העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγ^null מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

תקנות אתיות ואתגרים טכניים לחקר פתולוגיה אנושית, אימונולוגיה ופיתוח טיפולית יש להציב מודלים בעלי חיים קטנים ביקוש גבוה. עם קרוב גנטיות והתנהגותיות דימיון של בני אדם, חיות קטנות כמו העכבר הם מועמדים טובים עבור מחלות אנושיות מודלים, שדרכו תסמינים דמויי אנוש ותגובות יכול להיות recapitulated. יתר על כן, ניתן לשנות את הרקע הגנטי של העכבר כדי להתאים לדרישות מגוונות. העכבר^null (NSG) הנד/SCID/IL2rγ הוא אחד של זנים העכבר immunocompromised הנפוצה ביותר; זה מאפשר engraftment עם תאי גזע אנושי hematopoietic ו/או ברקמות אנושיות ופיתוח עוקבות של מערכת החיסון האנושית פונקציונלי. . זה יהווה אבן דרך קריטית להבנת הפרוגנוזה של הפתופיזיולוגיה של האדם הספציפי מחלות כמו איידס, סיוע בחיפוש אחר תרופה... במסמך זה, מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת מודל העכבר NSG humanized (hu-NSG) על ידי השתלת תא גזע hematopoietic לתוך עכבר ממוזגים קרינה NSG neonatal. המודל העכבר hu-NSG מציגה פיתוח השושלת רב המושתלים תאי גזע אנושי הרגישות לזיהום נגיפי HIV-1. זה גם recapitulates מאפיינים ביולוגיים מרכזיים בתגובה לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה).

כי הקמת בדגמים בעלי חיים מסוימים עבור מחלות אנושיות היא המפתח למציאת תרופה, מודלים בעלי חיים המתאימים זמן היה נרדף, שיפור לאורך זמן. פותחו זנים מרובים של מודלים מאתר immunocompromised, כי היתר את engraftment של רקמות או תאים אנושיים והוצאה לפועל עוקבות של פונקציות humanized^1,2. מודל העכבר humanized שכזה הם קריטיים עבור חקירות של מחלות האדם הספציפי^3,4,5.

אידס (איידס) הנובע זיהום עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא דוגמה אחת. לפני הקמת העכבר humanized מודלים, אתיים ומגבלות טכניות מוגבלת HIV/איידס פרה מחקרים שנעשו בבעלי חיים קופים³. עם זאת, הוצאות גבוהה ודרישות עבור טיפול מיוחדים עבור חיה כזאת לעכב HIV/איידס בלימודים אקדמיים הגדרות אופייניות. HIV בעיקר מדביק CD4 + T-תאים אנושיים, משפיעה על פיתוח, תגובות מערכת החיסון של תאים חיסוניים אנושיים אחרים כגון תאי-B, מקרופאגים תאים דנדריטים⁶; לכן, מודלים בעלי חיים קטנים מושתלים עם תפקודי מערכות החיסון האנושית יש ביקוש גבוה.

פריצת דרך הגיע בשנת 1988, כאשר היו עכברים CB17 -scid עם מוטציה Prkdc^scid פיתח והראה engraftment מוצלחת של מערכת החיסון האנושית¹. התוצאות Prkdc^scid מוטציה בפונקציות פגומים T - ו B-cell, מערכת חיסונית אדפטיבית ablated בעכברים, ובעקבותיו את engraftment של האדם ההיקפית תאי תאי (PBMCs), תאי גזע hematopoietic (HSCs), הדם, רקמות העובר hematopoietic^7,8. עם זאת, רמות נמוכות של engraftment הם נצפו לעתים קרובות במודל זה; סיבות אפשריות הן 1) שיורית הפעילות החיסונית מולדת מאופנן באמצעות הרוצח הטבעיים (NK)-תאים ופיתוח 2) בשלב מאוחר של העכבר T - ו B-תאים (leakiness)⁵. התפתחות סוכרת שאינו שמנים (הנד) עוקבות-scid העכבר דגם מושגת דרמטי למטה-ויסות פעילות תאי NK; לפיכך, הוא מסוגל לתמוך לרמה גבוהה יותר engraftment בר-קיימא של רכיבי מערכת החיסון האנושית⁹. בכדי לדכא או לעכב התפתחות של מולדת חסינות, מודלים העכבר זוקף לחיתוך או מהממת של interleukin-2 קולטן γ-הרשת (Il2rg) (הנד) -scid רקע הוקמו. Il2rg, הידוע גם בשם נפוץ ציטוקין קולטן γ שרשרת, היא מרכיב חיוני של שונים ציטוקין קולטנים^10,11,12,13. זנים כמו במנוד ראש. Cg -Prkdc^scidIl2rg^tm1Wji (NSG) NODShi.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug (ליקר) נוכח שיבוש חזקים העכבר ציטוקין איתות ו אבלציה מלאה של התפתחות תאי NK, ב בנוסף ליקוי חמור של חסינות מסתגלת^14,15,16.

