מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

בתהליך בכל המקום של היתוך קרום פתיחת הנקבוביות היתוך תיצור את החיבור הראשון בין שני תאים נפרדים לשעבר. במהלך הנוירוטרנסמיטר או שחרור הורמון באמצעות exocytosis, נקבובי ההיתוך יכול זמני לפתוח ולסגור שוב ושוב, קינטיקה שחרור מטען ויסות. דינמיקה נקבובית גם לקבוע את אופן מחזור שלפוחית; תוצאות resealing בלתי הפיכות החולף, "לנשק וברח" פיוז'ן, ואילו התרחבות מובילה היתוך מלא. כדי להבין טוב יותר מה גורמי מעצבי דינמיקה נקבובית, פתחנו assay לפקח היתוך הממברנה באמצעות קרינת השתקפות הפנימית מוחלטת מקוטב מיקרוסקופ (TIRF) עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec בתוך מוגדר היטב מבחינה ביוכימית במערכת במבחנה. פיוז'ן של שכותרתו fluorescently שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה חלבונים נ-מלכודת (נ-ורכבי שטח) עם מיסב bilayer מישוריים t-מלכודות, נתמך על כרית פולימר רכה (t-SBL, bilayer הנתמך-t), מנוטר. את assay משתמש ערוצי זרימת microfluidic המבטיחים צריכת מדגם מינימאלית תוך מתן צפיפות קבועה של רכבי שטח. ניצול שיפור האות המהיר עם העברת תוויות שומנים מתוך הרכב אל SBL במהלך היתוך, קינטיקה של העברת צבע שומנים מנוטרת. הרגישות של מיקרוסקופיה TIRF מאפשרת מעקב תוויות שומני פלורסנט בודדים, שממנו diffusivity שומנים וגודל SUV ניתן להסיק לכל אירוע היתוך. פעמי שחרור לצבוע ליפידים יכולה להיות הרבה יותר זמן מהצפוי למעבר הפרעה מנקבובי לצמיתות. באמצעות מודל המניח פיגור של שחרור שומנים נובע הנקבוביות הבהובים, נקבובית "פתיחות", את החלק היחסי של זמן הנקבובי נשאר פתוח במהלך היתוך, ניתן לאמוד. סמן מסיס ניתן גלום רכבי השטח עבור ניטור סימולטני של שומנים ושחרור מטען מסיס. מדידות כאלה מעידים כמה נקבוביים עשויים לחתום מחדש לאחר אובדן חלק מן המטען המסיס.

היתוך ממברנה הוא תהליך ביולוגי אוניוורסלי הנדרש סחר תאי של שומנים וחלבונים, הפרשה, הפריה, פיתוח, ואפוף כניסת וירוס לתוך אורגניזמים מארח ^1-3. עבור רוב תגובות היתוך התאי כולל שחרור של הורמונים ומוליכים עצביים באמצעות exocytosis, האנרגיה למזג שני bilayers שומנים מסופקת על ידי היווצרות של צרור ארבעה סליל בין חלבוני הקולטן חלבון מצורף גורם מאותו המקור המסיס N-ethylmaleimide רגיש (Snare), המעוגנת שלפוחית ​​(v-Snare) ואת קרום היעד (t-Snare) ^4, בהתאמה. Exocytosis שלפוחית ​​סינפטית הוא תגובת ההיתוך המוסדרת ההדוק ביותר והוא מתרחש בתוך אלפית שני לאחר הגעתו של ^1,4,5 פוטנציאל פעולה. נקבובי ההיתוך, הקשר הראשוני בין שני תאי פיוזינג, יכול להבהב פתוח וסגורים מספר פעמים לפני resealing או להרחיב באופן בלתי הפיך ^5-7. התוצאות לשעברב חולף, "לנשק & לרוץ" היתוך, בעוד המוביל האחרון היתוך מלא. גורמים הקובעים את האיזון בין שני מצבים אלה של היתוך ומנגנוני ויסות מהבהב נקבובי אינם מובנים היטב ^5,8.

חלבוני מלכודת נדרשים עבור exocytosis; איחוי שלפוחית ​​סינפטית הוא בוטל על המחשוף של מלכודות ידי neurotoxins ^9. ניסויי היתוך גורפים באמצעות שלפוחית ​​unilamellar קטן (רכבי שטח) הראו כי מלכודות אינן נדרשות רק, אלא גם מספיק לנהוג היתוך קרום ^10. ב assay בתפזורת זו, רכבי השטח מחדש עם v-מלכודות (נ-SUV) היו מסוממים עם פוספוליפידים ניאון (N - (7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazol-4-י.ל.) -phosphoethanolamine (NBD-PE) ו ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) ומעורבבים עם שלפוחית ​​ללא תווית המכילה t-מלכודות (t-SUV) בתחילה את הקרינה של-PE NBD ב-ורכבי שטח נ הוא הרווה ידי תהודה פורסטר אנרגיה העברה (סריג ) כדי LR-PE. כמו במעבדהeled נ-ורכבי שטח פתיל עם t-ורכבי שטח ללא תווית, צפיפות שטח fluorophore בקרום בשילוב עכשיו מצטמצמת ואת הגידול וכתוצאה מכך קרינת NBD-PE מדווח על היקף שומני ערבוב ^10. כמו assay בתפזורת קל להגדיר ולנתח, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור מנגנונים של היתוך בתיווך מלכודת ^10-14. עם זאת, יש מספר מגבלות, כגון רגישות נמוכה ורזולוצית זמן עניה. והכי חשוב, כמו מדידת הרכב, זה ממוצעי תוצאות לאורך כל האירועים עושים אפליה בין העגינה ואיחוי, כמו גם זיהוי של חומרי ביניים hemifusion קשים.

במהלך עשור הקבוצות כמה בעבר, כוללים שלנו, פתח מבחנים חדשים לפקח אירועי היתוך ברמת שלפוחית ​​יחיד ^15-27. Ha ועמיתיו השתמשו-ורכבי שטח נ קשורים על גבי משטח ומפוקחי ההיתוך שלהם עם ^18,19 t-ורכבי שטח חינם. ערבוב ליפידים היה פיקוח באמצעות סריג בין זוג fluorophores הנכנס השומנים emמיטות ב V- ו-ורכבי שטח t, בהתאמה, באמצעות קרינת השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) מיקרוסקופיה ^18. מאוחר יותר, המעבדה של Brunger השתמשה מיני שומני תווית אחת יחד עם סמן תוכן עבור זיהוי סימולטני של שומנים ותכני ערבוב ^20,28. הן השומנים ואת סמני תוכן נכללו בריכוזים גבוהים, מרווה עצמית; פיוז'ן עם רכבי שטח ללא תווית הביא קרינת dequenching ^20,28.

לאחרים יש התמזגו נ-רכבי השטח כדי bilayers מישוריים מחדש עם t-מלכודות ^{15-17,21-27,29.} הגיאומטריה מישוריים של היעד (t-Snare המכיל) bilayer מחק טוב יותר את תהליך ההיתוך הפיזיולוגי של קטנה, שלפוחית ​​מעוקלת מאוד עם קרום פלזמה שטוח. קבוצת סטיינם מועסקת ממברנות-פורש נקבובי מחדש עם t-מלכודות, תלוי מעל מצע סיליקון ניטריד נקבובי זוהתה היתוך עם רכבי שטח פרט נ באמצעות מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal ^23. אחרים ונ-ורכבי שטח משומש bilayers מישוריים מחדש עם t-מלכודות, נתמך על מצע זכוכית ^{15-17,21,22,24-27,29.} היתרון הגדול של שימוש bilayers נתמך (SBLs) היא כי מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כדי לזהות אירועים עגינה ואיחוי עם מעולה יחס אות לרעש וללא הפרעה מצד-ורכבי שטח נ בחינם, אם כי באמצעות מיקרופלואידיקה גם מספקת רזולוציה של אירוע יחיד באמצעות שדה רחוק תקן מיקרוסקופיה epifluorescence ^24.

אחת הבעיות המרכזיות היא האם וכיצד אינטראקציות bilayer המצע משפיע נתמך איכות bilayer ותהליך היתוך. עבודה מוקדמת עשתה שימוש SBLs מישוריים שנתמכו ישירות על מצע זכוכית או קוורץ ^15-17. SBLs אלה נעשו על ידי ספיחה, מתפרצת, מתפשטת ואיחוי של ממברנות t-SUV על פני המצע. זה מומש בקרוב, עם זאת, כי השמטת מרכיב t-Snare מפתח, SNAP25, מן SBLs ערוכים באופן זה הביא indistinguis קינטיקה עגינה ואיחוי נ-SUVדבר אליה מאלה שמתקבלות באמצעות t-מהלכודות ¹⁷ המלאות. בגלל SNAP25 דרוש לחלוטין עבור היתוך in vivo ^30,31, הרלוונטיות הפיזיולוגית של ניסיונות המוקדמים ההם הועמדה בסימן השאלה. קבוצתו של תם התגבר על אתגר זה באמצעות היווצרות bilayer מבוקרת נתמך טוב יותר ^21. זה היה אמור בתצהיר לאנגמיור-Blodgett עבור הכרוז הראשון ללא חלבון של SBL, ואחריו היתוך של monolayer כי עם t-ורכבי שטח ^21. זה הביא היתוך SNAP25 התלוי.

כדי למנוע חפצים פוטנציאליים הקשורים עם bilayer הנתמך ישירות על מצע זכוכית ללא צורך להשתמש בשיטות לאנגמיור-Blodgett, Karatekin et al. הציג פולים רך, התייבשות (אתילן גליקול) (PEG) כרית בין bilayer ואת המצע ^24. שינוי זה נבע גם היתוך SNAP25 תלוי ^24. Bilayers מרופד על שכבת פולימר רכה היה ידוע לשמר הטרנסממברני טובניידות החלבון ותפקודו ^32, וכבר נעשה שימוש במחקרים היתוך עם וירוסים ^33. בנוסף, bilayers PEGylated נראה לשמור על כמה יכולת לריפוי עצמי והם מאוד חזקים ^34,35. ראשית, שבריר זמין מסחרי, שרשרות PEG צמודי שומנים כלולים בקרום t-SUV. כאשר t-ורכבי שטח אלה פרצו ויוצרים bilayer מישוריים על מצע זכוכית, מברשת PEG מכסה גם עלונים של bilayer מישוריים. בגלל היווצרות bilayer מישוריים הוא מונע על ידי הדבקה של רשתות PEG שמסביב t-ורכבי שטח על גבי משטח הזכוכית הידרופילי, התפוצצות ליפוזום והיווצרות bilayer מישוריים אינם רגישים יחסית להרכב השומנים בשימוש. עם זאת, כאשר כמויות גדולות של כולסטרול כלולים, הגדלת הנכסים המלוכדים של רכבי השטח, רכבי השטח לא יכול להתפוצץ באופן ספונטני. אם זה מקרה, יוני הלם או divalent האוסמוטי יכולים להיות מועסקים על מנת לעזור היווצרות bilayer מישוריים ^25.

כאמור, ב ap זהproach מברשת PEG מכסה משני צידי מישוריים, נתמך bilayer. המברשת מול ערוץ הזרימה microfluidic מסייעת במניעת הידבקות ספציפית של רכבי שטח נ נכנסים אשר מכוסים גם בדרך כלל בשכבת PEG. כינונה של מתחמי V- וטי-Snare מתחיל מן הקרום-דיסטלי N-טרמיני תמורה בשלבים לעבר תחומי הפרוקסימלי קרום ^36. עבור-ורכבי שטח נ לקיים אינטראקציה עם t-SBL, את V- וטי-המלכודת N-Termini הצורך כדי לבלוט מעל מברשות PEG, אשר נראה כי המקרה בתנאים של assay. גובה מברשת ניתן להתאימו לחקר חלבונים אחרים מאשר מלכודות על ידי שינוי הצפיפות של שומני PEGylated ואת אורך שרשרת PEG ^37,38. יתרון נוסף של מברשות PEG כיסוי המשטחים הפרוקסימלי של bilayers פיוזינג הוא שהם לחקות את הסביבה הצפופה של ממברנות ביולוגיות אשר עמוסות 30,000-40,000 חלבונים בממברנה נפרדים לכל מ"ר מיקרון ^39. בדיוק כמו שרשראות PEG ב assay זה, repuשכבת חלבון lsive כיסוי ממברנות ביולוגיות צריכה להידחף הצידה כדי לאפשר קשר בין שני bilayers פוספוליפידים להיתוך להתרחש.

