3D סריקה תלת-ממדית מיקרומעגלים ותמונות המוח המקברקנה בתלת-ממד הטבעה בפרוטוקול החופף

מאמר זה מציג פרוטוקול ניסיוני באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית המגשר על שני סולמות מרחביים: הסולם המרחבי המקסקופי של אנטומיה מוחית שלמה המועלת על-ידי MRI ב-> 100 יקרומטר ובקנה המידה המרחבי המיקרוסקופי של הפצות עצבי באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיה ומערכת מערך רב אלקטרודה ושיטות אחרות (~ 10 μm).

המוח האנושי, להיות מערכת רב-היקף, יש שני אותות חשמליים מאקרוסקופי, הזורם באופן כללי לאורך חבילות סיבים עבים החומר הלבן, וקוצים עצביים מיקרוסקופיים, הפצת לאורך אקסונים ו דנדטים. שני הקשקשים משלימים היבטים שונים של פונקציות קוגניטיביות והתנהגותיות אנושיות. ברמה המקרו-מקרוסקופית, MRI הינו טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית הנוכחית, שבה הרזולוציה המרחבית הקטנה ביותר, גודל voxel, היא 0.1 – 1 מ"מ³. כמו כן, ברמה המיקרוסקופית, מחקרים פיזיולוגיים קודמים היו מודעים לארכיטקטורות נוירואליות שאינן אחידה בתוך voxels כאלה. מחקר זה מפתח דרך רבת עוצמה להטביע במדויק נתונים מיקרוסקופיים לתוך מפת מאקרוסקופי על ידי מחקר מדעי ביולוגי ממשק עם פיתוחים טכנולוגיים בטכנולוגיית סריקה תלת-ממדית. מאז 3D טכנולוגיה סריקה בעיקר שימש הנדסה ועיצוב תעשייתי עד עכשיו, זה מחדש בפעם הראשונה כדי להטביע מיקרוקישוריות לתוך המוח כולו תוך שמירה על העולה הטבעי בתאי המוח החיים. על מנת להשיג מטרה זו, הראשון, בנינו פרוטוקול סריקה כדי להשיג תמונות 3D מדויקים מהחיים ביו אורגניזמים מאוד מאתגרת לתמונה בשל לחות משטחים רפלקטיבית. שנית, אנו מאומנים לשמור על מהירות כדי למנוע השפלה של רקמת המוח החי, שהוא גורם מפתח בשמירת מצבים טובים יותר והקלטת קוצים עצביים טבעי יותר מנוירונים פעילים ברקמת המוח. שני תמונות משטח קורטיקלית, שחולצו באופן עצמאי משני מודולים הדמיה שונים, כלומר MRI ו 3d משטח הסורק תמונות, מפתיע להראות שגיאת מרחק של רק 50 יקרומטר כערך במצב של ההיסטוגרמה. דיוק זה דומה בקנה מידה לרזולוציה המיקרוסקופית של מרחקים בין-סלולאריים; כמו כן, הוא יציב בין עכברים בודדים שונים. זה פרוטוקול חדש, 3D הטבעה הרומן החופף (3D-NEO) פרוטוקול, גשרים רמות מאקרוסקופי ומיקרוסקופיים הנגזרים על ידי פרוטוקול אינטגרטיבי זה מאיץ ממצאים מדעיים חדשים כדי ללמוד ארכיטקטורות קישוריות מקיפה (כלומר, מיקרו-מחובר).