שלושה דגמים העכבר humanized הנושאת scid מוטציה, נוקאאוט Il2rg לעתים קרובות המועסקים ב- HIV/איידס המחקר: המודל בייקון (מח עצם הכבד קורנית) את מודל למידה (ליקוציט דם היקפיים), המודל SRC (SCID לאכלס מחדש תא) ³. בייקון מודל נוצר באמצעות ניתוח השתלת כבד עוברי אנושי, התימוס מתחת הקפסולה כליות העכבר בליווי ורידיות העובר בכבד HSCs^3,17,18. המודל העכבר BLT מציע יעילות גבוהה engraftment, התפתחות תאים אנושיים hematopoietic בתוך כל שושלות, והקמת מערכת חיסונית חזקה האנושי; בנוסף, תאי-T משכילים ב בלוטת התימוס עצמיים אנושית ולהציג מוגבלת הלע תגובות חיסוניות^4,5,17,19. עם זאת, הדרישה ניתוחים נשאר החיסרון העיקרי של המודל BLT. המודל העכבר למידה נוסדה על ידי זריקה תוך ורידי עם תאי הלימפה היקפי אדם. מודל למידה מציע נוחות ותשואות engraftment T-cell מוצלחת, אבל היישום שלו הוא מוגבל בשל תאי B לא מספיק מיאלואידית תא engraftment, רמות נמוכות engraftment הכללית, ואת תחילתה של חמור שתל – מול – מארח מחלות (GVHD)^{3 ,20}. המודל העכבר SRC נקבעת באמצעות הזרקה של האדם HSCs לתוך עכברים SCID היילוד או צעירים למבוגרים. זה מוצגים engraftment הממוצע יעילות מעל 25% (העריכו דם היקפיים CD45 אחוז) ותומך פיתוח מרובת-השושלת HSCs מוזרק, לפתח את מערכת החיסון האנושית מולדת. עם זאת, המגבלה של המודל SRC היא כי התגובה תא T הוא עכבר H2-מוגבל במקום האנושי מוגבלת הלע^14,21.

המודל העכבר SRC נחשב למודל נתיישב ואמין פרה HIV/איידס קטן מחקרים שנעשו בבעלי חיים, ומעוררות את engraftment עקבית של מערכת החיסון האנושית ופיתוח hematopoietic מוצלח. אנו קודם לכן דיווח על הקמת מודל העכבר NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG), תיאר את היישום שלה שכפול HIV, השהיה מחקרים^22,23,24. מודל זה העכבר hu-NSG תערוכות רמות גבוהות של מח עצם יונת, הרגישות הידבקות ב- HIV, ואת החוק הביוגנטי של הידבקות ב- HIV ו פתוגנזה. בנוסף, דגם hu-NSG העכבר מגיב כראוי לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), recapitulates פלזמה ריבאונד ויראלי על העגלה נסיגה, המאשרת הקמת HIV השהיה מאגר^{25,26 ,27}. זה מאגר השהיה HIV עוד תימוכין על ידי הייצור של המוסמכים-שכפול HIV וירוסים לשעבר vivo המושרה על ידי האדם נח CD4 + T תאים מבודדים של עכברים נגועים ו שטופלו העגלה hu-NSG.

במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור הקמת המודל העכבר hu-NSG של עכברים NSG neonatal, לרבות ההליכים הקשורים זיהום ב- HIV וטיפול העגלה לפיתוח השהיה. אנו מצפים פרוטוקול זה להציע סט חדש של גישות במחקרים בעלי חיים HIV לגבי HIV וירולוגיה, השהיה, וטיפול.

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים בוצעו על פי פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי עיר של תקווה מוסדיים חיה הטיפול ועל שימוש הוועדה (IACUC) שנערך על-ידי החוקר הראשי של מחקר זה (ד ר ג'ון רוסי, IACUC #12034). רקמת הכבד העובר האנושי הושג ממשאבים מתקדמים Bioscience (Alameda, CA), ארגון ללא מטרות רווח, על פי תקנות פדרליים ועל מצב. הספק משלו מוסדיים סקירה לוח (IRB), הוא תואם לדרישות ההגנה בסובייקט. PBMCs האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש דגימות דם היקפיים שהושלכו מתורמים בריאים אנונימי ממרכז העיר של תקווה דם התורם (דוארטה, CA), עם אין זיהוי לגבי גיל, גזע, מין או מוצא אתני. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. כללי עיסוק אספטי