ערוצי זרימה microfluidic משמשים assay זה, כפי שהם מציעים יתרונות ייחודיים. ראשית, זרימת microfluidic מאפשרת בתצהיר אחיד יותר של רכבי שטח t להתפשט פתיל כדי ליצור את חולצת SBL. שנית, היקף הערוץ הקטן (<1 μl) ממזער צריכת מדגם. שלישית, בנפחים הקטנים נדרשים לאפשר הניסוי כולו להתנהל תחת זרם בלתי פוסק. תזרים מסיר חלש, יש להניח שאינו ספציפי,-ורכבי שטח נ דבקו מן SBL ^16. זה גם שומר צפיפות קבועה של רכבי שטח v מעל חולצת SBL, לפשט ניתוח הקינטית ^17. לבסוף, שלפוחית ​​עגנה נבדלת בקלות מאלו חינם נישאו על ידי הזרימה ^25. ניתן להשתמש הרביעית, כמה ערוצים microfluidic באותו coverslip, כל חיטוט מצב שונה. זה מאפשר השוואה של דורות תנאיםng בטווח ניסיוני אותו. גישה דומה נוצל בעבר על ידי קבוצת ואן Oijen ללמוד היתוך בין וירוס שפעת SBLs מרופד ^33.

במיקרוסקופיה TIRF, את הדעיכה מעריכית של שדה החלוף (עם קבוע דעיכה ~ 100 ננומטר) עירור קרינת גבולות למולקולות אלה נמצאים בסמיכות קרובות מאוד של הממשק-חיץ זכוכית. זה ממזער תרומה של מולקולות ניאון כי הם מרוחקים יותר, מגדיל את יחס אות לרעש, ומאפשר רגישות מולקולה בודדת עם זמני חשיפת מסגרת של 10-40 אלפיות שני. השדה חלוף גם מוביל לעליית אות על היתוך: כמו העברת השומנים שכותרתו מתוך הרכב לתוך SBL, הם מוצאים את עצמם, בממוצע, בשדה עירור חזק. עלייה זו הקרינה חזקה עבור ליפוזומים גדול.

אם אור המקוטב משמש להפקה בתחום החלוף, אפקטים נוספים לתרום לשינויי קרינה על transfer תוויות מתוך הרכב לתוך SBL. יש צבעי שומנים מסוימים כוללות דיפול המעבר בכיוון עם זווית העדיפה ממוצע ביחס bilayer שבה הם משובצים. זה יוצר הבדל בסך של הקרינה הנפלטת fluorophores כשהם נמצאים SUV מול SBL, מאז הקורה המקוטב שילהיב צבעים בשתי ממברנות שונות. לקבלה לשעבר, קורה העירור יהיה אינטראקציה עם הדיפולים מעבר אורינטציה ברחבי SUV הכדורי, ואילו האחרון, אורינטציות דיפול תהיינה מוגבלות על ידי גיאומטרית SBL השטוחה. לדוגמה, כאשר s-מקוטב לאור האירוע (מקוטב נורמלי אל מישור הפגיעה) משמש, עירור יעיל יותר כאשר צבען הוא SBL מאשר את המכונית בשביל מקביל אוריינטציה דיפול המעבר השומנים לצבוע קרום ^29,40 (כמו זה של DiI או עשה ^41-43). רכב שטח מסומם עם fluorophore כזה מופיע לעמעם כשזה רציפים על SBL (איור 7, Representat ive תוצאות). כתוצאה נקבובי היתוך פותח ומחבר את ממברנות SUV ו SBL, בדיקות ניאון מפוזר לתוך SBL ולהיות יותר סיכוי להיות נרגש שדה החלוף המקוטב של ^25,27,29. כתוצאה מכך, אות הקרינה שולב סביב אתר ההיתוך מגבירה בחדות במהלך העברה לצבוע מתוך הרכב לתוך ²⁷ SBL (איור 3 ו האיור 7). גורם נוסף שתורם לאותת שינויים נלווים היתוך dequenching של תוויות ניאון כפי שהם המדולל כאשר הועברו אל SBL. תרומת dequenching היא בדרך כלל מינורי לעומת תופעות ריקבון קיטוב שדה חלוף ב assay המתואר כאן, כי רק חלק קטן ( ) של השומנים מסומנים.

גידול האות על היתוך ניתן לנצל כדי להסיק נכסים נקבוביים היתוך ידי השוואה בין הזמן,1 "src =" / files / ftp_upload / 54,349 / 54349eq2.jpg "/>, הנדרשת עבור השומנים לברוח דרך נקבוביות כי הוא חדיר בחופשיות שומנים לזמן השחרור בפועל, . אם שני סולמות הזמן ניתנים להשוואה, זה היה להסיק כי נקבובי מציג התנגדות מעט זרימת שומנים. עם זאת, אם זמן השחרור בפועל הוא משמעותי יותר מאשר הזמן לשחרור דיפוזיה-מוגבל, זה היה להצביע על תהליך, כגון הבהוב נקבובי, מעכבי שחרור שומנים. שעת השחרור מוגבל דיפוזיה, , תלוי בגודל של liposome פיוזינג ו-diffusivity השומנים; להערכתה דורשת שני פרמטרים אלה כדי לכמת. רגישות המולקולה הבודדה של assay מאפשרת diffusivity שומנים כדי להימדד על ידי מעקב אחר כמה fluorophores שומנים יחידים לאחר שחרורם לתוך SBL לכל אירוע היתוך ^26. גודלו של כל שלפוחית ​​פיוזינגניתן לאמוד ²⁷ על ידי שילוב (i) את עוצמת צבע שומנים יחיד, (ii) שינוי הקרינה הכוללת סביב אתר עגינה אחרי הכל fluorophores מועבר לתוך SBL על היתוך, (iii) צפיפות התיוג הידועה של SUV שומנים, וכן (iv) באזור לכל שומנים. עבור אירועי היתוך רבים, פעמי שחרור שומנים בפועל נמצאו הרבה איטי מצפוי על ידי שחרור מבוקר דיפוזיה ^27, כפי שצוינו בהנחת גודל SUV האחיד בעבר ^44. בהנחת פיגור של שחרור שומנים נובע הנקבוביות הבהובים, מודל כמוני מאפשר אמיד של "פתיחות נקבובית", את החלק היחסי של זמן הנקבובי נשאר פתוח במהלך ההיתוך ^27.

בכל פעם מעשית, חשוב לבחון מנגנוני היתוך באמצעות שני שומנים ותוויות תוכן מסיסים. לדוגמא, הודעת שומנים יכולה להיות מפגר ידי תהליכים אחרים מאשר מהבהב נקבובי, כגון הגבלת דיפוזיה שומנים ידי חלבוני המלכודת מקיף tהוא נקבובי. אם זה היה המקרה, ולאחר מכן שחרר תוכן שתקדים שחרור תוויות שומנים, ספק את הנקבוביות הן גדולות מספיק כדי לאפשר מעבר של בדיקות מסיסות. פגם מהותי יותר בגישה יכול להיות ההנחה כי העברת שומנים שכותרתו אל SBL מתרחשת הדרך נקבובית היתוך צר המחבר את SBL על שלפוחית ​​כי שמרה צורה מראש ההיתוך שלה במידה רבה. העברת ליפידים לתוך SBL יכולה גם לנבוע התרחבות מהירה של הנקבובית ההיתוך עם תכונת לוואי, הקריסה מהירה מאוד של SUV לתוך קרום SBL, כמו בעבר מוצע מבוססת על נתוני שחרור שומנים לבד ^29. ניטור הוא השומנים ותכנים לשחרר בו זמנית, נמצא כי נקבוביים רבים חזרו וחתום לאחר שחרור כל תוויות השומנים שלהם, אבל שמור על כמה המטענים המסיסים שלהם ^27. זה מצביע על כך לפחות ליפוזומים כמה לא לקרוס לתוך SBL לאחר היתוך, וכי העביר לצבוע שומנים לתוך SBL מתרחש דרך נקבובית היתוך. בנוסף, lשחרור ipid ותכנים התרחשו בעת ובעונה אחת ^27, ולכן קטן הסיכוי כי פיגור של שחרור השומנים נבע מעצור של דיפוזיה השומנים ידי חלבונים המלכודת סביב הנקבובית ^45.

פרוטוקול היתוך SUV-SBL כי לא פקח על שחרור תוכן מסיס פורסם בעבר על ידי Karatekin ורוטמן ^25. הנה, ההתפתחויות אחרונות יותר כלולות, כלומר ניטור סימולטני של שומנים ותכנים לשחרר ואמידה של SUV, שומנים בדם, ומאפיינים נקבוביים היתוך ^27. פרוטוקול מתחיל עם הוראות להכנת תאים microfluidic, שנעשו על ידי מליטה פולי (siloxane דימתיל) (PDMS) אלסטומר המכיל לחסום חריצים עם coverslip זכוכית ^25. לאחר מכן, הכנה-ורכבי שטח נ עם שומנים הם וסמני תוכן מוסברת. סעיפים 4 ו -5 לספק הוראות להרכבת תאים microfluidic, להרכיב את SBLs באתרו ובדיקת ליקויים ונזילות, כניסתה של VSיובס לתוך תאי הזרימה וזיהוי של אירועי היתוך. סעיף 6 מספק הוראות לניתוח נתונים.

