטית ליד פני הנוזל. הקפד לא להשליך שום רקמה.
2. מעבירים רקמות ונשארים סופר-טבעיים לצלחת פטרי סטרילית. באמצעות אזמל חד פעמי (או מלקחיים מעוקרים ומספריים), לחתוך ולטחון את הרקמה לחתיכות קטנות יותר (בגודל של 1 מ"^מ2) הדומה עקביות מחית במשך כ 5 דקות.
3. צנרת רקמה טחונה עם נוזל מצלחת פטרי לצינור CCS הראשון. הוסיפו 2 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם לצלחת הפטרי, שטפו את הרקמה הנותרת והעבירו לצינור ה-CCS הראשון.
4. מערבולת צינור CCS 1x עבור 5 s כחמש פעמים. אפשר ביופסיות להתיישב לתחתית צינור 15 מ"ל (כ 1 דקה) ולהסיר את supernatant עד שיש 5 מ"ל עזב בצינור. העבר את 1x CCS מהצינור החדש לצינור המדגם.
5. חזור על השלב הקודם עבור שני הצינורות הבאים. על שתי השטיפות האחרונות, להסיר את supernatant עד 3 מ"ל נשאר בצינור.
6. מעבירים את הביופסיות ואת 1x CCS מצינור המדגם לבאר אחת של צלחת 6 באר. לאחר מכן, להוסיף 3 מ"ל של 1x CCS לצינור המדגם, בעדינות לסובב כדי לאסוף את כל הרקמה הנותרת, ולהעביר לאותה באר של הצלחת.
7. הוסף 150 μL של 0.5 M EDTA (כדי להשיג נפח כולל של 6.15 מ"ל בבאר). מניחים את צלחת 6-well על 20°, 24 סל"ד מיקסר אגוזים / רוקר ב 4 °C (6 °F). לדגור על דגימות הכבד במשך 10 דקות ואת דגימות המעיים במשך 1 שעות על נדנדה נעה.
8. העבר את לוחית 6 הבארות בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית. מעבירים רקמה טחונה ונוזל לצינור CCS/ FBS 1x ומאפשרים לרקמות להתיישב. להעביר את supernatant (חלק זה כולל כעת תאי גזע חופשיים) וכ 0.2 מ"ל של החלק העליון של הרקמה אל הצינור הריק.
9. לסובב את הצינור המכיל את המדגם (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). תאי גזע הם עכשיו גלולה יחד עם הרקמה הטחונה. הסר ולהשליך את supernatant בזהירות כדי לא להפריע את הכדור.
10. Resuspend את הכדור ב DMEM מתקדם / F12 ולסובב את הצינור שוב (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). לשאוף את supernatant ולא להפריע את הכדור.
11. חשב את הנפח של ECM solubilized הדרוש עבור זריעת התאים והרקמות מנותקים. השתמש 30 μL של ECM solubilized לבאר של צלחת 24-well כדי להשיג צפיפות זריעה נכונה.
    הערה: הטמע דגימה לאחר בידוד ב-4 עד 6 בארות של צלחת של 24 בארות (כלומר, בהתבסס על כמות הרקמה הטחונה במדגם).
12. הוסף את הנפח המחושב של ECM solubilized לצינור המדגם ולאט לאט פיפטה למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות של בועות. זרע את ההשעיה באמצע הבארות, כך ECM solubilized יכול ליצור מבנה דמוי כיפה.
    הערה: שימוש בעצות פיפטה ממקפיא של מינוס 20 °C (60 °F) מסייע בציפוי ECM solubilized. אם נתחי הרקמות גדולים יותר מקצה פיפטה P200, השתמשו בטיפים קרים רחבים או טיפים קרים לחתוך P1000 כדי לסייע בציפוי. שמור את המדגם עם ECM solubilized על קרח במידת האפשר.
13. להעביר את הצלחת לאינקובטור (37 °C (37 °C (5% _CO2 ) ולאפשר ECM solubilized להתמצק במשך ~ 30 דקות.
14. מערבבים מעכבי ROCK ו- GSK3β ב- CMGF + (ריכוזים בטבלה 1). הוסף 500 μL של פתרון זה (CMGF + R /G) לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C ;5% _CO2 אטמוספרה).

איור 3: זרימת עבודה של בידוד אורגנויד כלבים. דגימת הרקמה שנקטפה מועברת לצלחת פטרי וטחונה כראוי. לאחר מכן המדגם מועבר לצינור CCS 1x, וצעדי הכביסה מבוצעים. עבור הדגירה EDTA בלוח 6-well, המדגם מועבר לאחר מכן צינור המכיל 1x CCS ו- FBS. לאחר הרקמה מתיישבת, supernatant עם כמות קטנה של רקמה מועבר צינור ריק. כתוצאה מכך המדגם הוא סובב, supernatant מוסר, ואת הכדור הוא resuspended ב DMEM מתקדם / F12. הצינור הוא הסתובב שוב, ואת supernatant הוא שאפתן ונזרק. ECM Solubilized מתווסף לצינור, מעורבב, ואת המדגם מצופה צלחת 24-well. כתוצאה מכך הדגירה של הצלחת (37 °C (37 °C (5% _CO2 ) במשך 30 דקות, ומדיה מתווספת לאחר מכן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: הסעיף הבא (שלבים 4 ו-5) מתאר את פרוטוקול התחזוקה של אורגנויד כלבים. שנה מדיה על פי טבלה 2 ובדוק את organoids מדי יום עבור סימנים של אפופטוזיס, זיהום, צפיפות יתר, וניתוק של ECM solubilized. הערות יומיות חייבות להילקח על פי איור 4 כדי לעקוב במדויק אחר התנאים וההשפעות הניסיוניות על התרבויות. ראה טבלה משלימה 1 לקבלת תבנית המאפשרת רישום הערות מדויק וניתן לשחזור הקשור לתרבות האורגנויד. עבור organoids כבד, להשתמש CMGF + משופר עם מעכבי ROCK ו GSK3β.