ארכיטקטורות שאינן אחידה בארגונים פיזיים וביולוגיים שונים מצויים בדרך כלל^1,2. המוח הוא גם ארגון מאוד לא אחיד ומרובה בקנה מידה של רשת^3,4. פונקציות קוגניטיביות שונות מקודדים בארגוני רשת כגון, החזקת שינויים בזמן של דפוסי מסמרים חשמליים של אוכלוסיות נוירואליות ברזולוציות זמן משנה. מבחינה היסטורית, הרשתות המורכבות בין הנוירונים נצפו באופן מבנית בפרוטרוט באמצעות שיטות הצביעה של סנטיאגו רמון את קאחאל מלפני 150 שנים⁵. כדי לצפות בהתנהגויות קבוצתיות של נוירונים פעילים, החוקרים פיתחו טכנולוגיות הקלטה שונות^6,7,8, וההתפתחויות המשמעותיות האחרונות של טכנולוגיות כאלה אפשרו לנו להקליט פעילות חשמלית ממספר עצום של נוירונים בו זמנית. יתר על כן, מתוך פעילויות תפקודית כאלה, מדענים הצליחו לשחזר רשתות של אינטראקציות סיבתי בין מספר עצום של נוירונים והכריזו על הארכיטקטורה הטופולוגית של אינטראקציות מורכבות שלהם ' מיקרוקישוריות '⁹ . תצפיות מקרוסקופיות של המוח מאפשרות גם לגבי מוח שלם כארגון רשת, משום שאזורי מוח רבים מחוברים באמצעות חבילות סיבים מרובים. הטבעה של מיקרו-התחברות לתוך מפת המוח הגלובלית עדיין יש מגבלות ברורות בתוך ההתקדמות הטכנולוגית הנוכחית, ולכן זה פרוטוקול הטבעה זה חשוב כל כך. עם זאת, ישנם אתגרים רבים להתפתחות של פרוטוקול ההטמעה. לדוגמה, כדי להתבונן בפעילויות של מעגלים עצביים מקומיים באזורי מוח מבודדים גרידא, יש לייצר פרוסות מוח בהקלטות של מבחנה. בנוסף, הקלטות מפרוסות מוח להקלטות של מבחנה הן עדיין בחירה חשובה לפחות שתי סיבות. ראשית, עדיין לא קל להתבונן בפעילויות של הרבה נוירונים חיים בודדים במקביל מאזורי המוח עמוק יותר ~ 1.5 מ"מ וברזולוציה הרקתית הגבוהה (< 1 אלפיות הראשונה). שנית, כאשר אנו מקווים לדעת את הארכיטקטורה הפנימית של מעגל עצבי מקומי, אנחנו צריכים להפסיק את כל התשומות המגיעים מאזורי מוח חיצוניים כדי למנוע גורמים מייסדים. כדי לזהות את ההנחיות והמיקומים של פרוסות המוח המיוצרים, יהיה צורך נוסף לשלב את המיקומים המרחביים של פרוסות המוח הללו באמצעות קואורדינטות. עם זאת, יש כמה דרכים שיטתיות ואמינות לעשות פרוסות המוח בצורה מאורגנת^10,11. כאן, פרוטוקול הרישום החדש הוא הציג, באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית למחקר נוירומדעי על מנת לספק פרוטוקול אינטגרטיבי. פרוטוקול זה פועל כדי לתאם מיקרו מאזניים ולהטביע מערך רב אלקטרודה (MEA) microdata^12,13 ו צביעת נתונים על מרחב MRI מאקרוסקופי באמצעות 3d לסרוק משטחים של המוח המחולצים, כמו גם של מוח שאינו מוקלט באופן בלתי פולשני. באופן מפתיע, פעולה זו הראתה שגיאת מרחק של רק ~ 50 יקרומטר כערך המצב של ההיסטוגרמה. כתוצאה מכך, ערכי המצב של מרחקים מינימליים בין שני משטחים בין משטח ה-MRI לבין משטח התלת-ממד הסרוק היו כמעט 50 יקרומטר עבור כל ששת העכברים, שהוא מספר מתאים בעת בדיקת אחידות בין אנשים. רוחב הפרוסה אופייני היה פעילות ספייק מוקלט של סביב 300 μm.

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קיוטו.

1. בעלי חיים (יום 1)

1. הכנת עכברים C57BL/6J (n = 6, בגיל 3 עד 5 שבועות).
   הערה: פרוטוקול זה חל על כל המינים המכרסמים.

2. הגדרות MRI (יום 1)

1. לשים את העכבר בתיבה הרדמה אקריליק ממוקם על מחצלת חימום מותאם 37 ° c באמצעות בקר מחצלת חימום.
2. מורדם העכבר עם 2% isofלוריאן באוויר זורם דרך התיבה בקצב הזרימה של 1.4 L/min באמצעות מערכת הרדמה, אשר מורכב של מאדה איזוofane, מטר זרימת האוויר, ומדחס אוויר.
3. לאחר אינדוקציה של הרדמה, למקם את העכבר בעריסה תואמת MRI במצב נוטה. בדוק אם ההרדמה מספיקה על ידי גזירת אצבע של העכבר עם מלקחיים כדי לראות אם זה לא מרגיש כאב.
4. לתקן את ראשו של העכבר עם בר השן מסיכת פנים מצויד העריסה. לאחר מכן, לשמור על ההרדמה עם 1%-1.5% isof, באוויר ב 1.4 L/min באמצעות מסיכת הפנים.
5. הכנס בדיקה טמפרטורה תרמיסטור לתוך הרקטום של העכבר ומקום חיישן הנשימה רגיש ללחץ בגב העכבר.
6. להעביר את העריסה לנשא של מגנט MRI. התאימו את הריכוז האיזותחומי לסביבות 1%-1.5% על מנת להבטיח עומק הרדמה יציב ומחודש. צג אם טמפרטורת הגוף נשלטת בין 33 ל-35 ° צ' לבין קצב הנשימה בין 0.5 ל-1.3 Hz במהלך התקופה השלמה של ניסויי MRI, באמצעות מערכת ניטור (טבלת חומרים) עבור הפרמטרים הפיזיולוגיים של בעלי חיים קטנים עם תוכנה ייעודית (רשימת חומרים).
7. באמצעות הערך נמדד של הטמפרטורה פי הטבעת, לווסת את טמפרטורת הגוף על ידי שליטה על הטמפרטורה של אוויר חם המסופק מגנט נשא ממערכת חימום מצויד במערכת ניטור.