1. הכנת בלוק PDMS כדי ליצור את ערוץ microfluidic

Microfabrication איור 1. תבנית זרימת תא PDMS לחסום הכנה. (א) עיצוב של תא זרימת ארבעה ערוצים שמתאים על coverslip זכוכית 24 x 60 מ"מ (למטה). שישה עיצובים זהים מסודרים כדי להתאים על גבי פרוסות סיליקון 10 ס"מ (למעלה). (ב) לגזור בלוק של כ PDMS עבה 5-8 מ"מ על אגרופן חור. (C) קלטי צינור לתוך חור האגרוף באמצעות פינצטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. השג תבנית תא זרימה כגון אחד באיור 1 א. ערוצים אופייניים הם רחבים 0.3-1 מ"מ, 70-100 מיקרומטר גבוהים, וארוכים 1-2 סנטימטר. לפברק תבנית לנוing טכניקות photolithography סטנדרטי במתקן cleanroom ²⁵ או צו אם גישה לחדרים נקיים אינו זמין. לחלופין, מכונת תבנית עם ממדים גדולים יותר מחומר מתאים.
   הערה: צוות החדר נקי יכול לאמן ולהדריך משתמשים שנמנים (גישה למתקן cleanroom תמיד מוגבל למשתמשים עם הכשרה מתאימה) בתכנון והזמנת ניקוי מסכה, רקיק, ו photolithography. ברגע תבנית מתקבלת, ניתן להשתמש בו מחוץ לחדרים הנקיים שוב ושוב, בתנאי שהוא נשמר בצלחת סגורה טיפול נלקח להוציא אבק.
2. הכן תערובת של PDMS מיליליטר ~ 100 (אלסטומר בסיס סיליקון) ו ~ 10 מיליליטר של מקשר צולב (סוכן ריפוי) בתוך כוס פלסטיק חד פעמית. לשבור את קצה פיפטה פנויה לטפל PDMS הצמיגה יותר בקלות. לשקול את PDMS לתוך כוס פלסטיק כמו pipetting אינה מדויקת.
3. מערבבים את התערובת היטב. הסר את בועות אוויר רבות על ידי סילוק גזים בחלל ריק ייבוש (כ -20דקות). כמו הגביע מושם תחת ואקום, הבועות בתחילה תגדלנה בגודל, הגדלת נפח התערובת מאוד. השליטה ואקום כי מוחל לוודא שהכוס עמוקה מספיק כדי למנוע דליפה.
4. יוצקים ירידה גדולה של תערובת PDMS degassed לתוך צלחת זכוכית פטרי (150 מ"מ x 20 מ"מ) ולחץ על רקיק על PDMS עם תבנית פונה כלפי מעלה. זה ימנע בועות להילכד מתחת רקיק. בועות לכודים תרחבנה ועלולות להטות את הרקיק כאשר המנה מושמת בתנור. עכשיו לשפוך PDMS degassed על תבנית על גבי פרוסות סיליקון עד לכיסוי בכ 5-8 מ"מ של PMDS. אם בועת אוויר מתרחשת בעדינות להסיר אותו עם קצה פיפטה.
5. אופים את PMDS בתנור על 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. ודא כי המנה היא רמה.
6. השתמש בלהב סכין מנתחים חדש לגזור בלוק PDMS המכיל את מבני ערוץ היצוקים. הבלוק לגזור צריך להתאים על coverslip (ראה שלב 4.1.9).
7. מקלף את הגוש לגזור מהצלחת ו PLאס אותו על פיסת נייר אלומיניום נקי.
   הערה: בלוקי PMDS הצולבים יכולים להישמר במשך כמה חודשים. על אחת רקיק, יש 6 סטים של ערוצי זרימה (איור 1 א), כך 6 רחובות PDMS ניתן לייצר דפוס PDMS יחיד. לאחר חיתוך את כל 6 של אבני PDMS, חלקים רופפים נקי של PDMS, אבל חוץ מזה לא ניתן להסיר את PDMS הנותרים לפני ומזג cross-linking את המנה הבאה, אשר יחייב רק כמחצית PDMS המשמש את המנה הראשונה. תבנית טובה יכולה להימשך כמה שנים.
8. השתמש מחורר לקדוח דרך הבלוק PDMS בתנועה אחת ישר (איור 1B). התחל בצד של חריצי הערוץ. הקפד להסיר את חתיכת אגרוף מתוך PDMS. חזור על פעולה זו עבור כל שמונת החורים של עיצוב ערוץ ארבעה.
9. הנח את צד הערוץ לחסום PDMS למטה על גבי פיסה חדשה ללא קמטים של רדיד אלומיניום. אחסן את הבלוק עד כמה חודשים בתוך קופסא יבשה, אידיאלי ייבוש.
10. דחוף את הצינורות (0.25 מ"מ מזהה, 0.76 מ"מ OD) כשליש לתוך חור האגרוף באמצעות פינצטה (תרשים 1C). חותך את הצינורות מלוכסנים ל להחדרה קלה יותר. השאר צינורות מספיק זמן כדי להגיע מאגר SUV ואת משאבת המזרק, בהתאמה. לאחר צבת השבב התאסף על מיקרוסקופ, לחתוך את הצינורות שוב אם הם ארוכים מדי.
11. כדי להתחבר המזרקים של המשאבה, לחתוך קטע קצר של צינורות סיליקון גדולים (מזהה 0.51 מ"מ, 2.1 מ"מ OD) והכניס את הצינור הדק לתוך צד אחד. בלוק מוכן לשימוש זה של PDMS יכול להישמר במשך כמה חודשים.

2. Coverslip ניקוי

1. Coverslips נקי על פי הפרוטוקול המתואר Karatekin ורוטמן ²⁵ באמצעות תערובת חמצון חזקה של חומצה גופרתית (H ₂ SO ₄₎ ואת מי חמצן (H ₂ O _2). בצע נוהל זה בתוך חדר נקי, ולבחון אמצעי בטיחות נאותים. לחלופין, להשתמש ג cleanroom ניקהoverslip כי היא זמינה באופן מסחרי (ראה רשימת חומרים).

3. הכנה-ורכבי שטח נ המכילה גם שומנים ותוויות תוכן

ליפידים איור 2. סכמטי של הכנת SUV. מעורבבים בתוך שפופרת זכוכית (1) ממס מתאדה כדי ליצור סרט שומנים על ידי החלפה של הצינור בתוך אמבט מים (2). עקבות של ממס נותרים יוסרו תחת ואקום גבוה (3). סרט השומנים הוא hydrated חיץ כינון מחדש המכיל חומרי ניקוי וחלבון בעוד vortexed (4). אם לצבוע תוכן הוא להיות במארז, הוא נכלל בשלב זה, כמו גם בשלב הדילול (5). דילול של ריכוז חומר הניקוי מתחת ריכוז micelle הביקורתי שלה מוביל liposome היווצרות. דטרגנט הוא dialyzed ולא תחזור הלילה (6). עבור T-ורכבי שטח להיווצרות SBL כולל NBD-PE (ירוק), שלפוחית ​​הם ריחפו שיפוע צפיפות שנאספוהממשק בין שתי שכבות (7 א). כדי להפריד-ורכבי שטח נ בטוש תוכן Encapsulated מן לצבוע חינם המדגם הוא נדרס עמודה בגודל הדרה ונאספים 0.5 מ"ל שברים (7b). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. הכן 4 ליטר של חיץ הכינון מחדש, המכיל 25 מ"מ HEPES-KOH, 140 מ"מ KCl, 100 מיקרומטר EGTA ו 1 מ"מ DTT, pH 7.4. השתמש ביותר של החיץ עבור מיליליטר דיאליזה 100 לצעדים אחרים.
   הערה: מאגרים אחרים עשויים לשמש, אך חשוב לשמור על osmolarity חיץ עקבי לאורך כל הניסוי ולבחור התנאים שבהם חלבונים הם פונקציונליים. להכנה-ורכבי שטח נ המכילים תוויות שומנים רק וטי-ורכבי שטח, בצע Karatekin ורוטמן ^25.
2. בעוד המניות השומנים מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס כלורופורם או כלורופורם: מתנול (2: 1, V / V), לתת צלוחיות להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה כדילמנוע התעבות.
3. לשטוף שפופרת זכוכית עם כלורופורם כדי להסיר כמויות זעירות של חומר ניקוי ומערבבים ליפידים בבית היחס הרצוי עם סכום סופי של 1 μmol בתערובת של כלורופורם מתנול (2: 1, V / V). השתמש רק זכוכית מזרקים / צינורות לטפל ממסים אורגניים / שומנים מומסים.
   הערה: שומנים כאן הם השתמשו POPC: SAPE: DOPS: כולסטרול: PEG2000-DOPE: האם לפי יחס טוחנת של 57.4: 15: 12: 10: 4.6: 1 עבור שלפוחית ​​המכילה נ-המלכודת ואת POPC: SAPE: DOPS: כולסטרול : PI המוח (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5) עבור t-Snare ורכבי שטח. ראה חומר לפרטים. ניתן להשתמש קומפוזיציות שומנים אחרות.
4. להתאדות הממס תחת זרם עדין של חנקן, או מאייד סיבובי. לטבול את קצה הצינור באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) מחומם מעל טמפרטורת ההתכה הגבוהה ביותר של השומנים להניב סרט שומנים הומוגנית כדי למנוע שינויים גדולים בטמפרטורה תוך מתאדים הממסים. התחל ואקום בסביבות300 mbar עד שסרט השומנים נוצר, ואז להמשיך עבור ~ 2 דקות ואקום אפשרי הגבוה המאייד הסיבובי.
5. הסר את שפופרת זכוכית ועוטפים אותו בנייר אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור ולהסיר שאריות של ממס על ידי הנחת צינור ייבוש תחת ואקום גבוה במשך שעה לפחות 2. צעד זה גם יכול לרוץ לילה.
6. רעננותם סרט השומנים היבש, להכין תערובת של אבקת כביסה (n-Octyl-β-D-glucopyranoside, OG), חלבון (נ-מלכודות), ו SRB חיץ כינון מחדש (500 נפח סופי μl). לשמור על ריכוז חומר הניקוי הסופי ~ 2 פעמים מעל ריכוז micelle הביקורתי (CMC, 20-25 מ"מ עבור OG) ולהתאים את עוצמת הקול הסופי כך דטרגנט יחס שומנים הוא> 10. ממסי Sulforhodamine B (SRB) אבקה בתמיסת החלבון-דטרגנט לקבל ריכוז סופי של 10-50 מ"מ SRB ידי ניעור בעדינות את הפתרון. התאם את osmolarity של חיץ הכינון מחדש בעת הוספת ריכוזים גבוהים של SRB ידי צמצום שיתוףncentration של אשלגן כלורי בהתאם.
   הערה: יחס ליפידים לחלבון (LP) עבור t-מלכודות גבוה (LP ~ 20,000, ~ 70 t-מלכודות למ"ר מיקרון ^25.). באופן משמעותי צפיפויות t-Snare גבוהות SBL עלולות להוביל אגרגטים חלבון פעילים עם ^17,24 הקטינו את שיעורי ההיתוך משמעותי. LP עבור נ-מלכודות הוא הרבה יותר נמוך (LP ~ 200, ~ 7,000 נ-מלכודות לכל מיקרומטר ^2), קרוב צפיפויות נ-Snare למצוא ^46,47 שלפוחית ​​סינפטית. כדי להבטיח תפקוד חלבונים לאחר ביטוי רקומביננטי וטיהור V- וטי-מלכודות כדאי לבצע assay היתוך בתפזורת פשוט ⁴⁸ לפני שהם עוברים את כל השלבים של assay איחוי שלפוחית ​​היחיד.
7. הנער בעדינות את שפופרת הזכוכית המחוממת מראש המכילה את סרט שומנים היבש תוך הוספת פתרון החלבון-דטרגנט-SRB משלב 3.6. נסה להימנע מיצירת בועות. המשך ללחוץ במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
8. לדלל את חומר הניקוי פי חמישה על ידי הוספת כינון מחדשמאגר המכיל SRB (להוסיף 2 מ"ל, 2.5 נפח סופי מ"ל) תוך vortexing במהירות כדי למנוע הדרגתיים ריכוז. המשך ללחוץ במשך 15 דקות עד 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: יעילות כינון מחדש חלבון עליית דגירה ארוכה. הדילול המהיר מקטין את ריכוז חומרי הניקוי מתחת CMC ומוביל להיווצרות של ליפוזומים קטן.
9. Dialyze השעית השלפוחית ​​הראשון נגד ~ 1 ליטר של חיץ כינון מחדש במשך 1-2 שעות בטמפרטורת הסביבה ולאחר מכן נגד 3 ליטר של חיץ כינון מחדש הלילה ב 4 ° C עם 4 גרם של סופח קלקר, באמצעות צינור או קלטת דיאליזה 20,000 MWCO. השתמש כוסות שונות לדיאליזה של שלפוחית ​​עם ובלי SRB למנוע זיהום צולב.
10. לאזן עמודת סינון ג'ל עם חיץ כינון מחדש. הפעל את ההשעיה שלפוחית ​​דרך העמודה להפריד SRB חינם מן-ורכבי שטח נ עם SRB כמוס. השתמש חיץ הכינון מחדש ללא SRB כמו eluent פעם המדגם כולו ישנכנס בטור. אוספים ורכבי שטח נ ב 0.5 מ"ל שברים.
11. ודא אנקפסולציה SRB המוצלחת בריכוזים-רווה עצמית על ידי מדידת קרינת SRB לפני ואחרי תוספת של חומר ניקוי כדי aliquot של שלפוחית ^​​16. באמצעות ספקטרומטר קרינה, להלהיב את המדגם ב 550 ננומטר ו לסרוק את פליטת SRB בין 570 ננומטר ו 630 ננומטר. צופה עליית 4-8 לקפל קרינת SRB בהתאם לכמות הכמוסה על תוספת חומר ניקוי כמו הקרום הוא solubilized ואת SRB שוחרר הוא מדולל.
12. לאפיין את התאוששות שומנים וחלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית קרינת ²⁴ ו ג'ל אלקטרופורזה SDS-PAGE, בהתאמה. השתמש בשיטה מכתימה רגישה, במיוחד עבור דגימות t-SUV LP הגבוהה (ראה רשימת חומרים). בדרך כלל כ -50% הן קלט השומנים והחלבונים אבד במהלך תקופת ההכנה וכתוצאה מכך LP קרוב לערך הנקוב.
13. לאפיין גדלים SUV באמצעות אור דינאמי פיזור ²⁴ או אלקטרונים microscoפירו ^48. SRB חנות המכילה ורכבי שטח נ ב 4 ° C עד ~ 3-4 ימים. אין להקפיא, כמו הקפאה להפשרה שוברת את הקרום ומשחרר SRB הכמוס.