איור 4: מדריך גודל וצפיפות אורגנויד. (A) תרשים גודל אורגנויד למעקב מדויק אחר צמיחת האורגנויד. מדריך שינוי הגודל כולל קטגוריות קטנות במיוחד (XS), קטגוריות קטנות (S), בינוניות (M), גדולות (L) וקטגוריות גדולות במיוחד (XL). (B) מדריך הצפיפות מורכב מצפיפות נמוכה מאוד (VLD), צפיפות נמוכה (LD), צפיפות בינונית (MD), צפיפות גבוהה (HD) וקטגוריות צפיפות גבוהה מאוד (VHD). (ג) תמונות מייצגות של זיהום חיידקי ופטריות של דגימת האורגנויד. (D) תמונות מייצגות של צפיפות יתר אורגנויד ואפופטוזיס. ההגדלה האובייקטיבית מצוינת בכל חלונית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 2: המלצה לשינוי מדיה. ציר זמן מומלץ של שינוי מדיה שבועי. מדיה (500 μL של CMGF + עבור organoids מעיים, או 500 μL של CMGF + R / G עבור organoids כבד) מומלץ לשנות כל יומיים. כדי להסביר את השעות הנוספות בסוף השבוע, 750 μL של מדיה מתווסף בימי שישי אחר הצהריים, עם התקשורת מתרעננת בימי שני בבוקר.

4. ניקוי אורגנויד

הערה: ניקוי אורגנויד או מעבר חייב להתבצע באופן קבוע כדי לשמור על הבריאות של תרבות האורגנויד. בצע את הליך הניקוי בכל פעם אפופטוזיס בתרבות, נוכחות של פסולת, צפיפות יתר של organoids, או ניתוק של ECM solubilized הוא הבחין. עיין באיור 4D.

1. הסר את המדיה מן הבארות תוך הטיית הצלחת כדי למנוע הרס של ECM solubilized.
   הערה: אם ניתוק ECM solubilized הוא ניכר, מומלץ להעביר את המדיה לצינור 15 מ"ל כדי למנוע אובדן שברים של ECM solubilized המכיל את המדגם.
2. הוסיפו 0.5 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם מראש לכל באר כדי להמיס את כיפות המטריצה על ידי צינורות חוזרים ונשנים באמצעות קצה P1000 (הימנעו מיצירת בועות מוגזמות). מעבירים את המטריצה המומסת המכילה אורגנויד לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח ואם הנפח נמוך מ 6 מ"ל, לאט למלא את הצינור עם מתקדם DMEM / F12 כדי להגיע לנפח כולל של 6 מ"ל.
3. לסובב את הצינור (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F)) ולהסיר את כל supernatant תוך הקפדה לא להפריע את הכדור.
4. הוסף את הנפח הנדרש של ECM solubilized (30 μL לבאר כדי להשיג צפיפות זריעה נכונה) ולאט לאט resuspend את הכדור על ידי ערבוב פיפטה. צלחת ההשעיה באמצע צלחת 24-well כדי ליצור כיפה.
5. מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C (5% _CO2 ) במשך ~ 30 דקות, ולאחר מכן מוסיפים את נפח המדיה המתאים (טבלה 2).

5. מעבר אורגנואידים

הערה: Passaging מבוצע בדרך כלל 5-7 ימים לאחר התרבות הראשונית כדי להרחיב את קו התא האורגנויד. תרבויות אורגנויד בדרך כלל ניתן להרחיב ביחס 1:3. באיור 4 ניתן לראות תמונות של תרבויות בריאות המוכנות למעבר. אורגנוידים צריכים להיות לפחות בינוניים בגודלם.

1. בצע שלבים 4.1 עד 4.3.
2. הסר את supernatant משאיר 0.5 מ"ל בצינור. הקפד לא להפריע לכדור.
3. הוסיפו 0.5 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין (ראו טבלת חומרים), ערבבו כראוי על ידי שאיפה עם פיפטה ודגרו באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (אורגנוידים מעיים דגירה במשך 8 דקות או אורגנוידים כבדיים למשך 10 דקות). המשך לערבב את הפתרון על ידי הבהוב הצינור מספר פעמים בנקודת המחצית של הדגירה.
4. הזיזו את הצינור המכיל את הדגימה בחזרה לארון בטיחות ביולוגית והוסיפו באיטיות 6 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם מראש כדי להשבית פרוטאז דמוי טריפסין ולעצור את הדיסוציאציה של התאים.
5. לסובב את הצינור (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F)) ולהסיר את supernatant. הקפד לא להפריע לכדור.
6. בצע שלבים 4.4. ו-4.5.
   הערה: הסעיף הבא (שלבים 6-9) מתאר קצירת אורגנויד ופרוטוקול ביו-בנקאות. תרביות אורגנויד צריכות להיות נקיות מרקמה שהוסרה במהלך קטעים קודמים. תרבויות צריכות להיות גם בריאות, לפחות גדולות בגודלן, ובינוניות עד גבוהות בצפיפות. באיור 4 ניתן לראות תמונות של תרבויות בריאות המוכנות ליישומים במורד הזרם. מעבר במורד הזרם עם שימור וקצירה של תרביות אורגנויד תת-אופטימליות יכול להשפיע לרעה על תוצאות האפיון ועל הכדאיות של הביובנק. סקור את פריסת הלוחות המומלצת של 24 בארות באיור 5.