1. ביצוע ניסויים תרביות רקמה למינאריים המיועדים לכך.
2. לשמור תרביות רקמה בינוני ותוספי מזון בתנאים סטריליים, סינון באמצעות לכהן יחידת סינון 0.22-מיקרומטר לשימוש.
3. לשמר את HSCs האדם מוכן צינורות סטרילי ולשמור בקירור עד זריקה.
4. כתוצאה חיסוני חמור, להתמודד עם עכברים NSG גילוח ורחיצה כירורגית. ללבוש שמלה ניתוח חד פעמיות, כובע שיער, מסכת פנים, ערדליים וכפפות למניעת זיהום. לנקות את השטח ספסל בעל הקרנה, אינדוקציה תא הרדמה עם כלור דיאוקסיד מבוסס sterilant (למשל, Clidox) לפני ואחרי ניסויים.
5. להחיל משחה מבוססי נפט העין לאחר דימום רטרו-מסלולית למניעת יובש בעיניים.
6. לשנות ל המכילות אנטיביוטיקה בתזונה כדי למנוע זיהום עקב דימום רטרו-מסלולית.

2. טיפול ב- HIV, נגוע בווירוס מכרסמים, המכיל וירוס דגימות דם/רקמה

זהירות: HIV היא פתוגניות מחלקה 3; הטיפול לציית לכללים בדיוק.

1. להתמודד עם דגימות המכיל וירוס HIV ב BSL2 המיועד + / מעבדה 3 שטח. נעל המכיל וירוס ריאגנטים בצורה מאובטחת במיכל משני במהלך תחבורה. לחטא את המשטח החיצוני של כל הגורמים המכילים המשמשים על ידי ניגוב יסודי עם 10% מלבין, אלכוהול איזופרופיל לפני תחבורה.
2. שמור כל פסולת המכילה וירוס המיועדת פסולת מכולות עם 2-3 שכבות של שקיות פסולת ותברואה. לפני לסילוק פסולת, לחטא בהתזה בנדיבות את הפסולת עם יוד/קנולה אתוקסילט nonylphenol פתרון (למשל, Wescodyne) והחיטוי.
3. ללבוש ציוד מגן אישי: כובע שיער, כיסוי הפנים, מגן התזה נגד פניו, ערדליים, ניתוח חד פעמיות חלוק וכפפות שכבה כפולה.
4. להתמודד עם מכרסמים נגועים בזהירות מירבית. התנהלות זריקות ואוספים דם תוך עכברים. הם תחת הרדמה (שלבים 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3, ו- 8.1-8.2).

3. בידוד תאי גזע Hematopoietic

1. להכין collagenase/dispase פתרון לעיכול רקמות.
   1. לפזר אבקת collagenase/dispase כדי פתרון מניות-ריכוז של 100 מ"ג/מ"ל, ואחסן פתרון מניות collagenase/dispase aliquots µL 150 ב-20 ° C.
   2. לעבודה collagenase פתרון, לדלל 150 µL collagenase/dispase מניות עם 15 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
      הערה: הריכוז הסופי של collagenase/dispase לעיכול רקמות היא 1 מ"ג/מ"ל.
2. עם סכין גילוח סטרילי, לחתוך הכבד רקמה עוברית (16-24 שבועות הריון) לחתיכות קטנות (כ 2-3 מ מ³ בגודל) ואחריו העיכול עם פתרון collagenase/dispase (1 מ"ג/מ"ל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לכוון את עוצמת הקול של פתרון מערכת העיכול כך כל החלקים רקמות באופן מלא טובע. להשתמש בקצה האחורי של מזרק הבוכנה בעדינות לטחון את דגימת רקמה כדי להקל על עיכול.
3. עוברים את התערובת עיכול מסנן רשת ניילון סטרילי 70-מיקרומטר לרכוש השעיה תא בודד.
4. להעשיר עבור CD34 + HSCs באמצעות מערכת מקינטוש לפי הוראות היצרן.
5. לספור את אחוז קיימא מועשר CD34 + HSCs באמצעות hemacytometer של²⁸ והמשך intrahepatic הזרקה לתוך עכברים NSG neonatal.
6. להקפיא שנותרו מועשר CD34 + HSCs קפואים מדיה (למשל, CryoStor CS2) ולשמר תאים במיכל חנקן נוזלי. בעת שימוש בעתיד, לספור מחדש את אחוז המופשרים CD34 + HSCs לפני הזרקת קיימא. עם השימוש של הקפאת מדיה, לאחר ההפשרה הכדאיות הוא בין 80 ל-90%.

4. intrahepatic הזרקה של האדם CD34 + HSCs בעכברים Neonatal NSG

הערה: עכברים Neonatal NSG 2-3 ימים מהלידה הם המתאימים ביותר עבור הליך זה, כפי שהם חזקים מספיק כדי לשאת את הקרנה במינון קטלני חצי, בזמן מספיק צעיר כדי לגמרי לקויי מערכות החיסון. בלי הרדמה נדרש הזריקה HSC.