4. SUV-SBL Assay Fusion לפקח שחרור ליפידים רק

1. כינונה של bilayer הנתמך הקשור בתוך ערוצי זרימת microfluidic
   1. מניחים את גוש PDMS (שלב 1.11) תחת ואקום גבוה לפני 20 דקות לפחות כדי הניסוי להסיר גזים מומסים. זו מקטינה באופן משמעותי את הסיכון של בועות אוויר בתוך ערוצי microfluidic במהלך ניסוי ההיתוך.
   2. הפעל את ההתקנה מיקרוסקופ ומחמם במה בעל מדגם (איורים 3 ו -4) לטמפרטורה הרצויה.
   3. סנן את חיץ הכינון מחדש המשמש לדילול שלפוחית ​​דרך פילטר עם גודל נקבובי 0.45 מיקרומטר או קטנים.
   4. לדלל ~ 30 μl של-PE NBD שכותרתו T-ורכבי שטח או ללא חלבון (PF-ורכבי שטח) ליפוזומים שליטה (מלאהפתרון 0.5-1 שומני מ"מ) עם ~ 60 μl של חיץ. הריכוז הסופי אינו קריטי כאן.
   5. דגה זו תערובת באמצעות מזרק 3 מ"ל. לחץ החוצה רוב באוויר מעל המדגם תוך החזקת המזרק במאונך. חותם את הקצה (מחט חינם) באמצעות סרט פרפין וליצור ואקום ידי משייך את הבוכנה. הקש על חבית מזרק כדי להאיץ degassing של הפתרון. חזור על תהליך זה כמה פעמים עד אין יותר בועות להתרחש כאשר ואקום מוחל.
   6. השתמש מחט מזרק בקוטר מעט גדול יותר הצינורות מחוברים אל בלוק PDMS אגרוף חור הכובע של צינור microcentrifuge. ודא כי פיסת פלסטיק האגרוף הוא לא בתוך הצינור כיוון שהוא עלול לסתום את הצינורות המחוברים כניסת ערוץ microfluidic מאוחר יותר.
   7. מלא את פתרון SUV degassed לתוך צינור microcentrifuge שיש לך חור במכסה ומניח אותו לתוך מחזיק על במת מיקרוסקופ כדי לאזן את טמפרטורת הסט.
   8. Plמסיים בהצטיינות coverslip ניקה בעבר (סעיף 2) ב שואב פלזמה ולהפעיל פלזמת אוויר למשך כ -5 דקות. שים את coverslip פלזמת מטופלים (צד מטופלים פונה כלפי מעלה) על גבי כמה רקמות נטולות מוך משמשים כרית.
   9. מורידים את נייר הכסף אלומיניום מהגוש PDMS degassed ומניחים הבלוק על גבי coverslip. בעת שימוש חוזר הבלוק PDMS לשים על ולנתק פיסת נייר דבק לצד ערוץ לנקות אותו. לחץ כלפי מטה על PDMS לחסום על coverslip באמצעות פינצטה כדי שתיצמד, אבל לא ללחוץ חזק מדי כמו הזכוכית עלולה להישבר.
   10. מניח את תא הזרימה התאסף לבמת מיקרוסקופ ולחבר את הצינורות אל מאגר SUV ואת משאבת המזרק, בהתאמה. קלטתי את coverslip אל הבמה (איור 3 ב).
   11. התחל aspirating ורכבי שטח ב 3 μl / min עד הפתרון ממלא את ערוצי לחלוטין (~ 2.25 מ"מ / sec עבור חתך ערוץ 75 מיקרומטר x 300 מיקרומטר). כאשר פתרונות לכל הערוצים מתחילים לנוע עד הצינורות דואר בצד היציאה, הקטן את זרימת 0.5 μl / min דגירה במשך 30-45 דקות.
       שימו לב: בפעם בין פלזמה בטיפול שקופיות הזכוכית וזורמת רכבי השטח לתוך התעלה לא תעלה על 10-20 דקות כמו ההשפעה של הטיפול בפלזמה הוא חולף.
   12. בדקו את ערוצי דליפה כלשהי. השתמש אובייקטיבי אוויר 10-20X להתבונן הקרינה NBD-PE מן טריקו או PF-ורכבי שטח NBD-PE המכיל. Excite NBD fluorophores באמצעות לייזר 488 ננומטר. הדלפות קשות לזהות באמצעות תאורה בשדה בהירה.
   13. לשים צינור עם חיץ כינון מחדש degassed לתוך המחזיק ולתת לאזן את טמפרטורת שינויים מהר ככל בטמפרטורה עלול לגרום למומים של SBL. עצור את הזרימה ולחכות ~ 1 דקות כדי לוודא את זרימת פסיק לחלוטין ואין בועות אוויר תהיה aspirated לתוך הצינור לפני מעבר צינורות הכניסה למאגר degassed.
   14. יש לשטוף את כל הערוצים עם חיץ degassed לשטוף רכבי שטח מאוגדים.
   15. לעבור higheמטרת r הגדלת TIRF (60X, שמן, NA 1.45-1.49) ולוודא כי bilayer נראה הומוגני והוא ללא פגמים בקנה מידה גדולה ברורים כגון כתמים כהים או tubules שומנים המתמשך מן SBL.
2. בדקו את הנזילות של bilayer
   1. אם יחידת FRAP ייעודית אינה זמינה, או אם רצף FRAP לא ניתן לתכנת, אז נזילות הממברנה מבחן איכותיות כדלקמן.
      1. סגור את הסרעפת שדה לגודל קטן (~ 40 מיקרומטר קוטר) ולהתאים את עוצמת האור עירור 488 ננומטר באמצעות התוכנה (20-80 μW, או 15-60 NW / מיקרומטר ²⁾ כדי להלבין את הקרינה-PE NBD ב החשוף אזור משמעותי, אבל לא לגמרי. במשך bilayer נוזל, על מצב יציב, את עוצמת הקרינה באמצע באזור החשוף צריכה להיות נמוכה יותר מאשר בקצוות, כמו מולקולות NBD-PE ללא פגע להיכנס לשטח החשוף מפוזרות מרחק מסוים לפני הלבנה. לעומת זאת, אם פני השטח-דבק Sנובס נכשל להתפוצץ, או מכל סיבה אחרת את bilayer הנתמך אינו נוזל, כל fluorophores באזור החשוף צריך להלבין.
         הערה: ערך עוצמת ליזר בצעדים זה ובהמשך מקבל כנקודת התחלה מחוספסת צריך להיות מותאם במיוחד קבוצה של תנאים נתונים.
      2. עצור את התאורה ולהתחיל את זה שוב כמה דקות מאוחר יותר כדי לאמת את התוצאות של מדידות מצב היציבות
   2. לתכנת רצף FRAP עבור מדידה כמותית יותר, אם אפשר. ראה קבצים משלימים והאגדה המקבילה לפרטים.
      הערה: לפעמים ורכבי שטח תדבק על coverslip זכוכית, אך אינם מצליחים לפרוץ ויוצרים bilayer נוזל. אם זה קורה, יש לשטוף את ערוצי עם חיץ degassed הכינון מחדש המכיל 10 מ"מ Mg ²⁺ לעזור היווצרות bilayer תמכו. השתמש קרינה לבנה להעריך נזילות bilayer כמו 4.2. פעם bilayer נוזל נוצר, לשטוף עם Mg ^{2 +} ללא recoחיץ תשס"ו.
3. היכרות נ-ורכבי שטח לתוך ערוצי הזרימה microfluidic
   1. דגת כינון חיץ ולהשתמש בו כדי לדלל את פתרון המניות נ-SUV בפקטור של כ -10 ³ ל 10 ⁵ תלויים בריכוז המניות נ-SUV. כוון דילול שתוצאתו על 10-100 אירועי היתוך בתוך 60 שניות ב שדה הראייה.
      הערה: יותר מדי בשילובים להגדיל את קרינת הרקע (כי כל PE-LR פיקדונות אירוע או עושים תוויות שומנים לתוך SBL) ולעשות זיהוי וניתוח של אירועי היתוך קשה. לעומת זאת, שיעור היתוך כי הוא תוצאות נמוכות מדי בסטטיסטיקה עניה או דורש רכישה של סרטים רבים יותר. ריכוז v-SUV של השומנים 0.1 מ"מ, להתחיל על ידי דילול 5 μl המניות SUV חיץ 995 μl הכינון מחדש ואז לדלל 5-50 μl של זה במאגר הכינון מחדש 950-995 μl.
   2. בואו טמפרטורה לאזן לפני הפסקת הזרימה inserטינג את צינור היניקה לתוך תמיסת נ-SUV המדולל.
   3. התאם את הזווית TIRF וקיטוב כדלקמן.
      1. לאחר הגדרת הקיטוב הרצוי על ידי החלפה של קרן עירור, לכוונן את הטיית המראה שפיקד על ומיקום הקרן באמצעות מנוע צעד באמצעות התוכנה. לאט לאט להזיז את המיקום של קרן לייזר ממרכז המטרה במישור המוקד האחורי לצד אחד מחוץ למרכז. שים לב בין האור ובין האובייקטיבי על הצד הקדמי לצאת עם זווית הגדלה ביחס לצייר מטרה כעמדה מועברת נוספת מחוץ למרכז.
      2. הערת מיקום המנוע כאשר קורה היציאה נעלם ראשון לתוך המטרה, כלומר, כאשר TIR המושגת ראשונה.
      3. לאט להמשיך לנוע עמדת קרן נוספת מחוץ למרכז תוך ניטור הקרינה מפני השטח. הערת מיקום המנוע כאשר קרינת המשטח נעלמת כאשר הקורה עבר רחוק מדי מחוץ למרכז.
      4. בחר positio קרן n בין שני במגבלות שקבע לעיל. עבור יחס אות לרעש הטוב ביותר והשבחת אות יותר על היתוך, לבחור עומק חדירה רדוד (מיקום קורה קרוב יותר לקצה של אובייקטיבי) כי עדיין מספק תאורה אחידה של viewfield.
         הערה: עדיף לשמור על אותו בעמדה קרן טיר (עומק החדירה אותו) עבור כל הניסויים לאחר הגדרות מותאמות. ודא סיבוב הקיטוב אינו לגרום לשינויים במצב קורה.
   4. הזרימה ורכב שטח נ לתוך התעלה בקצב זרימה של 2 μl / min, המתאימה למהירות זרימה ליניארי ממוצעת של ~ 1.5 מ"מ / sec עבור חתך של 75 מיקרומטר x 300 מיקרומטר. החלף ל הגדרות עירור / פליטה לפקח השומנים ערבוב (LR או שמא רק).
4. היתוך התבוננות בין רכבי שטח-נ יחיד ואת SBL