איור 5: פריסת לוחות מומלצת של 24 בארות. הפריסה המומלצת של צלחת 24-well לאפיון בסיסי לאחר הרחבת תרבות האורגנויד. הטמעת פרפין של שש בארות (אורגנוידים בינוניים עד גדולים בצפיפות בינונית עד גבוהה) תאפשר בדרך כלל ריכוז גבוה של אורגנוידים בבלוק היסטולוגיה. ארבע בארות של organoids ניתן לאגד אחד cryovial עם ריאגנט אחסון RNA עבור יישומים במורד הזרם. 14 בארות משמשות לביו-בנקינג של דגימות האורגנויד ומספקות חומר לעד שבעה בקבוקונים שמורים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. קיבעון של אורגנוידים

1. הסר את המדיה מהבאר והקפידו לא להפריע לכיפת ECM המופרכת.
2. הוסף 500 μL של פורמלין-אצטית חומצה-אלכוהול פתרון המשמש כקיבוע (FAA; קומפוזיציה בטבלה 1).
3. יש לאחסן אורגנוידים בטמפרטורת החדר. לאחר 24 שעות, שאפו FAA ומלאו את הבאר ב-70% אתנול. עטפו צלחות עם סרט צילום גמיש במעבדה (ראה טבלת חומרים) כדי למנוע אידוי מהיר. האורגנוידים מוכנים כעת להטמעת פרפין. הטמעת הפרפין של תרבות האורגנויד מתבצעת בתבניות בסיס מתכת מסורתיות.

7. שימור רנ"א

1. הסר את המדיה מהבארות והקפידו לא להפריע לכיפת ECM המופרכת.
2. יש להשתמש ב-0.5 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם מראש לבאר כדי להמיס כיפות ECM מוזלות על-ידי צנרת חוזרת ונשנית למעלה ולמטה (הימנעו מיצירת בועות מוגזמות). מעבירים את האורגנוידים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח ואם נפח נמוך מ 6 מ"ל, לאט למלא את הצינור עם מתקדם DMEM / F12 כדי להגיע 6 מ"ל של נפח כולל.
3. לסובב את הצינור (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F)) ולהסיר את כל supernatant. הקפד לא להפריע לכדור.
4. הוסף 100 μL של PBS לצינור המדגם ו resuspend את הכדור על ידי צינורות עדינים. העבר את התוכן של צינור המדגם להקפאה.
5. הוסף 900 μL של ריאגנט אחסון RNA (ראה טבלת חומרים) לצינור מדגם ולערבב כדי לאסוף את כל organoids הנותרים. העבר את שאריות האורגנוידים האלה לקריוביאל ואחסן אותם בטמפרטורה של -80 °C (בדרך כלל ארבע בארות המאוגדות להקפאה אחת יספיקו ליישומים במורד הזרם, כולל qPCR ורצף RNA).
   הערה: קריוביליה אחת מייצרת בדרך כלל סך של 4,000 ננוגרם של RNA (נמדד באמצעות ניתוח ספקטרופוטומטר).

8. בנקאות ביולוגית אורגנויד

הערה: Biobanking מתרחשת בדרך כלל 3-4 ימים לאחר המעבר. הסימנים של אפופטוזיס לא צריך להיות נוכח בתרבות לבצע שיטה זו. עיין באיור 4 כדי להתייחס לגודל ולצפיפות המתאימים להקפאה. אורגנוידים בינוניים עד גדולים במיוחד בצפיפות בינונית עד גבוהה מאוד. שלב הקפאת חירום ניתן לעקוב אם קו תא organoid הוא נדיר במיוחד או כדאיות נוספת אינה מובטחת. בצע את אותם שלבים עבור biobanking organoid רגיל (שלבים 8.1 עד 8.4). הקפאת חירום נעשית עם תרבויות קטנות וצפופות פחות. בריכה כמו בארות רבות של organoids גידול לתוך cryovial אחד בעקבות שלבים 8.1 עד 8.4. זכור כי מספר מספיק של organoids חייב להישמר בחיים בניסיון להרחיב את התרבות (הקפאת חירום היא פשוט הליך גיבוי כדי להגן מפני אובדן אפשרי של תרבות באמצעות זיהום או אירועים בלתי צפויים אחרים).

1. בצע את השלבים 7.1 עד 7.3.
2. הוסף 1 מ"ל של מדיה קפואה לכל cryovial (הרכב בטבלה 1) לצינור מדגם בעדינות resuspenned את הכדור על ידי צינור למעלה ולמטה.
3. מעבירים 1 מ"ל של הפתרון לקריוביאלי אחד (יחס של שתי בארות / קריוביאל) ושומרים את הקריוביאלים על הקרח.
4. מעבירים את הקריוביאלים מקרח למיכל מקפיא (ממלאים באופן קבוע את המאגר באיזופרופנול) ומעבירים מיד למינוס 80 מעלות צלזיוס. העבר את הדגימות לחנקן נוזלי (-196 °C ((196 °F) לאחסון לטווח ארוך לאחר 24 שעות.
   הערה: ניתן להשתמש גם במיכל הקפאת תאים ללא אלכוהול במקום במיכל מסורתי. ודא שהדגימות אינן מפשירות במהלך ההובלה מ-80 °C (80 °F) לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך. הפשרה חוזרת ומפחיתה את הכדאיות של תרבית התא.