3. רכישות MRI (יום 1)

1. ההכנות לסריקת MRI משוקלל ברזולוציה גבוהה בתלת-ממד T2
   1. לרכוש שלושה תהודה מגנטית (MR) תמונות בשלושה מטוסים אורתוגונאליות (צירית, coronal, ו משונן) על מנת לבדוק את מיקום העכבר.
   2. בהתייחסו תמונות אלה, להתאים את מיקום העכבר על ידי הזזת העריסה כך מרכז המוח העכבר ממוקם במרכז התהודה כמו גם במרכז סלילי מעבר הצבע בכיוון צירית.
   3. כוונן את מערכת ה-MRI על-ידי כוונון התהודה, כוונון של השדה המגנטי הסטטי (shimming) והתדר הבסיסי, וכיול העוצמה של תדר הרדיו (RF).
   4. לרכוש ברזולוציה נמוכה 2d מרובת פרוסה T2 משוקלל (T2W) תמונות עם כיוון ילתית ו משונן. בהתבסס על תמונות אלה, לקבוע את שדה התצוגה (FOV) עבור סריקה ברזולוציה גבוהה T2W MRI 3D.
   5. ביצוע שימומינג מקומי באמצעות אלגוריתם של shim אוטומטי של FASTMAP. עבור פרוטוקול FASTMAP, בחר אזור מלבני המכסה את כל המוח. לאחר השלמת שימומינג מקומי, לאשר את השדה B₀ הומוגניות בתוך אזור המוח על ידי ספקטרום מקומי ¹H באמצעות ספקטרוסקופיית שנפתרה הנקודה (PRESS).
   6. לרכוש תמונות 3D T2W ברזולוציה נמוכה כדי לוודא את הגדרות הסריקה עבור ברזולוציה גבוהה 3D T2W MRI מתאימים על ידי בדיקת המיקום המתאים של FOV, העדר החלקה (הפחתת) חפצים, ואת הדיכוי היעיל של אותות שומן.
2. רצף דופק הדמיה
   1. לאחר ההכנות המתוארות לעיל, לרכוש תמונות 3D T2W ברזולוציה גבוהה של המוח כולו של העכבר, באמצעות רכישה מהירה עם שיפור הרפיה (נדיר) רצף.
      הערה: במאמר זה, ניסויים MRI נערכו על 7 T, 210 מילימטר אופקי מנשא, סורק טרום קלינית, מצויד במערכת מעבר צבע של 440 mT/m בזמן השיפוע 100 μs. בעלת קוטר פנימי של 35 מ"מ שימש לעירור של RF וקליטת אותות. נתוני האמ. אר. איי נרכשו. עם תוכנת פעולה ייעודית הפרמטרים של הרכישה של רצף הפולס נדיר תלת-ממד המשמש במחקר זה מסוכמים בטבלה 1.

4. הכנת הפתרונות הניסיוניים (יום 2)

1. להכין 500 mL של תמיסת קרח קר חיתוך (2.5 mM KCl, 1.25 mM נה₂PO₄, 7 מ"מ mgcl₂, 15 מ"מ גלוקוז, 25 mM נחקו₃, 0.5 mm cacl₂, 11.6 mm נתרן ascorbate, 3.1 מילימטר נתרן פירובט, ו 100 כולין כלוריד, בוקבלד. עם 95% O₂ ו 5% CO₂). התאם את ה-pH ל-7.3-7.4.
2. להכין 1 L של נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF; 127 מ"מ, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נה₂PO₄, 1 מ"מ mgcl₂, 15 מ"מ גלוקוז, 25 מ"מ נחקו₃, ו 2 מ"מ Cacl₂, בעבע עם 95% O₂ ו 5% CO₂). כוונן את ה-pH ל-7.3 – 7.4.

5. הכנת מכשור (יום 2)

1. הכינו 6.6 ס מ² כיכר, 0.5 ס"מ מגנט עבה" טבעת "ו, הראשון, מקום קלטת שחור, השני, קלטת כירורגית על הטבעת (איור 1c-2). שים לב כי חומר זה נקרא בסיס לחסום את המוח (BBB), ולשמור אותו קר על בלוקים של קרח.
   הערה: מאוחר יותר, הקלטות יצורפו לתחנת החיתוך עם גושי מוח לצורך הרטט. הטבעת מרובע משמש כבסיס התחתון של BBB לספק שתי מטרות, כלומר להעביר בלוקים במוח בצורה חלקה מתחנת הסריקה 3D כדי רטט atome ולמדוד במדויק את הגבהים של בלוקים במוח בשלב הסריקה.
2. הגדר את BBB עם פטיפון אוטומטי. . תדליק את הסורק והפטיפון הפעל את תוכנת עיבוד התמונה.
3. לפני כל הניסויים, לבצע כיול של המצלמות ואת הפטיפון המחובר של הקרנת אור מובנית וסורק 3D שולחן העבודה.
   1. , תדליק את המקרן המרכזי. את שתי המצלמות, ואת הפטיפון לאחר מכן, פתח את התוכנה. בתוכנה, לחץ על התקנה אופטית ובחר את אזור התמונה כ-100 x 80 ואת מספרי הרשת כ100 x 100. לאחר מכן, כיול המצלמה מתחיל בהתאם לארבעת השלבים הבאים.
      1. עבור הגדרת המקרן, הנח את גיליון הכיול על השולחן והנח את לוח הכיול בגיליון הכיול כדי לכוונן את נקודת התיקון של אזור המדידה למרכז הגיליון ולכיוון החזית. כוונן את המרחק בין המקרן לבין הלוח לסביבות 200 מ"מ. שחרר את הברגים כדי לתקן את שני הידיות, וסובב את הידיות כדי לכוונן את הרגישות הקלה ואת המיקוד של שתי המצלמות. לאחר מכן, לחץ על חץ כדי לעבור לשלב הבא.
      2. כדי להתמצא המצלמות, לשחרר את הברגים לתקן את שתי המצלמות עצמן ולהזיז את המיקומים ואת סיבובים לחפוף עם קו המרכז על לוח הכיול, הקו האנכי, ואת הצלב הצהוב מוקרן מהמקרן. תקן את המצלמות, ולחץ שוב על חץ . לאחר מכן, המסך יהיה כהה.
      3. כדי למקד את המצלמות, לאחר התרופפות תיקון ברגים של הידיות, להגביר את רגישות האור ולכוונן את המוקד שוב. לאחר מכן, לחץ על חץ כדי לעבור לשלב הבא.
      4. לערך ה-F ומידת החשיפה (של המצלמה), התאימו שוב את הרגישות הקלה אל מתחת למקום שבו האזור האדום נעלם. לאחר מכן, לחץ שוב על חץ ולחץ על התחל כיול ובחר כן אם תישאל האם סיימת את ההגדרה האופטית?
   2. לחץ על אתחל את הכיולובדוק אם ערכי הפיקסלים מנורמלות בין 0-255. לאחר מכן , לחץ על המשך.
   3. על-ידי ביצוע מיקומים מוצעים, הקלטת תמונות של תשע זוויות יחסיות שונות של הסורק ושל לוח הכיול, וסיים לאחר אישור תהליך הכיול, ולבסוף, לחץ על עדכון של הכיול.
   4. החלף את לוח הכיול עבור הפטיפון ולחץ על כיול הפטיפון.
      הערה: . עכשיו, כל הכיול גמורים