.jpg "/>
איור 3. התקנת pTIRF ניסיון. (א) ייצוג סכמטי של נ-SUV וחולצת SBL על מצע זכוכית. תמונות TIRFM False-צבע של אירוע פיוז'ן יחיד SUV-SBL מראות עגינת שומני בדם (1) ושחרור לצבוע שומנים לתוך SBL (2) ואחריו הלבנת ירידה של עוצמת הקרינה (3). עוצמת הקרינה הכוללת (סכום הערכים פיקסל 5.3 מיקרומטר x 5.3 מיקרומטר מסגרת) האות מוצגת. (ב) coverslip מלוכדת לבלוק PDMS הוא מודבק לבמה המחוממת. צינור היניקה עבור ערוצי microfluidic לצייר דוגמאות מהצינור במחזיק המתכת מדגם (מימין) aspirated ידי משאבת מזרק (משמאל). מתחת למשאבה היא יחידת הפליטה הכפולה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

oad / 54,349 / 54349fig4.jpg "/>
איור 4. סכמטי של הגדרת הניסוי. הגל החולף נוצר על הממשק-חיץ זכוכית בערוץ microfluidic. SBL נוצר על הזכוכית נ-SUV הוא aspirated מבעל מתכת המדגם (מימין למעלה) דרך הערוץ לתוך המזרק (למעלה משמאל). M, במראה; DM, מראה dichroic; L, עדשה; F, מסנן; P, מקטב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. ברציפות לרגש לפקח הקרינה נ-SUV באמצעות ננומטר 561 (עבור LR-PE) או 638 ננומטר (עבור DID) לייזר תלוי fluorophore המאוגדת-ורכבי שטח נ. כמו-ורכבי שטח נ להגיע ערוץ הזרימה ואת המזח על פיוז עם SBL, אות קרינת רקע מתחילה לצבור.
2. התאם את עוצמת הלייזר עירור באמצעות התוכנה כדי להלבין ברקע ברציפותקרינה כך באירועי עגינה ואיחוי חדשים מצב יציבים ניתן לצפות בקלות.
   הערה: אם הלבנה היא איטית מדי, קרינת רקע תהיה גבוהה מדי. אם הלבנה היא מהירה מדי, אותות שמקורו ברכבי שטח עגן ומן fluorophores מתפזרת SBL יימוגו במהירות, הקטנת החלון שבמהלכה ההיתוך של רכבי שטח עגנה ניתן לאתר או fluorophore ניתן לעקוב. לקבלת LR-PE נרגש ב -561 ננומטר, 2.5-7.5 כוח mW ומאיר עיגול בקוטר 190 מיקרומטר (100-250 NW / מיקרומטר ²⁾ הוא ערך סביר להתחיל. עבור 638 ננומטר עירור של האם, 0.8-1.6 כוח mW מעל עיגול בקוטר 190 מיקרומטר (30-60 NW / מיקרומטר ²⁾ יכול לשמש לבדיקות ראשוניות.
3. רוכש בכמה סרטים בנקודות שונות בתוך ערוץ נתון. בדוק קרינת NBD-PE כדי לוודא כי SBL אין פגמים בעמדות אלה. רוכשת סרטי מסגרת מלאה בשיעור המרבי (~ 50 מסגרות / השני) או אזור קצוץ של ריבית בשיעור פריים גבוה יותר (עד~ 100 הרץ) למשך 60 שניות.
4. לעבור עוד ערוץ microfluidic וחזור הקלטות תנאים אחרים. כלול בקרות שליליות כגון SBL או רכבי שטח חלבון ללא, להוסיף את הדומיין cytoplasmic המסיס נ-Snare VAMP2 (CDV) כמעכב או לטפל-SUV נ עם עצבי טטנוס (30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס) באחד או יותר הערוצים על אותו coverslip.

5. לנקות ומיחזור PDMS
   1. על מנת לעשות שימוש חוזר הבלוק PDMS, יש לשטוף את ערוצי microfluidic עם ~ 200 μl של אתנול 70% בקצב זרימה של 5 μl / דקה. לבסוף, לשאוב אוויר דרך הצינורות והתעלות.
   2. לנתק את PDMS לחסום בעדינות מן coverslip ידי לחיצות קלות. מניח אותו על פיסה נקיה של נייר אלומיניום. אחסן ייבוש ואקום. זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים.
   3. לניקוי יסודי יותר לשטוף את הערוצים עם פתרון הידרוקסיד חומר ניקוי או נתרן לפני אתנול 70%. לחילופין, להסיר את כל צינורות הלוך ושוב מ 'PDMS ו sonicate הבלוק למשך 30 דקות ב isopropanol, לפני ייבוש החדרת צינורות חדשים.

5. SUV-SBL Assay Fusion לפקח שחרור ליפידים ותוכן במקביל

1. עבור ניטור צבע כפול של השומנים סימולטני ותכנים מסיסים לשחרר, חזרו על אותן הפעולות כאמור בסעיף 4, למעט ליפוזומים שימוש שכותרתו עם שני השומנים (DID) וכן תוכן מסיסים (SRB) התווית, כפי שהוסבר בסעיף 3. SRB הוא כמוס ב 10 מ"מימ והוא בתחילה פערים רווים עצמי.
2. שימוש בתצורה הראו באופן סכמטי באיור 4, לרגש SRB ועשה הקרינה בו זמנית באמצעות 561 ננומטר 638 nm לייזרים, בהתאמה. מראה dichroic (640 ננומטר) ומחלק את הפליטה לשתי קורות שמופעלות באמצעות (ננומטר 595/50) קצר ארוך (700/75 ננומטר) מסנן אורכי גל כדי לזהות את SRB ועשה פליטות, בהתאמה. שתי אלומות הפליטה מוקרנות Side-by-side על שבב EM-CCD.

1. ניתוח של נתוני FRAP
   1. השתמש בתוכנית MATLAB מסופק במידע משלים להעריך את מקדם הדיפוזיה השומנים, D. התכנית קוראה את רשימת הקבצים שתו-TIFF ^49, מזהה באזור המולבן, מגרשי ערכי פיקסל מתכוון באזור המולבן כפונקציה של זמן, ומתאימה את עקומת התאוששות וכתוצאה מכך למודל ידי Soumpasis ⁵⁰ כדי לחלץ את זמן ההחלמה, שם, w הוא רדיוס המעגל המולבן.
      הערה: תוכנית MATLAB סופק קודם לכן ²⁵ לניתוח של סרטים FRAP באמצעות קבצי ND2 ניקון. התכנית הנוכחית קוראה שת-TIFF קבצי ^49, כי רוב פורמטי קבצים ניתן להמיר בקלות שת-TIFF. ניתוח כמותי של נתוני FRAP הכי והמדויק ביותר כאשר ההלבנה הוא מיידית, את bleacבאזור הד הוא מעגל, לבן במהלך-אאוט לקרוא זניח. אף על פי שקריטריונים אלה אינם מרוצים ורק מדידות FRAP פשוט המתואר כאן, אומדן סביר של מקדם הדיפוזיה ניתן להשיג. לקבלת אומדן מדויק יותר, להשתמש במעקב של צבעי שומנים יחידים (סעיף 6.3).
2. ניתוח של שיעור עגינה, שיעור פיוז'ן עגינה ל-היתוך פעמים עיכוב
   1. השתמש ImageJ לפתוח סרט לנתח ולהתאים הבהירות והניגודיות לזהות עגינה שלפוחית ​​בבירור ואירועים פיוזינג. הפעל את תוסף ²⁶ SpeckleTrackerJ. ראה סמית et al. ²⁶ ותיעוד מקוון עבור SpeckleTrackerJ לקבלת הוראות לשימוש.
   2. לזהות את כל רכבי השטח חדש עגן SpeckleTrackerJ. כדי להבחין רכבי שטח כי לעגון בחוזקה מאלו ומוחזרות SBL, להטיל משך עגינת מינימום של כמה מסגרות. שמור את המסלולים, וחזור עבור כל הסרטים.
      הערה: עבור docמלך שיעור, כל מה שחשוב הוא לזהות כאשר עגנה רכב שטח, אז רק את המסגרת הראשונה שבה ורכבי שטח עגנה הצרכים שיירשמו במסלולים אלה. שאר המסלולים לא יילקח בחשבון בניתוח. עם זאת, אוטומטי ומעקב אחר כל SUV עד לבנה או נתיכים עוזר רכבי שטח סימן שכבר במעקב.
   3. לזהות את כל שלפוחית ​​פיוזינג. עבור אלה, הפסים צריכים לכלול את כל המסגרות של המסגרת הראשונה רכב שטח עגן עד המסגרת הראשונה שבה ההיתוך ניכר ידי עלייה פתאומית הקרינה של הנקודה במעקב. משכי הזמן של מסלולים אלה משמשים כדי לחשב את עיכובי עגינה ל-פיוז'ן. שמור את כל הרצועות. חזור על הפעולה עבור כל הסרטים.
   4. לניתוח אצווה של נתוני עגינה או היתוך, ליצור רשימה של קבצים מסלולים מהסרטים הרלוונטיים ולהפעיל את תוכניות MATLAB מסופקות עם Karatekin ורוטמן ^25. פעל בהתאם להוראות המופיעות בה יחד עם התוכניות.
      הערה: תוכניות עלילה בהצטיינותאירועי עגינה ואיחוי ulative כפונקציה של זמן, בהתבסס על מידע המופק קבצי המסלול. שיעורי עגינה ואיחוי נאמדים מהמורדות חלקות אלה. לקבלת נתונים היתוך, העיכובים עגינה ל-היתוך מחושבים גם והפצתם זממו כמזימה הישרדות, דהיינו, ההסתברות כי היתוך לא קרה עדיין ע"י עיכוב שניתנו לאחר העגינה.
3. diffusivity ליפידים
   1. עבור כל אירוע היתוך, לעקוב שומני פלורסנט בודדים כאשר הם הופכים להבחין כאשר הם מתפזרים מספיק ממקום ההיתוך (איור 6). השתמש SpeckleTrackerJ למעקב, ולשמור את המסלולים לניתוח נוסף באמצעות MATLAB. בהתאם לגודל של שלפוחית ​​פיוזינג, בדרך כלל 3-30 fluorophores יחיד יכול להיות במעקב. בגלל שירים כבר רצויים לחישוב , מנסה לעקוב אחר מולקולות בודדות כל עודככל האפשר, באמצעות תיקון של מסלולים ידניים במידת צורך.
   2. לחשב את הממוצע בריבוע עקירה (MSD) עבור מסלולי סמן שומנים יחידים שנמשכים> 40-50 מסגרות (כ ~ 1.5 שניות). השתמש MSD לחשב את מקדם הדיפוזיה שומנים, . ראה סמית et al. ²⁶ סטראטון et al. ²⁷ לפרטים.
4. עוצמת צבע שומנים יחידה, מקדם הפחתה בעוצמת SUV-SBL, וגודל שלפוחית
   1. מדוד את סכום הערכים פיקסל של סמן שומנים באזור 3 x 3 פיקסל (0.8 מיקרומטר x 0.8 מיקרומטר) ברחבי הסמן ~ 15 מסגרות לפני ואחרי לבנת סמן אחד צעד. הפחת את עוצמת רקע בממוצע לכל המסגרות שלאחר אקונומיקה מעוצמת מראש אקונומיקה בממוצע לפני הלבנת להשיג את עוצמת סמן השומנים במעקב. חזור על המדידה עבור סמנים רבים ככל מעשית נתון סרט.
   2. מגרש חלוקת עוצמת תווית שומנים יחידים, , ו להתאים גאוס להעריך את הממוצע.
   3. חשב את ההשהיה בין כאשר ההיתוך התרחש כאשר מסלולו של סמן שומנים הסינגל באירוע שהסתיים הלבנה בשלב יחיד. השג את זמן ההלבנה עבור fluorophore בבית SBL, , על ידי התוויית ניצול הפונקציה של העיכובים והולמים ל מעריכים.
      הערה: מאחר זוגות שדה עירור המקוטבים יותר חלוש כדי fluorophores על רכב שטח, בפעם הלבנה של SUV הוא בדרך כלל הרבה יותר איטית ^27.
   4. לְהַעֲרִיך , הגורם לירידה בעוצמת עבור צבע שומנים כאשר יחסית SUV כאשר הוא נמצא SBL, בעקבות סטראטון ²⁷ (tp_upload / 54,349 / 54349eq8.jpg "/> העוצמה היא של צבע יחיד SUV).
      הערה: אם לבן היו זניחים, יהיה שווה את עוצמת עגנה (נקודה (1) באיור 3A, פנל מימין), מחולק מהעוצמת הכוללת הגיעה אחרי הכל fluorophores מופקדת לתוך SBL על היתוך (קו מקווקו שכותרתו באיור 3). עם זאת, בשל הלבנה מהירה SBL, בדרך כלל לא הוא הגיע אומדן מדויק של דורש הולם קינטיקה השחרור כדי ביטוי ²⁷ כי כולל udes הוא (ראה 6.4.3) ו . ביטויים נפרדים ניתנים סטרטון ואח ²⁷ למקרים של קינטיקה שחרור הנקבוביות-מוגבל דיפוזיה מוגבלת.; במקרה בכושר הטוב ביותר משתנה מאירוע לאירוע (ראה 6.5.1 עבור המקרה של קינטיקה המוגבלת הנקבובית).
   5. לחשב את שטח השלפוחית ​​לאירועים פרטיים מ ^-27 , איפה היא עוצמת SUV עגנה, הוא מתכוון עוצמת צבע שומנים יחיד SBL, הוא מקדם הפחתה בעוצמת עבור צבע שומנים כאשר הוא נמצא ביחס SUV כאשר הוא נמצא SBL, ו1 ation "src =" / files / ftp_upload / 54,349 / 54349eq12.jpg "/> היא הצפיפות האזורית הידועה של צבעי שומנים.
5. מאפיינים נקבוביים Fusion
   1. בהנחת שחרורו היא נקבובית מוגבל, להתאים את קינטיקה שחרור תווית שומנים ל ^-27 , איפה היא עוצמת SUV עגנה רק לפני היתוך ואת הפרמטרים האחרים כהגדרתו קודם לכן. השתמש ערך שהושג 6.4.3 כפרמטר קבוע, ולחלץ את הערכות בכושר הטובות ביותר עבור ו .
   2. להעריך את החלק היחסי של זמן הנקבובי פתוח, P _0, פיגור בהנחה של שחרור שומנים נובע נקבובי מהבהב ^27:60; = , כאשר A _ves הוא אזור השלפוחית ​​(הסעיף 6.4.5), b הוא הגובה הנקבובי (נלקח בדרך כלל להיות ~ 15 ננומטר), r _p ≈ 3 ננומטר הוא הרדיוס הנקבובי היעיל כפי שניתן לראות על ידי תוויות שומנים לשדר וכולל חצי עובי bilayer (~ 2 ננומטר), הוא diffusivity השומנים (מחושב 6.3), ו הזמן הוא עבור השומנים להשתחרר מתוך הרכב לתוך SBL (מ 6.5.1).
   3. כדי לאשר כי P הנומינלי _0> 1 מצביע על נקבוביות פתוחות לחלוטין, P ₀ = 1, להתאים את הקורס בעוצמה זמן למשוואה 4 של סטרטון et al. ^27, קינטיקה ניבאו נקבובית פתוח באופן קבוע. בכושר זה אמור להיות טוב יותר מאשר fitting את הביטוי 6.5.1 עבור נקבובית פתוחה באופן קבוע.