9. תחייה מאחסון חנקן נוזלי

הערה: כאשר בוחרים להפשיר קו אורגנויד, יש להקפיא מחדש תת-קבוצה של האורגנוידים המחודשים ולהחליף אותה בביובנק במהירות האפשרית לפחות בקריוביאל אחד (רצוי יותר).

1. מניחים ECM solubilized על קרח כדי להפשיר לאט, לשים צלחת 24-well בחממה (37 °C (37 °C (37 °C (5% אטמוספירה _CO2 ), ולהכין את הריאגנטים הנדרשים כגון צינור 15 מ"ל ו DMEM / F12 מתקדם.
2. לשחזר cryovial המכיל דגימת organoid מאחסון חנקן נוזלי ולהעביר אותו מיד לאמבטיית חום (37 °C (37 °F) במשך 2 דקות.
3. מעבירים את תכולת ההקפאה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. הוסף לאט לאט DMEM/F12 מתקדם מראש כדי להגיע לנפח כולל של 6 מ"ל.
4. לסובב את הצינור (700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F). הסר את supernatant ולוודא לא להפריע את הכדור.
5. הוסף 180 μL (30 μL לבאר) של ECM solubilized לכדור ולצלחת ההשעיה הזאת בצלחת 24-well מחומם מראש. ניתן לצפות קריוביאלית אחת לשש בארות של צלחת של 24 בארות.
6. מניחים את הצלחת 24-well בחממה (37 °C (37 °C (5% _CO2 אווירה) במשך ~ 30 דקות ולהוסיף CMGF + R / G (עבור organoids מעיים, לעבור CMGF + ב 24 עד 48 שעות).
   הערה: כאשר מדגם הוא מצופה וגדל בצלחת 24-well, זה חייב להיות מותר להתאושש לפחות 2 ימים לפני עובר כדי להגביר את הכדאיות.

פרוטוקול אורגנויד כלב בדרך כלל מייצר ~ 50,000 ~ 150,000 תאי מעיים או כבד לכל באר של צלחת 24-well. אורגנוידים מייצגים ניתן לראות באיור 6.

איור 6: תמונות מייצגות של אורגנוידים של כלבים. תמונות של אורגנוידים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה מתוארים. (א,ב) אורגנוידים במעיים שמקורם בתריסריון (נלקחים בהגדלה אובייקטיבית של פי 10 ו-5). שימו לב לנוכחותם של אורגנואידים ישנים יותר וספרואידים צעירים יותר. (ג,ד) אנטרואידים של כלבים מהחלק התחתון של הג'ג'ונום (נלקחים בהגדלה אובייקטיבית של פי 10 ו-20). (ה,פ) Enteroids Ileal (נלקח בהגדלה אובייקטיבית 20x ו 5x), ו (G,H) קולואידים (נלקח בהגדלה אובייקטיבית 10x). (I) תמונה מייצגת של אורגנוידים כבדיים שנלקחו בהגדלה אובייקטיבית של פי 20. רוב האורגנוידים הם בצורת הניצנים שלהם. כדורי כבד צעירים יותר ניתן לראות גם בתמונה. (J) תמונה מייצגת המציגה אורגנויד נדיר היוצר מבנה דמוי צינור (נלקח בהגדלה אובייקטיבית של פי 10). סרגל קנה מידה (500 מיקרומטר) נמצא בפינה הימנית העליונה של כל תמונה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Enteroids ו קולונואידים נגזר באמצעות פרוטוקול זה אופיינו בעבר על ידי Chandra et al. בשנת 201912. אורגנוידים במעיים של כלבים מורכבים מאוכלוסייה תאית קבועה של אפיתל המעי. באמצעות RNA בהכלאה במקום, הביטוי של סמנים ביולוגיים של תאי גזע (חזרה עשירה בלאוצין המכילה קולטן G מצמיד חלבון G 5 - LGR5 ו- SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), סמנים ביולוגיים של תא פאנת ' (אפרין סוג B קולטן 2 - EPHB2), סמני תאי אפיתל ספיגה (פוספטאז אלקליין - ALP) וסמן אנטרואנדוקריני (Neurogenin-3 - Neuro G3)¹² אושר. כתמי כחול אלקיאן בוצעו על שקופיות מוטבעות פרפין כדי לאשר את נוכחותם של תאי גביע. בנוסף, בדיקות פונקציונליות כגון הדמיה מטבולית אופטית (OMI) או סיסטיק פיברוזיס transmembrane מוליכות וסת (CFTR) בדיקת נפיחות בוצעו כדי לאשר את הפעילות המטבולית של organoids. אורגנוידים של כלבים שאובחנו עם מחלות מעי דלקתיות, גידולים סטרומיים במערכת העיכול (GIST), או אדנוקרצינומה המעי הגס היו מבודדים גם באמצעות פרוטוקול ^זה12.