1. מקום השגר כולו של עכברים NSG neonatal (בדרך כלל 5-10 עכברים, שני המינים) בתוך כלוב הקרנה בצורת עוגה סטרילי, לחשוף מנה סך של 200-250 cGy גמא קרינה ממקור קרינה צסיום-137. ודא שאת מינון הקרינה נמצא בטווח, כמו ירידה משמעותית במשקל או אפילו מוות יכול להיות שנצפו מתי NSG עכברים נחשפים מינונים גבוהים של הקרנה. ¹²
   הערה: קרינה היא סיכון בריאותי, הגנה אישית מפני קרינה יש לנקוט.
2. בעקבות הקרנה, להזריק כל עכבר NSG neonatal 5 x 10⁵ קיימא האנושי CD34 + HSCs באמצעות מלכודת מזרק/מחט (איור 1). ישירות מזריקים תאים לתוך הכבד.

5. engraftment אימות דרך רטרו-מסלולית דימום וניתוח Cytometry זרימה

1. ב 10-12 שבועות זריקה פוסט-מועדון הכדורגל מונפלייה, עזים ומתנגד עכברים באמצעות מכשיר אינהלציה איזופלוריין/חמצן. להתאים את זרימת החמצן כדי לשמור על אחוז איזופלוריין ב 4-5%. הרדמה לוקח 3-5 דקות, בהתאם לעכבר הבודד. עכברים כראוי ומורדמת להראות איטי דפוס נשימה עמוקה, ואני מגיבה לגירוי צובט את הבוהן.
2. לאסוף 50-100 µL מדם היקפי בכל עכבר באמצעות דגימה רטרו-מסלולית²⁸. לאחסן דגימות דם K2EDTA או צינורות איסוף דם heparinized כדי למנוע קרישה.
   הערה: צינורות איסוף דם נדרשים יש ציפוי נוגד קרישה, כך PBMCs העכבר ניתן לבודד כל הדם לניתוח cytometry זרימה. EDTA זה ידוע לעכב תגובות אנזימטיות כגון PCR ו- PCR לרביעיית; לפיכך, אם הזרם אנזימטיות נדרשים, השתמש מנגנון איסוף דם heparinized.
3. צנטריפוגה דגימות דם ב 2,000 x g במשך 20 דקות ב- 4 ° C עד הצניפה כדוריות הדם.
   1. להעביר את supernatants פלזמה חדשה צינורות microcentrifuge לאחר צנטריפוגה וחנות ב-80 מעלות צלזיוס אם ניתוח ציטוקין נדרשת.
   2. Lyse כדוריות דם אדומות (RBCs) בתוך גלולה תאי הדם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות באמצעות מאגר פירוק תאי הדם האדומים (טבלה של חומרים).
      הערה: אם דגימות פלסמה אינם נדרשים, ישירות lyse הדם שלם עם פירוק פתרון ללא צנטריפוגה.
4. גלולה כדוריות הדם שנותרו לאחר פירוק RBC ב g 300 x למשך 5 דקות ב 4 ° C; וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף את כדורי תא עם BSA 0.01% המכיל DPBS, צנטריפוגה ב 300 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה עוד פעם אחת.
5. לחסום תאים עם µL 100 1 x חסימת קוקטייל (טבלה 3 למתכון) במשך 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
6. לאחר חסימת, ישירות הוספת כל פתרון נוגדן התליה תא-ריכוז של 2 µL/10⁶ תאים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. נוגדנים עבור אימות engraftment הם: האנטי-האדם CD45 (לויקוציטים, RRID: AB_2732068), אדם אנטי CD3 (תאי-T, RRID: AB_396896), נגד CD4 (helper T-תאים, RRID: AB_397037), נגד CD8 (תאי-T ציטוטוקסיות, RRID: AB_2722501), נגד CD14 (monocytes, RRID: AB_10373536), ובני אנטי-אדם CD19 (תאי-B, RRID: AB_10373382). לקבלת לוח זרימה המוצע, עיין בטבלה 4 ו לטבלה של חומרים עבור הקטלוג, RRIDs ומספרי הרבה.
   הערה: נוגדן מכתים בחסימה הפתרון מבטלת שאינם ספציפיים קשירה של נוגדנים נגד לכיוון סמני משטח העכבר, כסמני משטח מספר לשתף הומולוגיה בין אדם ועכבר.
7. לבודד את PBMCs האנושית מתורמים בריאים להכין תזרים שהוכתמו יחיד cytometry פיצוי פקדי משתמש PBMCs האנושי מטוהרים. לחילופין, להשתמש microspheres התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיצוי שולטת.²⁹.
8. לנתח את דגימות הדם ההיקפיים באמצעות cytometer של זרימה ולכמת את האחוז של תאים CD45 + אנושיים, תאי CD3 + אדם, התאים CD14 + האדם האנושי CD19 + תאים מתאי הדם ההיקפיים הכולל.
   1. הידבקות ב- HIV במורד הזרם, מחקרים השהיה, לחשב את אחוז CD4 + T-תאים ותאי CD8 + T-בתוך תאי CD3 +.
      הערה: בדרך כלל, יחס CD4:CD8 בין 1.5 ל- 2.5 הוא ציין לפני זיהום ב- HIV³⁰.