איכות SBL

זה חיוני כדי לוודא את האיכות ובזרימה של SBL לפני ניסוי ההיתוך. הקרינה בצד התחתונה, כוס ערוץ microfluidic צריכה להיות אחידה, ללא כל פגם נראה לעין. אם בועת אוויר עוברת אף את הערוץ, זה בדרך כלל משאיר צלקות נראות לעין על SBL. אם יש צלקות כאלה בקנה מידה גדול / פגמים, אין להשתמש בערוץ זה. לפעמים רכבי השטח עלולים להיצמד אל המצע אך אינם מצליחים לפרוץ ויוצרים SBL רציפה. אם זה מקרה, את הקרינה עשויה עדיין להופיע אחידה מאוד, אבל לא תתאושש אחרי לבנת אזור קטן. היכרות עם 10 מ"מ Mg ²⁺ לעתים קרובות עוזר לפתור את הבעיה. סוכנים אחרים יכולים להיות הציגו לעזור לנפץ את רכבי השטח, כגון קטיונים divalent אחרים ^51, פתרון פולימר ^52, או ²⁵ הלם אוסמוטי.

her.within-page = "1"> גם כאשר הקרינה היא הומוגנית בעיקרה והיא משחזרת אחרי הלבנה, כמה רכבי שטח unfused עשוי להישאר ללא שינוי על פני השטח. כזה ליפוזום יופיע ככתם בהיר אם הוא גדול מספיק. אחרי לבנת אזור המכיל ליפוזומים כזה, מנקודות האור בעבר להפוך כהות ונשארו כך, כמו הקרינה משחזרת של SBL שמסביב, אך לא ליפוזומים ללא פגע. ליפוזומים שלמים כאלה אינם משפיעים מדידות היתוך, בתנאי הצפיפות שלהם היא נמוכה.

שינויי טמפרטורה לגרום לשינויים של אזור SBL משום שבאזור הממוצע תפוס על ידי שומנים תלויים בטמפרטורה. הגדלת הטמפרטורה או להקטין אותו על ידי C 5-10 מעלות או יותר יכולה לגרום באזור העודף הולך לתוך הצינורות הנמתחים מפני השטח, או כהים, SBL ללא כתמים המופיעים על פני השטח, בהתאמה ^53. לכן חשוב לשמור על הפרשי טמפרטורות עד למינימום.

יפ-together.within-page = "1"> מדידת FRAP טיפוסית מוצגת באיור 5 עבור SBL כי היה יחסית ללא פגם ו נוזל.

איור 5. FRAP לבחון נזילות SBL. רצף של תמונות מראות שטח מואר תחומת סרעפת השדה הסגורה (בקוטר 49 מיקרומטר) לפני (המסגרת הראשונה) ואחרי ההלבנה עם דופק אור חזק. האזור צלם בעת חשיפה באור הנמוכה לעקוב התאוששות הקרינה על ידי דיפוזיה של NBD שכותרתו שומנים. הגרף מראה את הקרינה המנורמלת כפונקציה של זמן עבור כמה ערוצי coverslips השונה המעידים על הרמה הגבוהה של שחזור של השיטה. הרכב השומנים של t-SBL היה POPC: SAPE: DOPS: כולסטרול: PI המוח (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5% השומה ) ו LP = 20,000. אזור האקונומיקה היה 984.203 μמ ^'3. זמן ההחלמה ואת מקדם דיפוזיה מחושב בהתקף (ראה 6.1) היו τ = 67.3 שניות ו D = 1.99 מיקרומטר ² / sec, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איתור מונוכרומיות של אירועי עגינה ופיוז'ן באמצעות תווית ליפידים

ספירה ידנית של אירועי עגינה ואיחוי היא משימה מייגעת כמו 100-400 אירועים לכל מצב יש צורך סטטיסטיקה טובה. מאז רכבי שטח יכול לעבור על SBL לפני שהוא נדבק, תוכנת מעקב הוא זקוק. יש SpeckleTrackerJ ²⁶ תוסף ImageJ תכונות שפותחו במיוחד עבור מעקב ורכבי שטח לניתוח של אירועים עגינה ופיוז'ן. לעתים קרובות רק חלק קטן של שלפוחית ​​עגנה בסופו של דבר פיוזינג;כדי לחשב את שיעור עגינה ועוד ורכבי שטח צריך להיות במעקב מאלו הפתיל או רק חלק של הסרט צריך להיות מנותח עד מספר מספיק של אירועים מזוהים לאומדן מהימן. אם המוקד העיקרי הוא שיעור ההיתוך ו / או עיכובי עגינה ל-היתוך, רק רכבי שטח פיוזינג צריך להיות מזוהים ולעקוב אחריו.

לאחר הבטיח איכות SBL, רכבי שטח מוכנסי אפיקי הקרינה שלהם היא נרגשת ברציפות תחת TIR באמצעות אור של המקוטב. עבור הניסויים הראשוניים, זווית שכיחות של הקורה עירור טיר ייתכן שיהיה צורך מותאם לכוון את עומק החדירה של גל וכתוצאה חלוף. אירוע עגינה ואיחוי יחיד SUV נציג מוצג איור 6 א. השלפוחית ​​עגנה במהלך מסגרת מסומן D ואיחוי נכתב במסגרת פ כ -1.3 שניות מאוחר יותר (מסגרת S) יחיד שומנים הפכו להבחין כפי שהם מתפזרים הרחק ההיתוך לשבתדואר. עוצמת הקרינה הכוללת (סכום הערכים פיקסל) בכל תיבה זממה כפונקציה של זמן באיור 6B, עם המסגרות שבו עגינה ואיחוי התרחשו מצוינת. מספר המצטבר של אירועי היתוך כפונקציה של הזמן היא להתוות איור 6C, עבור חמישה סרטים שונים באמצעות t-Snare מחדש SBLs (t-SBL, LP = 20,000, כ -70 t-מלכודות למ"ר. מיקרון). שיעור ההיתוך מכל סרט חושב מתוך התאמה ליניארית למדרון. שיעור היתוך ממוצע זה ± SEM מוצג גרף עמודות בלוח ד העיכוב עגינה ל-היתוך עבור בדוגמה המוצגת באיור 6 א ', ב', היה 0.07 שניות. חלוקת העיכובים מחושבים באופן דומה עבור סכום כולל של 158 אירועים מוצגות באיור 6D כמזימת ניצול, דהיינו, ההסתברות כי שלפוחית ​​עגנה לא התמזגה עדיין ע"י עיכוב נתון. אודות 1/2 של שלפוחית ​​אלה התמזגו בתוך 100 אלפיות השניה. עם העלייה ברמות הכולסטרול, את distribution של עיכובים עגינה ל-היתוך מקצר, למרות דיפוזיה השומנים מאט ^27.

חשוב להפעיל ניסויים שליטים במקביל. באותו coverslip שממנו הנתונים באיור 6B, D נרכשו, תנאי שליטה נבדק בערוצים סמוכים. באפיק אחד, SBL לא כלל כל-מלכודות t. מתוך 5 סרטים שנמשכו 60 שניות כל אחד, רק 7 אירועי היתוך נרשמו לעומת 158 כאשר t-המלכודות נכללו (איור 6 ג). באפיק אחד, תחום cytoplasmic המסיס נ-Snare VAMP2 (CDV) נכלל. CDV שקושר את t-מלכודות על SBL, מניעת המחייב של VAMP2 באורך מלא אשר על רכבי השטח. בחמישה -60 סרטים שניים, נקבע אירועי היתוך אותרו בנוכחות CDV (איור 6 ג).