לאחר בידוד תאי גזע, אורגנוידים כלבים בכבד מתחילים את מחזור החיים שלהם כמו כדוריות מתרחבות, ולאחר ~ 7 ימים, הם הופכים ניצנים ובידול organoids. כדורי כבד כלבים מבודדים ומתורבתים על פי פרוטוקול זה נמדדו כדי לכמת את צמיחתם ולקבוע את הזמן האידיאלי למעבר. כדוריות שמקורן בביופסיות כבד לפרוסקופיות של כלבים בוגרים בריאים (n = 7) נמדדו במהלך 7 ימי התרבות הראשונים שלהם. תמונות מייצגות צולמו, והרדיוס האורך (א) והאלכסוני (ב) של הספרואידים (n = 845) נמדד ברחבי התרבות. אמצעי האחסון (V), שטח הפנים (P), אזור האליפסה הדו-ממדית (A) וההיקף (C) של הספרואידים חושבו. החישובים והתוצאות של הניסוי מסוכמים באיור 7. אזור אליפסה דו-ממדי והיקפו שימשו להערכת בריאותה של תרבית האורגנויד באמצעות מיקרוסקופיה קלה. ערכים אלה יכולים לשמש כמדריך להחלטות תחזוקת תרבות.

בקצרה, כדוריות התרחבו במהירות בנפח, בשטח הפנים, באזור האליפסה הדו-ממדית ובהיקף. נתוני המדידה משבעת הביגלים נמדדו בממוצע עבור החישובים הבאים. הנפח גדל ב-479% (±6%) מהיום השני ל-3. במקביל, שטח הפנים של הספרואידים ושטח האליפסה הדו-ממדית גדלו ב-211% (±208%) וב-209% (±198%), בהתאמה. היקף האליפסה הדו-ממדית עלה מיום 2 ל-3 ב-73% (±57%). העלייה בנפח הכולל של אורגנוידים בכבד מימים 2-7 הייתה יותר מ 365 פעמים, שטח הפנים ואזור אליפסה 2D גדל 49 פעמים, והיקף אליפסה 2D גדל שש פעמים.

לאחר מכן, כדוריות שמקורן בשתי דגימות כלבים בוגרות גדלו עוד יותר לאחר המעבר ונאספו מדי יום (יום 2-7) עבור RNA בהכלאה במקום (RNA ISH). בדיקות כלבים תוכננו (רשימת הבדיקות מסופקת כטבלה משלימה 2), וביטוי mRNA הוערך עבור סמני תאי גזע (LGR5), סמנים ספציפיים עבור כולנגיוציטים (ציטוקרטין 7 - KRT-7, ואקופורין 1 - AQP1), כמו גם סמני הפטוציטים (חלבון תיבת מזלג A1 - FOXA1; וציטוכרום P450 3A12 - CYP3A12). ביטוי הסמנים נבחן באופן חצי כמותי (תמונות מייצגות באיור 8). Spheroids העדיף לבטא את סמן cholangiocyte KRT-7 הנע בין 1% ל 26% באזור האות / שטח הכולל של תאים. AQP1 לא בא לידי ביטוי בדגימות organoid, ניתן לטעון כי נוכחותו בדגימות כבד כלבים הוא דליל. ביטוי סמן תא הגזע (LGR5) נע בין 0.17% ל-0.78%, ואילו סמני הפטוציטים באו לידי ביטוי במידה נמוכה יותר ב-0.05%-0.34% עבור FOXA1 ו-0.03%-0.28% עבור CYP3A12.

איור 7: מדידות כדוריות כבד. (א) צמיחת כדורי הכבד נצפתה מדי יום של תרבויות מהיום 2-7. כדוריות נוצרו לראשונה ביום השני, והספרואידים האחרונים התחילו את תהליך הניצנים ביום 7. ניסוי מאוחר יותר השתמש בשני קווים אורגנויד כלבים לאחר המעבר כדי לקצור כדוריות כל יום עבור פרפין-embedding לבצע RNA ISH (תמונת יום 2 צולמה ב 40x, יום 6 תמונה ב 10x, ואת שאר התמונות צולמו בהגדלה 20x). (B) אשכול כדורי כבד מוצג מחובר נתח רקמה מוטבע ECM solubilized 4 ימים לאחר הבידוד. רדיוס אורך ואלכסון של הספרואידים נמדדו (התמונה צולמה ב 10x). החלונית (C) מתארת את הנוסחה המשמשת לחישובים להפקת אמצעי אחסון (V), שטח פנים (P), אזור אליפסה דו-ממדי (A) והיקף (C). עבור חישובים אלה, ההנחה הייתה כי כדורי כבד כלבים הם כדוריות אידיאליות. תוצאות המדידות של נפח כדורי הכבד, שטח הפנים, אזור האליפסה הדו-ממדית והיקף האליפסה הדו-ממדית לימים בודדים של צמיחה מתוארות בלוח (D). קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM). (E) ביטוי mRNA של KRT-7, LGR5, FOXA1 ו- CYP3A12 נמדדו בדגימות של כדורי כבד כלבים לאחר המעבר של היום 2 עד יום 7. AQP1 לא בא לידי ביטוי בדגימות אלה. סרגל קנה מידה (5x: 500 מיקרומטר; 10x: 200 מיקרומטר; 20x: 100 מיקרומטר; 40x: 50 מיקרומטר) נמצא בפינה השמאלית העליונה של כל תמונה. ההגדלה האובייקטיבית נרשמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אורגנוידים לעתים רחוקות לא ייפרדו במהלך תהליך המעבר בעקבות טכניקה סטנדרטית זו. אם הדיסוציאציה אינה מתרחשת, ניתן להתאים את זמני המעבר כדי להשיג התפוררות אופטימלית של אשכול התאים. עם זאת, חשיפה ממושכת פרוטאז דמוי טריפסין יכול להשפיע לרעה על הצמיחה של organoids. אורגנוידים כבדיים שימשו בניסוי שלאחר מכן כדי לחקור את זמן הניתוק האופטימלי וליצור שיטת מעבר נכונה. בקצרה, אורגנוידים כבדיים משני כלבים בריאים (6 משתכפלים היטב כל אחד) הועברו עם פרוטאז דמוי טריפסין במשך 12 דקות ו -24 דקות. הדגימות היו נסערות כל 6 דקות. בסוף נקודת הזמן של הניתוק, 6 מ"ל של DMEM/ F12 מתקדם קר כקרח נוספו לפתרון, ודגימות היו סובבו (700 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). הסופר-טבעי (DMEM/F12 מתקדם עם פרוטאז מדולל דמוי טריפסין) הוסר, והכדורים הוטבעו ב- ECM סולובילי כמתואר לעיל (שלבים 4.4-4.5). לאחר 12 שעות של תרבות ECM solubilized ו CMGF + R /G, הבדלים נצפו בשתי הדגימות. דגירה של 12 דקות עם פרוטאז דמוי טריפסין לא עיכבה את צמיחת האורגנויד. עם זאת, צמיחת האורגנוידים הושפעה לרעה (ראו איור 9) באמצעות דגירה של 24 דקות.