6. ניתוח של הידבקות ב- HIV של עכברים hu-NSG ו פלזמה הנגיפי באמצעות לרביעיית-PCR

1. להפיץ את המניות נגיפי HIV BaL PBMCs האנושי מתורמים מאוד בריאים, הקציר ב זיהום שלאחר יום 10 ו- titrate באמצעות p24 אליסה קיט³¹.
2. בחר hu-NSG עכברים עם יותר מ 20% CD45 האנושי + תאים בדם היקפי הידבקות ב- HIV.
3. עזים ומתנגד hu-NSG עכברים באמצעות מכשיר אינהלציה איזופלוריין/חמצן (שלב 5.1).
4. לאחר שנוכח חיה. הוא מורדם, להחדיר וירוס HIV BaL במינון של 200 ng של p24 לכל העכבר דרך בקרום הבטן.
   הערה: להיות זהיר מאוד עם המחט, לא לעשות שימוש חוזר במחטים, ולבטל מיד לאחר השימוש לתוך מיכל חדה המיועד. לחטא את האזור של הזרקה לאחר וירוס.
5. שלושה שבועות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד hu-NSG עכברים ולאסוף דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית הדימום באמצעות heparinized צינורות קפילר וצינורות האוסף.
6. פלזמה נפרדים, כדוריות הדם על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 20 דקות.
7. Lyse RBCs. בלוק, כתם כדוריות הדם שנותרו עם נוגדנים לניתוח cytometry זרימה (סעיף 5.3-5.8).
   הערה: ניתוח cytometry זרימה להתמקד על השוואת יחס CD4:CD8 לפני ואחרי זיהום. צפויה ירידה משמעותית בספירת תאי CD4 +, בשם CD4 אנטיגן משמש קולטן שיתוף עבור ערך ויראלי.
8. שימוש דגימות פלסמה כדי לנתח את נגיפי האיידס לטעון באמצעות לרביעיית-PCR. לבודד RNA נגיפי מדגימות פלזמה באמצעות ערכת מיני נגיפי RNA. לבצע לרביעיית-PCR עם HIV-1 LTR ספציפיים תחל ומגדיר בדיקה (רצף פרטים ב טבלה 5), באמצעות הפרוטוקול של היצרן.

7. אוראלי מינהל העגלה ואת האימות של נגיפי דיכוי (אופציונלי)

הערה: שלב זה הוא אופציונלי עבור חקירות מצ ח בנוגע HIV פרוגנוזה, וירולוגיה או פתופסיולוגיה הקשורות זיהום במהלך שלב דלקת חריפה. עגלת טיפול נגוע ב- HIV hu-NSG משמש כדי לסכם HIV השהיה בין בני אדם חולים שקיבלו את העגלה. עכברים נגועים ב- HIV בהצלחה hu-NSG ניתנת העגלה למשך 4 שבועות. העגלה משטר מורכב tenofovir fumarate disoproxil (TDF; 300 mg/קפסולה), emtricitabine (ה-FTC; 200 mg/קפסולה), raltegravir (RAL; 400 מ ג/קפסולה). המינון של העגלה לטיפול עכברים נגועים ב- HIV hu-NSG מותאמת על פי הגוף שטח (טבלה 1, משוואה 1, בטבלה 2)³².

1. לחשב את הכמות של כל התרופות הדרושות עבור כל הכלוב במהלך שבוע אחד של טיפול, אם לוקחים בחשבון את עוצמת הקול של הבקבוק מים, את מספר עכברים בכלוב כל, ואת צריכת מים יומית ממוצעת של 4 מ"ל לכל העכבר.
   הערה: נקודת המפתח בשלב זה נועד להבטיח כל עכבר רוכשת את המנה היומית שלה בתוך 4 מיליליטר מים לשתייה.
2. לטחון כל שלוש תרופות במינונים מנוכי עונתיות לאבקה בסדר, לפזר את תערובת אבקת במים ממותקים (למשל, Medidrop Suralose). לשנות את הבקבוק מים כל שבוע עם קוקטייל בעגלה מומס טרי סיפק מים ממותקים.
   הערה: האבקה סמים אולי לא לפזר מיד, ללחוץ נמרצות כדי להשיג השעיה הומוגנית לפני שחזר את הבקבוק על הכלוב אחזקות.
3. לאסוף דגימות דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית דם כל שבועיים ולנתח הן היחס CD4:CD8 באמצעות cytometry זרימה (סעיף 5.3-5.8) את המטען הנגיפי פלזמה באמצעות לרביעיית-PCR (בסעיף 6.6).
   הערה: בדרך כלל לאחר 4 שבועות של טיפול, המטען הנגיפי של פלזמה יורד אל מתחת למגבלת זיהוי, יחס טיפוסי CD4:CD8 משוחזר.