6. סריקת פני המוח, פריסה, ו-MEA הקלטה (יום 2)

1. . וערוף את ראשו של העכבר השתמש באזמל כדי לפתוח. את העור ולחשוף את הגולגולת
2. חותכים את הקרקפת של העכבר המורדם לאורך התפר המשונן באמצעות סכין כירורגית, וחותכים את הגולגולת בכיוונים אלכסוניים מנקודת הלאמבדה לנקודה קטנה מול הברגמה באמצעות מספריים כירורגיים. ואז, לקלף בעדינות את הגולגולת מהמוח באמצעות פינצטה מעוקל.
3. השתמש במרית כדי להרים את המוח ולהעביר אותה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ) עם תמיסת חיתוך קר בקרח (המוכן בשלב 4.1). זרם אוויר המכיל 95% O₂ ו 5% CO₂ מפצצת גז חיצוני עם מהירות מסתובבת מבוקרת של המשאבה (~ 4.0 rpm) כדי ליצור בועות קטנות בתמיסה קרח קר חיתוך (איור 1a).
4. אחרי 1 – 2 דקות, הניחו את המוח על בד מיקרופייבר שמשטח מכוסה מעט על ידי מסננת קמח, וניגוב נוזל ממשטח המוח, בעדינות בעזרת הבד מיקרופייבר (איור 1b).
5. הניחו את המוח בהיבט הגבי על דוכן הדגימות של BBB, והכניסו את BBB במרכז הפטיפון האוטומטי.
6. הכהיה את החדר במהלך סריקת תלת-ממד וביצוע סריקה תלת-ממדית על הפטיפון. כדי לבדוק אם הסריקה התלת-ממדית פועלת היטב, לחץ על סריקת תלת-ממד על-ידי בחירת הזווית בין שתי יריות כ-22.5, זווית ההתחלה כ-0, והזווית הסופית כ-360 (איור 1c-1).
7. הזיזו את המוח לצלחת פטרי, ובועת המוח בתמיסה החותכת למשך כ -10 ס מ.
8. חותכים את המוח לשני בלוקים באמצע המישור התחתי באמצעות סכין כירורגית, ומזיז את שני גושי המוח בעדינות אל המשטח השטוח באמצעות מרית כירורגית.
9. הצמד את גושי המוח של BBB באמצעות דבק מיידי, ובעדינות לנגב את הנוזל מפני המוח בתוך 1 – 2 דקות, באמצעות בד מיקרופייבר שוב. לאחר מכן, בצע סריקת תלת-ממד שוב (איור 1c-2).
10. הצמד את הסרט השחור המכסה את מרכז BBB למרכז שלב החיתוך לצורך רטט (איור 1d).
11. שופכים את הפתרון גזירה לתוך הבמה חיתוך ולהגדיר את השלב חיתוך על הרטט. כוונן את מהירות החיתוך והשרעת. הפוך 2 – 5 פרוסות ילתית (300 יקרומטר עבה) משני גושי המוח. לשמור על הפתרון בשלב חיתוך מבעבע אם אפשרי (איור 1e).
12. הצמד להב למחזיק הלהב של הרטט ולייעל את מהירות חיתוך, תדירות, ורטט משרעת של המערכת על ידי הגדרת אותם כמו 12.7 mm/min עבור המהירות, 87-88 הרץ עבור תדירות, ו 0.8 – 1.0 מ"מ עבור רוחב הנדנדה. כאשר חיתוך זהיר הוא הכרחי, להאט את המהירות לרמה 2 – 3.
13. במהלך חיתוך פרוסות המוח, הקליטו את הקואורדינטות הפרוסות בפורמט, כולל הקואורדינטות הקדמיות, חצי הכדור והתנאים האחרים (איור 2 ג).
14. בעדינות להעביר את פרוסות המוח לגביע ממולא מראש (~ 34 ° c) ACSF באמצעות פיפטה פלסטיק עבה, ו מפלעות אותם בגביע ב ~ 34 ° צ' עבור ~ 1 h. במהלך הזמן הזה, לבצע סריקה תלת-ממדית של בלוקים המוח הנותרים על הבמה חיתוך (איור 1c-2).
15. . הגדר שבב מאה ביחידת הקלטה חבר את השבב למשאבה פריסטלטית באמצעות שתי שפופרות. השתמש בצינור אחד כדי להנחות את ה-ACSF לתוך שבב ה-MEA ואת הצינור השני כדי להנחות ACSF מתוך שבב ה-MEA.
16. לצרף שתי מחטים (0.60 מ"מ x 19 מ"מ), מחובר בקצות שתי הצינורות, לראש הקיר של השבב מאה, ולתקן את עמדותיהם עם הטיפים שלהם בעקבות הקיר הפנימי של השבב מאה. הגדר את קצב הזרימה של ACSF כדי 4.1 rpm.
17. אחרי 1 h חלפו, הזיזו פרוסה על השבב בעזרת מברשת פלסטיק עבה, וקבעו את המיקום במברשת רכה. לאחר מכן, התחל את תהליך ההקלטה של פעילויות נירואליות (איור 2-d).