איור 6. אירועים עגינה ואיחוי SUV-SBL. (א) רצף של תמונות של אירוע היתוך נ-SUV עם t-SBL צילמו על ידי מיקרוסקופ pTIRF בעקבות התפשטות LR-PE. תמונות נלקחות כל 18 מילים-שניות, בכל מסגרת שנייה רק ​​מוצגת. D ו- F לסמן את תחילתה של עגינה ואיחוי, בהתאמה. תוויות שומנים הפרט להפוך למידע מזהה כפי שהם לפזר ממקום היתוך ואחד אחר (S). ממדי מסגרת: 16.7 מיקרומטר x 16.7 מיקרומטר. (ב) עוצמת קרינה כפונקציה של זמן לאירוע ההיתוך שמוצג (א). (ג) מספר מצטבר של אירועי היתוך כפונקציה של זמן עבור נ-רכבי שטח שכותרתו עם עשה מ קבוצה נוספת של ניסויים. (ד) שיעור ההיתוך המנורמל (ממוצע ± SEM, SX מיקרומטר ² x PM SUV) ^-1, בהנחה של 2 x 10 ⁴ שומנים לכל SUV ו (ה) הסתברות ההישרדות במשך זמן נתון לאחר העגינה של השלפוחית. הרכב לכל SBLs היו POPC: SAPE: DOPS: כולסטרול: PI המוח (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5% השומה) ו LP = 20,000. נ-רכבי השטח הורכבו POPC: SAPE: DOPS: כולסטרול:-DOPE PEG2000: LR-PE (57.4: 15: 12: 10: 4.6: 1 השומה%) ו LP = 200 עבור A ו- B. לקבלת CE, נ רכב -SUV היה דומה, חוץ מזה שמש במקום LR-PE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ליפידים diffusivity, גודל שלפוחיות, ופיוז'ן נקבובית מאפיינים

הרגישות מולקולה בודדת של assay מאפשר מיצוי של מספר פרמטרים בנוסף לשיעורי עגינה ואיחוי ואת הפצות עגינה ל-היתוך דיחוי. שומנים יחידים, שכותרתו fluorescently להיות להבחין כפי שהם לפזר ממקום ההיתוך (איור 6 א). מעקב these מספק diffusivity השומנים ישירות ^26, , וכן מדידה דיגיטלית של שיעור ההלבנה עבור fluorophores בבית SBL ^27. כפי שהוזכר במבוא, פליטת הקרינה של התוויות נבדלת SUV לעומת בבית SBL, בשל שלושה גורמים כי הם בכלל קשים להפריד: (i) dequenching תוויות על היתוך, עקב הדילול שלהם כאשר הם מועברים אל SBL , (ii) בעוצמה עירור גבוה יותר SBL בשל הדעיכה של שדה חלוף שנוצר על ידי טיר, וכן (iii) את הכיוון של הדיפולים המעבר fluorophore ביחס הקיטוב של קרן עירור. סדר הגודל של גורם (ii) תלוי הגדלים היחסיים של אורך ריקבון שדה חלוף וגודל שלפוחית ​​שונה עבור כל אירוע היתוך בשל dispersity בגדלים SUV. פקטור (iii) תלוי fluorophore ואת הקיטוב בשימוש. במקום לנסות di sentangle ההשפעות הללו, אפשר למדוד את גודל שינוי הקרינה ישירות על ידי השוואת ערכי הפיקסלים הכוללים באזור שמסביב רכב שטח לפני היתוך ואחרי כל fluorophores הופקד לתוך SBL הבא היתוך (איור 3 א, (1) לעומת ( 2)). שלא כמו עבודות קודמות ^29,44, באזור יש לבחור גדול מספיק כדי שאף fluorophores יעזוב אותו באמצעות דיפוזיה עבור הפעמים נחשבו לאחר היתוך. בחירת אזור פיקסל 30 x 30 (8 מיקרומטר x 8 מיקרומטר) לניתוח עד 1.6 שניות לאחר ההיתוך היא בדרך כלל ²⁷ נאות. הלבנת התעלמות לרגע, היחס בין לפני ואחרי היתוך מספק את מקדם הפחתה בעוצמת הקרינה, . גודל השלפוחית ​​ניתן לאמוד בהתחשב בעוצמת הקרינה של תווית יחידה של SBL (Iles / ftp_upload / 54,349 / 54349eq6.jpg "/>), הגורם שבאמצעותו עוצמתו יהיה מופחת אם זה היה רכב שטח ( ), תוויות הצפיפות הידועה של בתוך הפורד אקספלורר, ואת השטח הכבוש על ידי שומנים. בפועל, הלבנה היא בדרך כלל מספיק מהר שעד כל הסמנים מופקדים לתוך SBL, כמה כבר מולבן. מסיבה זו, עבור הערכה מדויקת, הגורם לירידה בעוצמת קרינה, , ואת הזמן לשחרר שומנים בדם, , מחולצים הטובים ביותר מתוך לנכון את מהלך הזמן של ערכי הפיקסלים הכולל שלוקחים הלבנת חשבון ^27. השיעור הלבן של תוויות SBL מוערך באופן עצמאי ממעקב לצבוע שומנים יחידים, או על ידי התאמת מעריכים לפרופיל העוצם הכולל, , בזמנים ארוכים (למשל, משטר (3) באיור 3). לדעת את הגודל של שלפוחית ​​פיוזינג ו diffusivity שומנים מאפשר השוואה של הזמן לשחרר שומנים בפועל, , אל הזמן דיפוזיה של שומנים סביב השלפוחית , כאשר A _ves הוא אזור השלפוחית הוא diffusivity השומנים. אם שני סולמות הזמן ניתנים להשוואה, הנקבובי מציג התנגדות מעט שחרור שומנים, והשחרור הוא מוגבל דיפוזיה. לעומת זאת, אם אז, הנקבובי משמעותי מפגרי שטף שומנים. מדד כמותי של פיגור הוא "פתיחות נקבובית", P _0, השווה ליחס פעמים o גורםאחדות f כדי קשורה נקבובי גיאומטריה ^27. לקבלת נקבובית שתי מדינות לשני עמים, פתוח / סגור, P ₀ הוא שבריר של זמן במצב פתוח. לקבלת נקבובית מהבהב שגודלו משתנה ללא הרף, P ₀ מייצג את יחסי רדיוס-בממוצע זמן לרדיוס פתוח לחלוטין.

האות לרעש היחס צריך להיות טוב מספיק עבור מעקב fluorophores שומנים יחיד. זו מושגת בקלות רבה יותר בניסויים יחיד צבע, באמצעות סמן בהיר כגון LR-PE.

זיהוי סימולטני של ליפידים ולשחרר מטענים מסיסים

אירוע נציג מוצג באיור 7. בריכוזים הגבוהים המשמשים אנקפסולציה, קרינת SRB היא בתחילה-רווה עצמית. לכן,-ורכבי שטח נ עגנו ביותר ניתנים לזיהוי רק על ידי האות עשה שלהם ^27. עלייה חדהב האם קרינה מסמנת ערבוב שומנים, כמו בניסויי שומני תווית אחת-צבע. תחילתה של שחרור שומנים בד בבד עם תחילת גידול קרינת SRB. גידול זה היה ככל הנראה בשל dequenching SRB כמו מולקולות SRB נמלטו SUV ואת SRB נותר דוללו אל מתחת ל ריכוזי מרווה עצמיות. מעניין לציין, כי קרינת SRB הגיעה לרמה יציבה. אם נקבובי ההיתוך נשאר פתוח, ניתן היה לצפות את אות SRB להגדיל עד למקסימום עקב dequenching, ואחריו ירידה לרקע כמו SRB עזב את SUV, או אם SUV התמוטט לתוך SBL. הרמה היציבה ככל הנראה מצביעה על הנקבוביות resealed לאחר שחרור כל התוויות שומני שבריר של המטען המסיס.

במקרים מסוימים, את האות לשחרור שומנים לא לוותה כל תוכן לזיהוי לשחרר אותות. זה יכול להיות גם בגלל הנקבוביות היו קטנות מכדי לאפשר מעבר של SRB, או כמהכיצד SUV כבר אבד המטען המסיס שלה. כדי להבחין בין שתי אפשרויות אלה, הלבנה של רכבי שטח עגנה ניתן לנתח. לבנה של תווית השומנים עשתה מפחית אותות הקרינה שלה בתוך שניות, בעוד ההלבנה של תוצאות SRB העצמיות רווה בתחילה לעלייה של אות SRB כשבר של SRB הם מרת תמונה למוצרים אחרים-מרווה עצמית היא משוחררת. בעוד שרוב רכבי שטח עגנו (48 מתוך 58 נתחו אירועים) הציג את העלייה הצפויה קרינת SRB לאורך תקופות ממושכות של תאורה, חלק קטן (10/58) לא הראה שום אותות SRB בכלל. לפיכך, חלק קטן של רכבי השטח עלול לאבד התוכן המסיס שלהם בתקופה שבין ההכנה שלהם ושימוש בניסויים.

בלמעלה מ -80% של אירועים (74 מתוך 91) עבורו הוא SRB אותות האם יכולים להיות אחריו, קרינת SRB גדלה ונשארת רמה יציבה ^27. ב ~ 20% של tבמקרים hese הקרינה SRB הנותרים שוחרר פתאום אחרי כמה שניות מאוחר יותר. זה עשוי גם להיות עקב פתיחה של הנקבוביות מאפשרת שחרור מהיר, מלא בתוך 1-2 מסגרות (18-36 msec) או התפוצצות של SUV בשל ¹⁶ התמונות הנזק המצטבר. לא משנה מה מקורו, שני זה, שחרור מהיר של SRB שולל את האפשרות כי אות SRB הנותרת לאחר הפרסום הראשון עשויה להיות בשל SRB נותר לכוד בחלל שבין SBL ואת מצע הזכוכית לאחר שחרור מלא. מנגנון כזה הוצע במחקר קודם שבו SBL נתמך ישירות על זכוכית, עם שטח קטן בין שתיים ^16. לעומת זאת, שומנים PEGylated המשמשים assay זה אמור לספק 4-5 ננומטר של רווח בין SBL והזכוכית ^25, המאפשר SRB לפזר מהמקום היתוך.

איור 7. simultan eous השומנים ולשחרר תוכן. אותות הקרינה מן השומנים (כחול) ותוכן (אדום) סמן אירוע היתוך SUV-SBL (לפירוט ראה טקסט). תמונות מתוך כל ערוץ מוצגות בתחתית (4.0 מיקרומטר רחב). קריקטורות (באמצע) להמחיש את השלבים השונים. (1) הרציפים SUV, האם הקרינה היא נמוכה. (2) Fusion מאפשר העברה עשה לתוך SBL ועשה עליות קרינה. אות SRB גם מעלה כמו מרווה עצמית הוא משוחרר על ידי בריחה של SRB דרך הנקבוביות. (3) אות SRB נשארת מולקולות בעוד עשו יציבה המפוזרת בתוך SBL מה שמעידים על resealing אפשרית של הנקבוביות. (4) אותות SRB להקטין במהירות רבה, בשל היתוך או התפוצצות ליפוזום מלא מהירים. הרכב-ורכבי שטח נ היה POPC: SAPE: DOPS: PEG2000-DOPE: האם (67: 15: 12: 5:% שומה 1), LP 200, בעוד t-SBLs הורכבו POPC: SAPE: DOPS: PI המוח (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (64.5: 15: 12: 3: 5:% שומה 0.5) ו LP = 20,000. = "_ Blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FRAP_instructions.pdf -. הוראות להגדרת רצף FRAP אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

ReadMe_FRAP.txt -. קובץ טקסט המתאר את ההליך לנתח נתוני התאוששות FRAP באמצעות קוד MatLab המסופק אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

EK_FRAPbatch.m - קובץ MATLAB אצווה-לנתח התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. קובץ זה מכנה EK_getFRAPvals.m שגרה Matlab ו- EK_SoumpassisFit.m."_blank"> לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

EK_getFRAPvals.m -. קובץ MATLAB, ששגרת נקרא על ידי EK_FRAPbatch.m אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