8. אימות של נגיפי ריבאונד על העגלה משיכה (אופציונלי)

הערה: השלב זה קריטי אימות המודל השהיה, כמו נגיפי ריבאונד על העגלה משיכה מספק עדות ישירה של מאגר השהיה. מומלץ גם לשמש ניסוי שליטה לחקירות טיפולית על HIV ריבאונד המדכאים.

1. תוכנית לנסיגה העגלה לאחר פלזמה עומסים ויראלי של דגימות דם היקפיים הם מתחת לגבול זיהוי והוא היחס CD4:CD8 משוחזר מגוון בין 1.5 ל- 2.5.
2. לאסוף דגימות דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית דימום כל 2 שבועות לאחר נסיגת העגלה. לעקוב מקרוב אחר השינוי פלזמה ויראלי טוען (סעיף 6.6) כמו גם היחס CD4:CD8 (סעיף 5.3-5.8).

ניתוח cytometry זרימה מתבצע בתדירות גבוהה כדי לאמת את טוהר HSCs מבודדים, להעריך את רמות engraftment, פרופיל החיסונית התגובות זיהום ויראלי, סקר העגלה היעילות. פאנל נוגדן טיפוסי מכיל נוגדנים fluorescently שכותרתו בודדים 4-6; לפיכך cytometer זרימה עם לייזרים מרובים ומבחר רחב של מסננים חיוני להשגת תוצאות מדויקות.

עבור אימות engraftment הראשונית, האדם CD45 + ספירת יכול לנוע בין 20% עד 80%, קבוצות משנה של לויקוציטים אנושיים אמור להופיע כמו אוכלוסיות נפרדת על תזרים דוט-העלילה (איור 2). היחס של CD4:CD8 נשאר בין 1.5 ל- 2.5 עבור אדם בריא; משמעותי CD4 + דלדול נצפית בדרך כלל על זיהום ויראלי, מניב יחס נמוך של CD4:CD8; שיקום של היחס בריא נצפית על עגלת טיפול (איור 3).

לרביעיית-PCR נותן גבול זיהוי של 40 RNA עותקים/mL של פלסמה; דילולים תקין נדרשים לפני הניסוי. פלזמה המון ויראלי שאותרו באמצעות PCR לרביעיית לאורך כל הקורס של משטר זיהום ועגלה ניתן להתוות, להשתמש כדי להעריך את היעילות של זיהום ועגלה (איור 4).

איור 1. מזרק/מחט לכיוונון המשמש עבור intrahepatic הזרקה.
הגדרת מזרק/מחט המילטון 80508 בהזמנה אישית כולל מחט 30-מד, 51-מ מארוך עם קצה שקוע ועם מזרק זכוכית של 50 המצורפת-µL. אחסון מרבי הזרקת בהליך זה הוא 25 µL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. נתונים cytometry זרימה מייצגים engraftment מוצלח, הפיתוחים של תאי הלימפה ו מיאלואידית בדם ההיקפי.
דגימות דם היקפיים בהצלחה מוכן צריך אוכלוסייה נפרדת הפרדות, ויש לו עכבר hu engrafted היטב-NSG T-cell, B-cell, מונוציט חיובי אוכלוסיות הציג הדם ההיקפיים. תרשים CD4:CD8 מומלץ לצורך חישוב יחס. ) engraftment מוצלח הראה יותר מ 25% CD45 + לויקוציטים אנושיים בדם היקפי; דיסקרטית אוכלוסיית b) תאי-B, c) ומונוציטים, d) תאי-T בין CD45 + לויקוציטים אנושיים; e) CD4 + עוזר תאי-T ו f) CD8 + T ציטוטוקסיות-תאים מופרדים היטב, ו g) מניבה יחס בין 1.5-2.5 ב- hu-NSG נגוע הזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. CD4 + תא ספירת השינויים לאורך כל הקורס של זיהום נגיפי, העגלה ועגלה לסגת.
התקדמות הזיהום, היחס CD4:CD8 יורד מ- 1.5-2.5 כדי > 1.0, יחס CD4:CD8 כבר שימש כפרמטר קליניים להערכת הפרוגנוזה HIV, כמו גם טיפול efficacies. ) זרימה נציג נתונים המצביעים על שינוי יחסי CD4:CD8 במהלך ניסיוני; b) טבלת מגמה השוואה המציין את האפקטיביות של העגלה, אשר יכול להיות מזוהה שוחזר אחוז תאי CD4 + T. זיהוי בספירת תאי CD4 + T על ידי cytometry זרימה. N: מספר עכברים שנבדקו = 6; קווי שגיאה: אומר ± ב- SEM * p < 0.05, * * p < 0.01, * * *p < 0.001, * * * p < 0.0001, ns: משמעותיים שונים. ניתוח ANOVA דו-כיווני הוא מועסק. איור מודפס עם הרשאה²². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 4. שינויים של RNA נגיפי סרום להעתיק מספרי לאורך כל הקורס של זיהום ויראלי, העגלה ועגלה לסגת
הזיהוי של פלזמה viremia בעכברים hu-NSG נגוע ב- HIV על ידי לרביעיית-PCR. האזור המוצלל מציין את פרק הזמן שבמהלכו העכברים קיבלו העגלה (מתוך 28 יום ל-70 יום כפי שמוצג). מגבלת של זיהוי (מסומן על ידי קו מקווקו) של ה-PCR וזמינותו היא (~ 110-160 RNA עותקים/מ"ל) ב- 50 עד 80 µL של פלסמה שהושג דרך הווריד של הזנב. כוכב (*) מציינת RNA נגיפי לא זוהה בבעלי העגלה שטופלו ב- 56 יום. סרום נגיפי RNA עותק מספר ניתח מ דגימות דם היקפיים משמש כראיה ישירה לגבי מידת זיהום ויראלי. זה צריך להיות בההסכם עם הניתוח זרימת CD4. N: מספר עכברים שנבדקו = 6; קווי שגיאה: אומר ± ב- SEM * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001, ns: משמעותיים שונים. ניתוח ANOVA דו-כיווני הוא מועסק. איור מודפס עם הרשאה²². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משוואה 1. תרגום מינון המבוסס על הגוף פני השטח (BSA).
משוואת לתרגום מינון גבוה עד מינון נגד חיות ניסוי קטן. הגורם_m K ניתן למצוא בטבלה מס ' 2.