איור 9: ניסוי מעבר אורגנויד כבד כלבים. תמונות מייצגות של אורגנוידים שמקורם בשני כלבים (D_1 ו-D_2) שהועברו בשיטת הדגירה הפרוטאז דמוית הטריפסין למשך 12 דקות או 24 דקות. דגימות בקרה הועברו עם פרוטאז דמוי טריפסין במשך 10 דקות. סרגל קנה מידה (מיקרומטר) נמצא בפינה הימנית העליונה של כל תמונה ומייצג 500 מיקרומטר (הגדלה אובייקטיבית של פי 5). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, בוצעה חקירת השרידות של אורגנוידים כבדיים של כלבים הנגזרים מפרוטוקול זה בסביבה שלילית (מניעת תמיכה מבנית ותזונה). החקירה התמקדה בקביעת הנפח של מדיה אורגנויד מטריצת מרתף הדרושה לצמיחה והישרדות מוצלחת של אורגנויד כבד וגם ביסוס השפעתם של תנאים כאלה על תרבות האורגנויד. שרידות נמדדה בלוח 96-well עם מספר מוגבל של organoids. אורגנוידים משני כלבים הועברו כמתואר לעיל והוטמעו (12 שכפולים) בכמויות שונות של ECM סולובילי (10 μL או 15 μL). התאים היו מצופים בריכוז של 400 תאים / 10 μL היטב ו 600 תאים / 15 μL היטב המתאים 40,000 תאים / מ"ל. שני סוגי מדיה (CMGF+, או CMGF+ R/G) נוספו באמצעי אחסון שונים (25 μL, 30 μL, או 35 μL). התקשורת מעולם לא שונתה, ולא בוצעו הליכי תחזוקה. השרידות של האורגנוידים הייתה במעקב כל יום. מוות אורגנויד הוגדר כפירוק של יותר מ -50% ממבנים אורגנוידים. שיעור ההישרדות של אורגנוידים בתנאים אלה נע בין 12.9 (±2.3) ימים ל -18 (±1.5) ימים, והתוצאות מסוכמות בטבלה 3. שתי הדגימות ששרדו את הארוך ביותר היו organoids נגזר כלבים מוטבע 15 μL של ECM solubilized ו 30 μL של CMGF + מדיה. שתי הדגימות הוטמעו ב-ECM (30 μL) ובמדיה טרייה (500 μL) בלוח סטנדרטי של 24 בארות לאחר 18 ימים של מחסור כדי להבטיח שהרחבת האורגנויד עדיין אפשרית (איור 10).

טבלה 3: תוצאות ניסוי שרידות. הניסוי התבסס על מניעת תמיכה מבנית או תזונה של שתי תרבויות אורגנויד. התוצאות כוללות את הממוצע, החציון, ואת סטיית התקן (CV%) של ריכוזים בודדים של ECM solubilized ומדיה בכלבים בודדים.

איור 10: אורגנוידים חסכים תזונתיים ומבניים. אורגנוידים הוחזרו בלוחות של 24 בארות כדי לאשר את היכולת להרחבה לאחר החסך (A). תמונות מייצגות מהיום 4 ויום 7 לאחר ההכפלה מראות את התרחבות האורגנוידים, המאשרות את היכולת לזהות אורגנוידים קיימא חזותית (תמונות נלקחות בהגדלה אובייקטיבית של פי 5). תמונות מייצגות של אורגנוידים הנחשבים חיים, או מתים נראים ב-(B). התמונות צולמו בהגדלה של יעד פי 5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: כדורי כבד RNA בתמונות מייצגות הכלאה במקום. תמונות מייצגות של סמני LGR5, KRT7, FOXA1 ו- CYP3A12 צולמו בהגדלה אובייקטיבית של 60x של דגימות מיום 2-7 לאחר המעבר. מולקולות mRNA חיוביות מכתימות באדום. AQP1 לא בא לידי ביטוי בדגימות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב פתרונות ומדיה. רשימה של רכיבים וריכוזים של פתרונות כלאט לא שלמים ומלאים, CMGF+ (מדיה אורגנויד), מדיה קפואה ו- FAA.