7. מכתים אימונוהיסטוכימיה (ימים 3 ו-4)

1. לאחר סיום ההקלטה של ה-MEA, העבירו את הפרוסות לצינורות 1.5 mL מלאות ב-4% פאראפורמלדהיד (בגמר) בתמיסת מלח (PBS). מודאת אותם הלילה ב -4 ° c. לאחר מכן, הסר את הפתרון של 4% בכיוון הערוץ ושטוף את הפרוסות ב-3x עם PBS עבור 5 דקות בסך הכל.
   הערה: במידת הצורך, להטביע את הפרוסות ב 20% ג'לטין/PBS וכריתה של הפרוסה כדי להפוך אותו רזה יותר מ 50 μm, באמצעות הרטט atome.
2. הכנת הפתרון לאחזור אנטיגן (10 מ"מ נתרן ציטראט, pH 6.0). הסר את ה-PBS משטיפת האחרון והוסף את הפתרון לאחזור אנטיגן.
3. מרתיחים מים בסיר תרמוס חשמלי, ומזרבות את הצינורות עם הפרוסות במשך 20 דקות ב ~ 95 – 98 ° c בסיר, ואחריו קירור טבעי.
4. להכין 50 mM טריס-מלוחים באגירה ולהוסיף 1% na יסולפיט פיט (1% na יסולפיט פיט-טריס פתרון). כוונן את ה-pH ל-7.5. לאחר מכן, לשטוף את הפרוסות עם 1% Na bisulfite פיט-Tris פתרון עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (~ 20 – 25 ° c).
5. הכנת פתרון חסימה על ידי הוספת 4% סרום עז רגיל ו 0.5% octylphenol ethoxylate אוחר יותר 1% Na bisulfite אפיט-טריס פתרון.
6. הסר את התמיסה 1% Na bisulfite Tris מהצינורות עם הפרוסות והוסף פתרון חסימה. . משטח הטמפרטורה בחדר השני
7. הכן את פתרון הנוגדן העיקרי על-ידי הוספת 1% סרום עז רגיל ו 0.5% טריטון X-100 אל 1% Na bisulfite פיט-Tris פתרון ומדלל נוגדנים ראשוניים. השתמש בריכוזים הבאים של נוגדנים עיקריים: 1:800 של העכבר anti-GAD67 ו 1:500 של ארנב אנטי NeuN.
8. הסר את הפתרון 1% Na bisulfite Tris מצינורות עם הפרוסות ולהוסיף את פתרון הנוגדן העיקרי. המשך הלילה ב -4 ° c.
9. להכין 50 mM טריס-מלוחים באגירה ולהוסיף 8.5 g/L ' הפתרון (טריס-הנאל). . ה7.5. אז, לשטוף את הפרוסות 3x עם הפתרון טריס-נאול (~ 20 – 25 ° c) עבור 5 דקות בסך הכל.
10. הכינו את פתרון הנוגדן השני על ידי הוספת 3% סרום עז רגיל ו 0.3% טריטון X-100 לפתרון טריס-נאול ומדלל נוגדנים משניים. השתמש בריכוזים הבאים של נוגדנים משניים: 1:500 של עז נגד עכבר ו 1:500 של עז אנטי ארנב.
11. הסר את הפתרון טריס-הנאקל מהצינורות עם הפרוסות והוסף את פתרון הנוגדן המשני. . מכאן בטמפרטורת החדר לאחר מכן, לשטוף את הפרוסות 3x עם הפתרון טריס-הנאל 5 דקות בסך הכל.
12. הצב את הפרוסות על השקופית באמצעות מברשת קטנה והחל מדיה הרכבה ושובר שמיכות. בדוק את השקופיות בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד. לקחת תמונות של פני השטח של פרוסה (איור 2e).