טבלה 1- מנה יומית של תרופות בודדים בתוך העגלה משטר

בטבלה 2. משקל, BSA ו- K_ז תרשים גורם להמרת מינון

בטבלה 3. חסימת קוקטייל על כדוריות הדם מבודדים

בטבלה 4. הציע לוח צבע רב זרימה

טבלה 5. HIV-1 LTR תחל, בדיקה

עכברים immunocompromised engrafted עם תאים/רקמה אנושית להציג מאפיינים פיזיולוגיים דמוי אדם, ערך עצום ללימודי פתולוגיה, פתופיזיולוגיה ו אימונולוגיה לגבי אדם ספציפי במחלות. בין הזנים מרובים של עכברים immunocompromised, הסימן. Cg -Prkdc^scidIl2rg^tm1Wji (NSG) הדגם הוא immunodeficient ביותר בשל חוסר חסינות מולדת והן אדפטיבית, כמו גם ציטוקין העכבר ספציפיים ablated איתות^3,12,19 . לכן, עכברים NSG כבר מנוצל בהרחבה תהליך ההאנשה, היא מבוססת היטב כי תאים אנושיים לאכלס בדם מאתר היקפי, הלימפה, רקמות תאים מיאלואידים, וייתכן כי העכברים ייתקלו המתאים החיסונית האנושית, התגובות stimulations זיהומיות כגון HIV^27,33.

בשל ההגבלה המארח של HIV, מחקרים שנעשו בבעלי חיים פרה של HIV וירולוגיה ולדלקת פרוגנוזה היו מוגבלים בעבר קופים נגועים עם כשל חיסוני הקופי וירוס (סיב, הגירסה אנושיות הפרימטים של HIV)³. התקדמות מדעית מחקר תאי גזע הדור של עכברים NSG פתחו את האפשרות של HIV מחקר על חיות קטנות מאתר עם עלות נמוכה יותר והמסירה ניסיוני מהר יותר. כיום, האנשה NSG יכולה להיות מושגת באמצעות השתלת רקמות העובר 1) HSCs האנושית (BLT מודל), אנושי 2) PBMCs (מודל למידה), ואת האדם 3) HSCs (מודל SRC). המודל BLT מציע את יעילות מרבית engraftment, כמו גם פיתוח מקיפה של שתי פונקציות הלימפה מיאלואידית^34,35, אך הוא תובעני מבחינה טכנית. מודל למידה היא הנוחה ביותר להקים אבל יש חלון ניסיוני קצר על engraftment הנובע GVHD; בנוסף זה רק מציע הגון תגובות T-cell היקפיים, חסר הלימפה ופיתוח מיאלואידית. מסיבות אלו, אנחנו מועסקים המודל SRC של פרוטוקול זה, עם עיבודים כדי לעמוד בדרישות לחקירות HIV. המודל hu-NSG הוא לחלוטין נטול תפקוד מערכת החיסון ויעיל -מח עצם ביות על קרינה והשתלות; יתר על כן, היא מאפשרת אתגר ויראלי וחקירות עוקבות בגיל צעיר יותר, הימנעות התפתחות בעיות פתולוגיים הקשורות לגיל ידוע על רקע המתח במנוד ראש. למרות תאי-T במודל hu-NSG ומתחנכים בסביבה הרתי העכבר הם רק מוגבלת H2, קבוצות משנה מרובים, אם לא כל, של תאים חיסוניים האנושי ניתן להתפתח, לישוב איברי הלימפה ואת מיאלואידית העכבר. במידה ניכרת, רקמת הלימפה הקשורים הבטן של דגם hu-NSG גם מחדש עם תאי מערכת החיסון האנושית; לכן, מודל זה יכול באופן פוטנציאלי תומך העברת הרירית HIV, הדומה BLT דגם^22,23.