טבלה משלימה 1: תבנית טיפוח אורגנויד. תבנית זו מאפשרת רישום אורגנויד מדויק וניתן לשחזור עבור כל יום. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: RNA בבדיקות היברידיות מיקום. רשימה של בדיקות שתוכננו במיוחד עבור מטרות mRNA כלבים על ידי יצרן של הטכנולוגיה לבצע RNA בטכניקת הכלאה situ. מפורטים מידע על המשמעות של סמנים בודדים, שם בדיקה, מספר האסמכתא שלה ואזור היעד שלה. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

כיום קיים מחסור בפרוטוקולים מתוקננים הזמינים לבידוד ותחזוקה של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים. קביעת נהלי הפעלה סטנדרטיים עבור תרביות organoid נדרשת עבור מודל זה להיות ישים בהגדרות מעבדה שונות. באופן ספציפי, מתן פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים לתרבות של מודלים אורגנוידים כלבים אלה הוא המפתח לאפיון הצמיחה הרגילה של organoids במהלך התרבות ועובר כדי להפיק נקודות זמן אופטימליות להתרחבות ותחזוקה. אורגנוידים מעיים כלבים בתרבית באמצעות הפרוטוקול אופיינו בעבר על ידי Chandra et ^al.12.

אחד הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הוא העברת אורגנוידים. הזמן האופטימלי למעבר הראשון של כדורי כבד נקבע להיות ביום 7 לאחר הבידוד בהתבסס על מדידות ספרואיד בכבד. הנפח המרבי של כדוריות הושג על ידי יום 7, ובאותו הזמן, spheroids החלו ניצן ויצרו organoids כבד. העלייה בנפח האורגנויד הכולל מהיום 2-7 לאחר הבידוד הייתה יותר מפי 365, מה שמצביע על כך שזמן המעבר האופטימלי ארוך יותר מתרבות האורגנויד במעיים של הכלבים. לאחר 7 ימים בתרבות, לא נצפו סימנים גסים לאפופטוזיס תאי בספרואיד הכבד, גם ללא ניקוי או מעבר (איור 7). העברת האורגנוידים המעיים והכבד יכול להיות מאתגר כמו ההליך יכול להוביל לאובדן תאים ואת הכדאיות שונה. התוצאות מצביעות על כך דגירה ממושכת של אורגנוידים בכבד עם פרוטאז דמוי טריפסין (עד 12 דקות) אינו משפיע לרעה על תת התרבות. דגירה של האורגנוידים בפרוטאז דמוי טריפסין במשך יותר מ -24 דקות יכולה להיות מזיקה לתת התרבות הבאה של האורגנוידים.

במקרה של שבירה תת-אופטימלית באשכולות התאים עם המעבר האורגנויד, דיסוציאציה מכנית במקום דגירה ממושכת עם פרוטאז דמוי טריפסין עשויה להיות מועילה יותר. אם נתקלים בבעיות עם ניתוק נאות של האורגנוידים, מערבולת קצרה של הדגימות עשויה להיות ניסיון לשפר את תפוקת המעבר. מצד שני, למערבולת יש פוטנציאל להרוס תרבית ולפגוע בתאים, ולכן יש להשתמש בה רק כאשר הליכים אחרים נכשלו שוב ושוב. פירוק אורגנוידים כבדיים לתאים בודדים מוריד את קצב הצמיחה של האורגנוידים, בעוד שבירתם לאשכולות של תאים יכולה לשפר מאוד את הכדאיות שלהם. עשר דקות נבחרו כזמן הדגירה לפרוטוקול האורגנויד. נקודת זמן של דגירה של 12 דקות נחשבה לא ציטוטוקסית בהשוואה לדגירה של 24 דקות בניסוי הפרוטאז דמוי הטריפסין.

ניסוי השרידות אישר כי אורגנוידים כבדים כלבים יכולים לשרוד עד 19.5 ימים בתנאים שליליים (דלדול מבני ותזונתי). אורגנוידים ששרדו את התנאים האלה הכי הרבה זמן היו מתורבתים עם CMGF + מדיה. תצפית זו אולי נגרמה על ידי הצמיחה האיטית יותר של organoids כבד במדיה לא בתוספת עם מעכבי סלע ו GSK3β. תרביות אורגנויד עם CMGF+ R/G גדלו מהר יותר וייתכן שרוקנו את המשאבים שלהם מהר יותר. ניסוי זה פותח אפשרויות למזעור תרבות האורגנוידים של הכלבים כדי להשיג המרה של מערכת בעלת תפוקה גבוהה. טכנולוגיה כזו מראה את הפוטנציאל להקל על גילוי תרופות או מחקרי טוקסיקולוגיה בעלות מופחתת באופן משמעותי.

כמה בעיות נפוצות שנתקלו במהלך תחזוקת תרבות האורגנוידים של הכלבים הן התגבשות מדגם לא נכונה בעת ציפוי, זיהום תרבות, וביסוס הצפיפות והגודל הנכונים של האורגנוידים. אם ECM solubilized מתמצק בטרם עת במהלך ציפוי, מיד למקם אותו על קרח במשך 10 דקות. אם ECM solubilized אינו יוצר מבנים דמויי כיפה, סביר להניח כי לא מספיק מדיה הוסרה מן המדגם. אם זה המקרה, לדלל את המדגם עם ECM solubilized יותר עד כיפות טופס.