8. עיבוד נתונים MRI לחילוץ כרכים קורטיקלית

1. התקן את התוכנה החופשית FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). תכין את תמונות האמ. אר. איי. שנרכשו בסעיף 3
2. שנה את תבנית התמונה באמצעות הפקודה fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ . הרחב את התמונה המוח כדי להפוך אותו לגדול כמו מוח אנושי באמצעות הפקודה fslcreatehd , ובמידת הצורך, לשנות את הכיוון באמצעות fslאוריינט עם האפשרות -setqformcode 1. לאחר מכן, לשחזר את תבנית הקובץ המקורי באמצעות fslchfiletype NIFTI_GZ. הפקודה המדויקת היא כדלקמן.
   fslchfiletype NFTI_PAIR [תמונת קלט]. הביטוח העצמי. gz
   הפקודה fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [תמונת קלט]. hdr. gz
   fslorient – קוד 1 [תמונת קלט]. hdr. gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [תמונת קלט]
3. הקלד fsl כדי לפתוח את תוכנת fsl. חלץ את המוח באמצעות הפקודה bet מממשק המשתמש הגרפי (GUI), אך אל תקלפו יותר מדי. וקואורדינטות של מרכז. משטח המוח הראשוני בזהירות הערכים האופטימליים שונים עבור נתונים בודדים.
4. שנה את גודל תמונת המוח לגודל המוח המקורי של העכבר, באמצעות אותו ההליך כמו בשלב 8.2. הפקודה המדויקת היא כלפי:
   fslchfiletype NFTI_PAIR [תמונת קלט]. הביטוח העצמי. gz
   הפקודה fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [תמונת קלט]. hdr. gz
   fslorient – קוד 1 [תמונת קלט]. hdr. gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [תמונת קלט]
5. מקורגיה כל תמונות המוח באמצעות הפקודה לפלרטט , ולייצר תמונת מוח בממוצע באמצעות האפשרות להוסיף ו -div אפשרות של הפקודה fslmaths תמטיקות .
   fslmaths תמטיקות [תמונת המוח 1] – להוסיף...-להוסיף [תמונת המוח N] – div N [שם התמונה בממוצע] – odt לצוף
6. הפוך את מנקה המוח הממוצע באמצעות - האופציה של הפקודה fslmaths תמטיקות . לאחר מכן, בחר ערך סף אופטימלי הגמיש למקרים בודדים.
   fslmaths מתמטיקה [שם התמונה בממוצע] – על [ערך, לדוגמה, 5000] [thresholded ממוצע תמונה]
7. לבסוף, עצב מחדש את תמונת המוח הממוצע לקואורדינטת של אדם באמצעות הפקודה ' פלירטוט ' שוב. לאחר מכן, להכין cortexes נקי למדי שחולצו (איור 2a).
   הערה: למרבה הצער, הנורה ואת המוח העיקרי לא יהיה מושלם במשטח המוח משוחזר מאמצעי האחסון MRI בגלל המגבלות החיוניות של התוכנה FSL כדי לנפח את כל חלקי המוח כולל נורת הריח ואת המוח.

9. עיבוד תמונה MRI למשטח הקורטיקלית

1. הורד תוכנה חופשית אחרת, פריסה תלת-ממדית (https://download.slicer.org/).
2. פתח את תמונות MR של המוח המחולצים (לחץ על הקובץ ובחר להוסיף נתונים) הופק על פי סעיף 8, באמצעות עיבוד נפח ומודולים עורך בפורס 3d.
3. שנה את המצב מעורך לעיבוד אמצעי אחסוןולחץ על לחצן היעד כדי לגרום לתמונת המוח להגיע למרכז המסך.
4. בחר במצב המוח MR-T2 וכוונן את הסף על- ידי הזזת סרגל הזיזה. לאחר מכן, העבר חזרה מרינדור עוצמת הקול לעורך ולחץ על לחצן אפקט הסף .
5. החל את התווית 41. קליפת מוחין ולשמור את נתוני פני המוח כקובץ . stl . לאחר מכן, שנה את תבנית הקובץ מ -. vtk ל -stl, ושמור את הקובץ על-ידי בדיקת הטופס.

10. עיבוד מקדים עבור נתוני סריקה תלת-ממדית

1. בצע רישום כללי אוטומטי בין 8 או 16 תמונות שנלקחו מ 8 או 16 זוויות שונות בתוך רצף של סריקה כדי לתקן הבדלים קטנים ביניהם על ידי לחיצה על רישום גלובלי כלול באפשרות היישור, ולשלב אותם. חזור על סריקות מזוויות שונות כדי להשיג את כל משטח המוח (איור 2b).
   1. אם השילוב בין תמונות שנסרקו מזוויות שונות לא הצליח, לחץ על יישור ידני ובחר זוג תמונה קבועה ותמונה מנעה.
   2. לחץ על ' התחל ' כדי להתחיל את היישור הידני של התמונות על-ידי בחירה בשלוש או ארבע נקודות נפוצות בתמונות שונות. לאחר מכן, לחץ על אישור. אלגוריתם האופטימיזציה הוא הנקודה הקרובה ביותר למצב הקיים (הקאמרי)¹⁰. הוא אינו כולל דפורמציה לא לינארית.
2. בצע שינוי של כל התמונות המיושרות (כלומר, של ערכות הנתונים הנקודות) על-ידי בחירת כל התמונות ולחיצה על לחצן הדור של רשת השינוי . לאחר מכן, בחר באפשרות אובייקט אמנותי קטן כדי לקבל את רשת השינוי כרזולוציה הגבוהה ביותר. לאחר מכן, שמור את התמונה כקובץ בינארי של. stl, או בתבנית ASCII.