EK_SoumpassisFit.m -. קובץ MATLAB, ששגרת נקרא על ידי EK_FRAPbatch.m אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_FRAP_list.txt -. דוגמא רשימה של שמות קבצים כדי להיות מנותח תצווה ידי תסריט MATLAB הראשי EK_FRAPbatch.m אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

ההקבצים הבאים ערימות TIF ואת קבצי טקסט המקביל במשך חמש דוגמאות לסדרות FRAP כי ניתן לנתח על ידי הפעלת EK_FRAPbatch.m ובחירת קובץ JN150923c1_FRAP_list.txt כאשר תתבקש לבחור רשימת הקבצים.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0.ome.tif -. ערימת התמונה FRAP אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0_metadata.txt -. מקביל קובץ טקסט עם metadata אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0.ome.tif -. ערימת התמונה FRAP Plלהקל לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0_metadata.txt -. מקביל קובץ טקסט עם metadata אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0.ome.tif -. ערימת התמונה FRAP אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0_metadata.txt -. מקביל קובץ טקסט עם metadata אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP מחסנית תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0_metadata.txt -. מקביל קובץ טקסט עם metadata אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0.ome.tif -. ערימת התמונה FRAP אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0_metadata.txt -. מקביל קובץ טקסט עם metadata אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

יישום מוצלח של assay היתוך SUV-SBL המתואר כאן תלוי באופן קריטי על צעדים מרכזיים, כגון כינון מחדש תפקודי של חלבונים לתוך ליפוזומים, קבלת SBLs באיכות טובה, ובחירת פרמטרי הדמית הזכות לזהות מולקולות בודדות. למרות שזה עשוי לקחת קצת זמן ומאמץ כדי להצליח, לאחר assay מיושמת בהצלחה, הוא מספק שפע של מידע על תהליך ההיתוך לא זמין מכל assay היתוך במבחנה אחר הנדון מבוא. השיעורים שבו רכבי שטח לעגון על פיוז עם SBL, חלוקת פעמי עגינה ל-היתוך, diffusivity שומנים, את הגודל של כל ליפוזום פיוזינג, והאם שחרור שומנים לאירוע היתוך נתון הוא יכול בקפיצות או בשליטה נקבובית שייקבע. אם השחרור איטי בהרבה מצפוי מ דיפוזיה, מודל מניח מהבהב נקבובי ביסוד הפיגור של תשואות שחרור שומנים, P _0, את החלק היחסי של זמן הנקבובי אניזה פתוח במהלך ההיתוך ^27.

עבודות קודמות חיטוט היתוך SUV-SUV יחיד ^18-20,28 או היתוך של ליפוזומים חלקיקים נגיפיים כדי SBLs ^{15-17,21,22,33,44} הסתמכה על סריג ו-מרווה עצמית בין מולקולות צבע. לעומת זאת, אנו נמנעים dequenching לצבוע בעיקר לחקור קינטיקה של העברת תווית שומנים לתוך SBL, משתי סיבות. ראשית, סריג יעיל הוא כתב שאינו ליניארי מאוד של שחרור שומנים. שינויים קטנים התוצאה ד מרחק בין צבע לשינויים משמעותיים במספר הסריג היעיל, אבל רק עבור מגוון מוגבל של ערכי ד / R _0, כאשר R ₀ הוא מרחק פורסטר. כלומר, זמן השהיה בין דילול לצבוע בפועל וגידול שנצפה אות dequenching עלול להתרחש, בשל הזמן הדרוש כדי לרדת ל ערך קרוב R _0. בדומה לכך, יש לשנות מעט את אות dequenching פעם צפיפות הצבע יורדת מספיק עם שחרורו שומנים כך ד / R ₀ 1.4, גם אם כמות משמעותית של צבע עדיין נשארה השלפוחית. תכונות אלו הופכות dequenching כלי טוב כדי להשיג עלייה חדה האות לזהות אירועים היתוך, אבל לסבך ניתוח הקינטית כמותי של שחרור השומנים באמצעות ברזולוציה גבוהה בזמן. לעומת זאת, שינויים בעוצמת בשל ארגון מחדש דיפול ואפקטי שדה חלוף כמו העברות fluorophore מתוך SUV לתוך SBL קשורים באופן ליניארי את החלק היחסי של צבע שנותר SUV. שנית, ריכוזים גבוהים של תוויות שומנים דרושים מרווה עצמית עשויים להשפיע על תהליך ההיתוך עוצמה.

עבור עירור TIRF מקוטב, התקנה מובנית הביתה כמו באיור 4 היא חסכונית ומספקת שליטה מצוינת על נכסי קיטוב. עם זאת, התקנה שנבנה באופן עצמאי אינה הכרחית, כמו לפחות כמה מיקרוסקופי TIRF מסחריים להשתמש עירור מקוטב ה- off- המדףשני צבעי מודולים פליטת פיצול זמינים. מיקרוסקופ מסחרי המשתמשת סיבים שמירה-קיטוב (PM) לזוג אור עירור מקוטב העולה מתוך לייזר לתוך המיקרוסקופ שימש בהצלחה בעבר ^25-27. על מכשיר כזה, הקיטוב ניתן לסובב פשוט על ידי סיבוב קלט סיבים PM ליחידת מיקרוסקופ של TIRF. לעומת זאת, כמה setups מסחרי אחר עשוי להעסיק ספליטר קורה מקטב ביחידת TIRF, ביצוע התאמות קיטוב יותר קשות או בלתי אפשריות. למרבה הצער, תכונות קיטוב הן לעתים קרובות לא צוינו עבור מערכות מסחריות. לכן, זה קריטי עבור משתמשים שאינו רוצים לבנות מערכת בית בנוי לדון תכונות קיטוב לנסות יחידה הדגימה לפני השקעת אפשרות מסחרית מסוימת.

ניטור סימולטני של שומנים ושחרור מטען מסיס מספק מידע נוסף על תהליך ההיתוך. נקבוביות רבים נראה לחתום מחדש לאחר releasing רק חלק קטן של התווית המסיסה כמוס לתוך SUV ^27. בדרך כלל כל תוויות השומנים משתחררות עד הנקבובי reseals, כך resealing הנקבובית לא נחשדה בעבר ממעקב שומני שחרור לבד. ואכן, ניטור שחרור השומנים לבד, Kiessling et al. ²⁹ הציע העברת שומנים שכותרתו לתוך SBL התרחשה באמצעות קריסה מהירה מאוד של קרום SUV כולו לתוך SBL.

Resealing של היתוך נקבובי לאחר השחרור חלקי של תוכן נצפה בעבר ב assay היתוך תיקון bilayer-קשור liposome. Rawle et al. ⁵⁴ טלאי bilayer בודדים מוכנים כי היו קשורים על coverslip ידי ~ 8 ננומטר מפרידי דנ"א ארוכים. לאחר מכן הם הציג ליפוזומים שאת היתוך התיקון bilayer הונע על ידי הכלאה של conjugates DNA-שומנים חד גדילי משלים מעוגנים ממברנות liposome ו תיקון. 12% מכלל האירועים היו בשילובים חולפים, וכתוצאה מכך חלקשחרור ial של תוכן liposome. אירועים מתפרצים Liposome, לראות כמה מבחני היתוך SUV-SBL קודמים ^44, היו נדירים מאוד. המחברים מציעים את החלל ~ 8 ננומטר מתחת תיקון bilayer, מניעת אינטראקציות מצע bilayer, אולי מותר העברה שאינו דולף של התוכן ליפוזום למרחב מתחת bilayer. בנוסף, דיפוזיה של התוויות המסיסות שוחררו לא מעוכבת באופן משמעותי במרחב בין bilayer מישוריים ואת מצע הזכוכית. ב assay המתואר כאן, bilayer מישוריים נשמר באופן דומה ~ 5 ננומטר מן coverslip על ידי הנוכחות של פולי (אתילן גליקול) conjugates -lipid.

המידע הנוסף שמספק ניטור שני צבעי מטענים מסיסים שומנים מגיע עם כמה פשרות. ראשית, הכנת רכבי שטח עם שתי התוויות היא קצת יותר מעורבת מאשר לרבות תוויות שומנים לבד. שנית, יש כמה איבוד בלתי נמנע של אות-לרעש כאשר ניטור אותות מן תוויות שומנים בזמן tרכישה אותה הוא קצב כמו בניסויי שחרור שומנים יחיד צבע (15-20 msec לכל מסגרת). חלק ההפסד הזה הוא בשל העובדה כי עשתה, השתמשה כתווית שומנים יחד עם סמן SRB המסיס, הוא לא מבריק כמו LR-PE השתמש בניסויים יחיד צבע. הפסדים נוספים לנבוע רקע גבוה עקב עירור שני-ליזר סימולטני ומרכיבים נוספים בנתיב האופטי (איור 4). עד כה, אות לרעש הנמוך מנע מאיתנו מעקב אמין של יחיד עשה תוויות בניסויי שני צבעים. זה בתורו מנע ניתוח מעמיק כדי לחלץ את כל המידע שיכול להיות עם מדידות LR-PE יחיד צבע. אתגר זה ניתן להתגבר בעתיד על ידי אופטימיזציה תנאי רכישה ובדיקת זוגות אחרים של תוויות תואמות תכונות משופרות.

ניטור סימולטני של שחרור מטען מסיס שומנים גם יכול לזהות hemifusion, מדינה שבה העלונים הפרוקסימלי יש התמזגו, אבל דיסטליעלונים יש לא. ואכן, ניסויים בשני צבעים כזו עשויה לספק הערכה חותכת רק בנוכחות hemifusion ב אחרים מבחני היתוך במבחנה ^18,20. עם זאת, hemifusion ניתן לאתר באופן אמין שחרור השומנים ניטור ניסויים יחיד צבע SUV-SBL לבד ^22,44. בניסויים כאלה, על 1/2 עוצמת תווית שומנים הראשונית של SUV נשארה בנקודת ההיתוך. עוצמת הנותרים עלולה להיעלם כאשר העלונים דיסטלי לחמש כמה זמן לאחר מכן, אם הנקודה טרם מולבנות.

שימוש שומני PEGylated להציג כרית רכה בין SBL ואת תמיכת הזכוכית כבר מפתח בשעתוק דרישת SNAP25 של exocytosis. תוצאות הפרוטוקול בתוך PEG לצחצח מכסות את הצד של SBL הפונה ערוץ הזרימה גם כן. יש לכך כמה יתרונות, כגון הפחתת אינטראקציות שאינן ספציפיות בין רכבי שטח ואת SBL, כפי שהוסבר במבוא. אם חלבוני אינטראקציה עם פוספוליפידים שלSBL מוכנס assay, עם זאת, מברשת PEG תציג מחסום סטרי נגד אינטראקציות כאלה. לכן, עבור יישומים מסוימים, זה יהיה רצוי לכלול את שכבת PEG סימטרית, רק בין SBL ואת coverslip הזכוכית. הצד של SBL מול ערוץ הזרימה היה אז תוכל לקיים אינטראקציה עם חלבונים מחייבי פוספוליפידים, כגון synaptotagmin. ניתן להשיג זאת באמצעות רשתות PEG דו-פונקציונליות שניתן לקשר קוולנטית אל coverslip בקצה אחד ונושא עוגן שומנים בקצה השני. שיטות לאנגמיור-Blodgett לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להפקיד בשכבת שומנים על שכבת PEG ^55. ליפוזומים הציג מעל פתיל משטח הידרופובי זה עם זה, ויצר bilayer ^56. תקווה הוא כי גישה זו תשולב עם מיקרופלואידיקה בעתיד.

צפוי כי assay SUV-SBL המוצג כאן יהיה מועיל לחקור את התפקיד של חלבונים נוספים כי אינטראקציה עם מלכודות,כמו משפחת Munc18 / Sec1, חיישן סידן 1 synaptotagmin, ו complexin.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O'Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.