כאשר זיהום פטרייתי או חיידקי נמצא בצלחת שלמה (ראו איור 4), הפתרון הטוב ביותר הוא להשליך את הצלחת. ניתן לנסות טיפול בתרופות אנטי פטרייתיות או אנטיביוטיות, אך הצלחתו של ניסיון כזה נמוכה ביותר. אם באר אחת מזוהמת בצלחת, בארות קיימא ולא מושפעות ניתן לנקות (בצע את השלבים 4.1 עד 4.5) לצלחת חדשה ומנוטר מקרוב. אם המדגם כבר היה חירום קפוא, מומלץ להשליך את המדגם כולו, כמו הפשרת המדגם חושף את החממה לסיכון זיהום נוסף.

תרבות אורגנויד בריאה צריכה להיות לפחות בקטגוריית הגודל הבינוני והצפיפות הבינונית או גדולה יותר. צפיפות אופטימלית חיונית לצמיחת תרבות האורגנויד. יש לתקן צפיפות נמוכה יותר על ידי ניקוי האורגנוידים לצפיפות בינונית. אם מתרחש מצב של צפיפות קיצונית (צפיפות יתר), האורגנוידים צריכים להיות מורחבים לבארות נוספות. סימנים גסים של אפופטוזיס הסלולר לעתים קרובות ללוות הן צפיפות יתר וצפיפות נמוכה של תרבות organoid. אם בעיות אלה לא יתוקנו בזמן, כל תרבות האורגנויד תהפוך אפופטוטית תוך ימים ספורים. אם organoids להשיג גודל גדול במיוחד או צפיפות גבוהה מאוד, התרבות צריכה לשמש לניסוי, הקפאה, או קיבעון.

מדיה organoid מכיל כיום 17 רכיבים, ואת התוספת של גורמי גדילה הדרושים לתחזוקה אורגניואידית והתרחבות ולכן יכול להיות יקר. בעיה זו ניתן לפתור על ידי גידול תרביות תאים 2D לסנתז את גורמי הגדילה כדי לייצר CMGF מותנה +. תרבית התא L-WRN מייצרת גורמי גדילה Wnt-3a, R-Spondin-3 ו- ^Noggin37. מושבת התאים משתמשת ב-90% מדיית תרבות DMEM/F12 ו-10% FBS. כאשר התרבות משיגה 90 אחוזי שיתוף פעולה, התקשורת נקצרים כל יום במשך שבוע אחד. לאחר מכן, המדיה שנקטפה מעורבבת עם 2x CMGF+ (ללא גורמי גדילה אלה). בעוד שתרבויות דו-ממדיות יכולות לייצר את גורמי הצמיחה הדרושים בשבריר מהעלות, יש לצפות לזמן ולהכנה הנוספים להפקת המדיה. ריכוזים של גורמי גדילה בין אצוות מדיה מותנות יכול גם להיות שונה ^37,38.

תרבויות אורגנויד בוגרות של תאי גזע בוגרים של כלבים הן מודל ביו-רפואי ייחודי שיכול לסייע בהשגת המטרות של יוזמת הבריאות ^האחת39. ניתן להשתמש בטכנולוגיית האורגנויד בתחומים בסיסיים וביו-רפואיים רבים, המשתרעים על פני ביולוגיה התפתחותית, פתולוגיה, גילוי ובדיקות של תרופות, טוקסיקולוגיה לחקר מחלות זיהומיות ורפואה ^{רגנרטיבית40}. מחקר תרגומי ותרגום הפוך הם שני התחומים שבהם אורגנוידים של כלבים ^{ישימים15}. כלבים שימשו במשך מאות שנים בסביבה ניסיונית תרגומית, ומעמדם החייתי המלווה הקל גם על מעמדם כאחד המינים הנחקרים ביותר ברפואה הווטרינרית.

לסיכום, כתב יד זה מספק פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים לבידוד, תחזוקה, קציר וביו-בנקאות של כבד כלבים ואורגנוידים במעיים כדי להקל על יישום מודל זה בתחומים ביו-רפואיים שונים. מודל זה מתאים באופן ייחודי לקידום מחקר תרגומי הפוך ככלי של יוזמת בריאות אחת לקידום שיתוף בין-תחומי ואינטרדיסציפלינרי של ידע.

ק. אלנספאך הוא מייסד שותף של LifEngine בריאות בעלי חיים ופתרונות בריאות 3D. היא משמשת כיועצת לבריאות בעלי חיים של Ceva, Bioiberica, LifeDiagnostics, אבחון אנטק, פרוביוטיקה דירלנד, ומאדים. ג'יי פי מוכל הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health Health ופתרונות בריאות תלת-ממדיים. ד"ר Mochel משמש כיועץ לבריאות בעלי חיים Ceva ובריאות בעלי חיים אתוס. למחברים אחרים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

המחברים רוצים להביע הכרת תודה למעבדת האבחון הווטרינרית של עובדי אוניברסיטת איווה סטייט, כלומר, היילי מ' למברט, אמילי רה, רוזלין מ. ברנמן, ויקטוריה ג'יי גרין וג'ניפר מ. גרולץ-קיכלי, על העיבוד בזמן של הדגימות שסופקו. המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הסטארט-אפ של הפקולטה, פרס ISU VPR מילר, פרס ISU VPR מילר, ופרס המשנה של NSF SBIR ל- ISU # 1912948.