11. הרישום של משטח ה-MRI ומשטח הסריקה התלת-ממדית

1. פתח את משטח ה-MRI ומזג אותו עם משטח הסריקה 3D באמצעות תוכנת עיבוד פני השטח. לאחר מכן, בצע תהליך יישור ידני באמצעות אותה הפרוצדורה כפי שמתואר בשלבים 10.1.1 ו-10.1.2. לאחר מכן, שמור שוב את תמונות המשטחים האלה מתחת לפני השטח (איור 2a, b).
   1. במקרה הצורך, נקו את נתוני פני השטח הבודדים, לדוגמה, על-ידי מחיקת רעשים קטנים המקיפים את אזור המוח, במיוחד במקרה של נתוני ה-MRI, ועל ידי מילוי חורים אם קיימים, במיוחד במקרה של נתוני הסריקה התלת-ממדית.
2. לבסוף, פתח את נתוני פני השטח עם תוכנת ניתוח נתונים, לדוגמה, MATLAB וביצוע והערכה של היסטגרמות של המרחקים המינימליים בין שני המשטחים.

הערכנו מרחקים בין משטחי קליפת המוח, המיוצר על ידי נפח ה-MRI ההתפשט, ומשטחים שהתקבלו מסריקות 3D של המוח המחולצים. ערכי המצב של היסטוגרמה של המרחקים הם רק 55 יקרומטר (איור 3a). בנוסף, בעת צבירת ההיסטוגרמה מהנקודה שבה המרחק שווה לאפס, הערך שנצבר מגיע ל-90% ממספרי המדגם הכולל ב-~ 300 יקרומטר (איור 3b). ההיסטוגרמה הסופית של המרחקים בין שני משטחים הראו שיא אופייני סביב 50 μm. אם אנו מפרשים ערך זה מנקודת מבט מאקרוסקופית, מעניין, את הדיוק, את ערך המצב ~ 50 μm, מתאים למגבלה הגאומטרית, אשר היתה צפויה מגודל voxel של MRIs (איור 3a), כלומר, 100 μm. נקודה זו מרמזת בעקיפין על כך שהאלגוריתם החופף, הקאמרי ה, בין ה-MRI לסריקת התלת-ממד עבד בצורה מעולה ושרמות הרעש הן של ה-MRI והן הסריקה התלת-ממדית דוכאו כערך נמוך (איור 2a, b)¹⁴.

איור 1: הזרימה הניסיונית. (א) הראשון, לאחר חילוץ המוח מעכבר, המוח צנח לתוך פתרון חיתוך בודימם. (ב) לאחר ניגוב תמיסת החיתוך עם מגבת רכה ובעלת ספיגה גבוהה, (ג) נסרק המוח על גבי פטיפון. (ד) בעשיית פרוסות (שלב 8 של התהליך), גושי המוח נסרקו על bbb כי זה קל להזיז בלוקים המוח לבסיס עבור הרטט (שלבים 7 ו 8 של התהליך). (ה) לאחר קבלת מספיק פרוסות להקלטת פעילויות חשמליות או לצביעת הפצות התאים ושיטות אחרות, בלוקי המוח הנותרים נסרקו שוב (שלב 10 של התהליך). עובי גושי המוח הנותרים סיפק מידע תמיכה חשוב נוסף של מקום ממנו נלקחו הפרוסות. (ו) לבסוף, הקלטנו את הפעילות הפונקציונלית או את הארכיטקטורות המבבניות באמצעות השיטות של ה-MEA או הצביעת ושיטות אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צינור עיבוד הנתונים. (א) דוגמה של משטח קורטימי המיוצר על ידי cortexes החשפנות מתוך אמצעי אחסון MRI כפי שהוסבר בסעיפים 8 ו -9 של הפרוטוקול. (ב) דוגמה של משטח קליפת גוף שנסרק ישירות על-ידי מערכת סורק תלת-ממדי. (ג) דוגמה למזכר ששימש לסיכום אזור המוח ממנו חולצו פרוסות המוח הבודדות. (ד) דוגמה כאשר הפרוסה הקורטיקלית היא על צלחת אלקטרודה. (ה) דוגמה של פרוסה קליפת המוח מוכתם על ידי neun (אדום) ו GAD67 (ירוק). כל המידע ייאסף כעת במסד נתונים מאוחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיוק חופף בין הסריקות MRIs ו 3D. (א) היסטגרמות מרחקים בין משטחים שחולצו באמצעות פילינג מתוך כמויות MRI. המשטחים הגיעו מהקלטות סריקה תלת-ממדית. גרף הבר הראשי הוא היסטוגרמה הממוצע לכל האנשים, וקווים צבעוניים אחרים הם תוצאות עבור עכברים בודדים (N = 6, בגילאי 21 – 40 ימים, כולם היו עכברים נקבה). מגמה כללית, יציבה עבור כל האנשים, ניתן למצוא. (ב) הערך המצטבר של ההיסטוגרמה מוצג כגרף עמודות. האחוז שנצבר הגיע 90% ב ~ 300 יקרומטר (קווים מנוקדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: התמונה המשדמות של שני מאזני מידע המשולבים בממשק משתמש גרפי אחד (GUI). הן אנטומית המוח המאקרוסקופי והן מידע המעגל העצבי המיקרוסקופית שולבו במערכת אחת המיוצגת על ידי רשת. רמת הדיוק הגבוהה, המוצגת באיור 3, אפשרה לנו לשלב בין שתי הסולמות הללו במציאות. התמונה המאקרוסקופית המוצגת כאן היא מתוך אטלס מוח מדרגי¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הפרמטרים של הרכישה של רצף הפולס נדיר תלת-ממד המשמש במחקר זה.