אחד המכשולים העיקריים ל HIV ולחסל הוא קיומו של מאגר השהיה בקרב חולים שטופלו עם העגלה מדכאים^{33,36,37,38,39}. תאים נגועים לחשוף השבתה הדרגתית ולתרום ריבאונד נגיפי HIV על העגלה משיכה. השהיית מאגרים ממוקמים אנטומית את הכבד, הטחול, מוח, וברקמות הלימפה אחרים, מורכב בעיקר זיכרון תאי CD4 + T-^36,-^40,-⁴¹. כפי שדווח על ידי הקבוצה שלנו, דגם hu-NSG תומך באופן מלא לפיתוח שושלת היוחסין של T-cell, הופכים אותו למתאים לשימוש מידול פתולוגי של HIV השהיה. הראנו שמודל זה הוא רגישים מאוד לזיהום ויראלי ולאחר מכן ל משטר העגלה באמצעות הנהלת אוראלי. ריבאונד ויראלי דרמטי מתרחש מיד על העגלה נסיגה, אשר תומך באופן מלא את קיומו של מאגר השהיה. לחשוף נגוע זיכרון CD4 + T-תאים יכול להיות מבודד איברי הלימפה של נגוע ב- HIV hu-NSG במהלך העגלה, מבחני ויראלי תוצר מסכם את הדברים ריבאונד ויראלי לשעבר vivo⁴¹. דגם hu-NSG משטר זיהום/עגלת HIV שמתואר פרוטוקול זה ובכך יש יישומים רבים בתחומים הקשורים HIV וירולוגיה, זיהום פרוגנוזה, השהיה פתופסיולוגיה ופיתוח הרפוי תרופתי.

המודל העכבר hu-NSG ב פרוטוקול זה דורש הקרנה intrahepatic הזרקה של HSCs ביום 2-3 אחרי הלידה; לכן, הרבייה ללא צורך במיקור חוץ, תנאי מגורים מסוים נדרשים. למרות השתלת HSC neonatal מניבה בדרך כלל יעילות גבוהה engraftment, בחלק מהמקרים GVHD חמור יכול להתרחש. במקרים מסוימים, ניתן לראות ירידה משמעותית היקפיים CD45 + ספירת על זיהום, בתנאים קיצוניים, יכול להיות שנצפו דם היקפיים CD45 + דלדול; לכן, איסוף דם וניתוח cytometry זרימה יכול להיות מאתגר. אחת המגבלות הגדולות של מודל זה העכבר hu-NSG שוכן בתוך הטבע chimeric של תאי-טי שלה. תאי-T במודל עכבר hu-NSG משכילים בתוך הסביבה הרתי העכבר והם מוגבלת ל- H2, במקום להיות מוגבלת הלע; לכן, רפריזה מלאה של השינויים הדינמיים של T-cell קבוצות משנה על זיהום הוא פחות סביר. עוד יותר, למרות המודל העכבר hu-NSG מוצגים טוב הרגישות לזיהום HIV-1, המטען הנגיפי של פלזמה התצפיות ניתן several-fold נמוך יותר במודל בייקון, כנראה עקב למפת incomprehensive הלימפה האנושי ופונקציות מיאלואידית.

לסיכום, העכבר hu-NSG מצטיירת פרוטוקול זה מציעה מתודולוגיה קל ויעיל ליצירת מודל העכבר humanized ללימודים HIV וירולוגיה, השהיה, כחלופה למודל BLT. למרות מגבלותיה בפיתוח הלימפה ואת מיאלואידית מקיף, דגם hu-NSG הוכח לזיהומים ומגיב לסל הטיפול או אחרים הרפוי^22,23,24. המודל לפתולוגיה השהיית הוקמה על פי זה פרוטוקול recapitulates HIV ויראלי ריבאונד vivo בתוך , לחשוף זיכרון נגוע CD4 + T-תאים ניתן לבודד לחקירה נוספת.

המחברים לחשוף שאין ניגודי אינטרסים.

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [להעניק מספרים R01AI29329, R01AI42552, R01HL07470 J.J.R.] מכון הסרטן הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים [מספר גרנט P30CA033572 כדי לתמוך עיר של תקווה אינטגרטיבית גנומיקה פרמקולוגיה אנליטית, ליבות Cytometry אנליטית]. הכימית הבאה הושג באמצעות הפניה ריאגנט התוכנית, חלוקה של איידס, NIAID, ומחקר של איידס NIH NIH: HIV BaL וירוס.