פיתחנו פרוטוקול חדש שנקרא פרוטוקול 3D-NEO לגשר מאקרוסקופי ומיקרוסקופית קשקשים מרחבית על ידי חופפים שני משטחי המוח בצורה מדויקת יותר מבעבר. במקור, היו שני אתגרים ביצירת פרוטוקול זה אשר הפכה את החפיפה המדויקת של שתי תמונות משטח המוח והקלטת פעילויות נוירואליות בריאה מאורגניזמים חיים. ראשית, היה צורך לנגב ביעילות את פתרון החיתוך סביב המוח המחולצים לאחר שהוציא אותו מהגולגולת מבלי לפגוע באורגניזם המוח (שלב 6.2 של הפרוטוקול). שנית, מאז התנאי הראשון והשלישי של יובש ועיכוב זמן הם גורמים שליליים פוטנציאליים האורגניזם החי, לסיים את כל השלבים של תהליך הסריקה מפני חילוץ המוח ההכנות פרוסה בתוך 10 – 15 דקות היה גם צורך לשמור הנוירונים פעילים.

היכולת להקליט בהצלחה את פעילות המוח באמצעות פרוטוקול זה הפכה את האפשרות לתיאום לא רק של ארגונים מבניים אלא גם לפעילויות פונקציונליות במפת המוח כולה. עוד היבט חיובי של פרוטוקול זה הוא כי מאז BBB היה מוכן, הכיול מהסורק אל בסיס של הרטט הפך הרבה יותר חלק.

כפי שהוזכר בתוצאות הנציג, היסטוגרמה של מרחקים בין שני משטחים הראה שיא בסביבות 50 μm. למרות שעשינו את התהליך החופף, כאילו בראותו מנקודת המבט המקרו-סקופית. אם לפרש את התוצאה מנקודת המבט המיקרוסקופית, 50 יקרומטר הוא קנה מידה מרחבי דומה בהתפלגות של נוירונים, מאז קישוריות הסתברות בין זוגות של ניוון נוירונים בקליפת המין בתוך ~ 100 יקרומטר^16,17, אפילו בתוך מספר מילימטרים¹⁸. כמעט, מאה או לימודי דימות סידן לעתים קרובות להשתמש 300 – 400 יקרומטר פרוסות עבות. לכן, הטכניקה המוצגת כאן תספק הוכחה אובייקטיבית חזקה אם הפרוסות מוטבעות כראוי לתוך מפות המוח המקורי. לאחר שהחפיפה מושגת באופן מדויק, הדיוק הנוסף נצבר באופן גרידא מהמידע המקומי הנצפה תחת מיקרוסקופ. לכן, על-ידי ביצוע תהליך אופטימיזציה של שני שלבים המורכב משלבי אופטימיזציה גלובליים ומקומיים, ניתן יהיה להגיע לרזולוציה מרחבית השווה חצי-אוטומטית לגודל האופייני של תא עצב בעתיד.

פרוטוקול שילוב מדויק זה מספק טכנולוגיה בסיסית כדי ליצור אטלסים במוח שונים^18,20,21 ואף ללמוד יותר מעמיק את ה-MRI של פרימטים אחרים^22,23 ואדם מוחות לאחר המוות (למרות המוח האנושי יש sulci, אפשר לקבל מספר מספיק של נקודות הקלטה של gyri). כעת, אנו גם מפתחים ממשק ויזואלי לשילוב דגימות נתונים מוקלטות רבות לתוך קואורדינטת מרחבית משותפת אחת. דמות תמונה אחת כגון זו מוצגת באיור 4. במקרים של מוחות היונקים, השילוב בין קשקשים שונים כמותית מאפשר גם התקדמות חדשה בצורה איכותית בהבנת מצבי מחלות ובהערכת השפעות הסמים. בדרך כלל, זה יהיה קשה להחיל על הדגים, זוחלים, ודו-חיים, כי החוקרים תתקשה לשמור את הצורה של המוח המוחלץ יציב לטופס מופק מראש שלה, ו-MRI תמונות של המוחות הקטנים שלהם יהיה גם רועש יחסית.

הפרוטוקול 3D-NEO כבר הציג על ידי מחקר זה לתוך שדה נוירומדעי או תא מחקר ביולוגי, בהצלחה להפגין דיוק גבוה בגישור בין אנטומיה מאקרוסקופית והפצה עצבית מיקרוסקופיים, כולל ארכיטקטורות טופולוגי של מאקרו-ומיקרו-התחברות.

. למחברים אין מה לגלות

טרשת נפוצה אסירת תודה על התמיכה של כל הצוות בקורס הנדסת מידע רפואי בבית הספר לרפואה והפקולטה לרפואה, ורוצה להודות לפרופ ' טטסויה טקאקווה, פרופ ' נובוקאטסו סורמוטו, ודוריס זקיאן לתועלת ערות. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק סיוע למחקר גישוש מאתגרת ועל ידי היוזמה המובילה לתוכנית חוקרים צעירים מצוינים (מנהיג) לטרשת נפוצה מ-MEXT (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, וטכנולוגיה). ניסויי ה-MRI בעבודה זו בוצעו בחטיבה למטרות MRI של בעלי חיים קטנים, מרכז תמיכה במחקר רפואי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת קיוטו, יפן.