Method Article
Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.
השימוש במודלים שורת תאים במבחנה לחקר הסרטן כבר כלי שימושי. עם זאת, הוכח כי מודלים אלה אינם מצליחים לחקות גידולים המטופל באופן אמין מבחני שונות 1. Xenografts גידול האנושי מייצג את תקן הזהב ביחס ביולוגית גידול, גילוי תרופות, ומחקר גרורות 2-4. Xenografts גידול יכול להיגזר סוגים שונים של חומרים כמו שורות תאים סרטניים, רקמת גידול מגידולים מטופלים עיקריים 4 או גידולים המושתלים באופן סדרתי. כאשר מופצות in vivo, רקמות xenografted הוא שחדר ו vascularized ידי תאים ממוצא העכבר. גורמים רבים כגון ישות הגידול, מקורם של חומר xenografted, קצב צמיחה באזור ההשתלה להשפיע על הרכב וכמות תאי עכבר נוכחים xenografts גידול. עם זאת, גם כאשר גורמים אלה נשמרים קבועים, מידת זיהום העכבר התא הוא משתנה מאוד.
שיתוףבתאי עכבר ntaminating משמעותיים לפגוע ניתוחים במורד זרם של xenografts הסרטני האנושי. כמו פיברובלסטים עכבר להראות efficacies גבוהה ציפוי ושיעורי התפשטות, הם נוטים לגדול יותר תרבויות של תאים סרטניים אנושיים, במיוחד מתרבים subpopulations לאט. תא עכבר נגזר DNA, ה- mRNA, ורכיבים חלבון יכול ניתוח ביטוי גנים הטיה במורד הזרם, רצף של הדור הבא, כמו גם proteome ניתוח 5. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטית עם Dissociator המעבדתיים רקמות מיון תא מגנטי. כאן, אנו מראים כי תאי מטרה אנושיים יכולים להיות ניתן להשיג עם purities גבוה מ -96% בתוך פחות מ -20 דקות תלויות בסוג הגידול.
גידולים אנושיים מוצקים מורכבים פיסיולוגי רב כמו גם סוגי תאי ממאירה. הם יוצרים רקמות הטרוגנית עם מבנים ביולוגיים מורכבים. תהליכים ביולוגיים כמו הגידול היווצרות, התקדמות ותגובות כלפי טיפולים עדיין אינם מובנים במלואם. מודלים תרבית תאים במבחנה ב מייצגים כלי שימושי ללמוד ולהבין ביולוגיה הגידול. עם זאת, הם יכולים רק חלקית לשקף מבנים ותהליכים נמצאים ברקמות גידול. במודלים פרה אמינים ויציבים של גידולים בבני אדם הם תנאים הכרחיים לפיתוח תרופות אנטי גידול וטיפולי 4,6 וכן להבנת ביולוגית גידול ואת האינטראקציה של תאים סרטניים לבין סביבתם.
מודלים אנושיים xenograft גידול שמקורם בגידולים מטופלים עיקריים להראות יחסים גבוהים לרקמות ממוצא לגבי אדריכלות היסטולוגית, אינטראקציות עם מבנים מיקרו-סביבה, פוטנציאל גרורתי ותגובות לתרופות 7 . גם כאשר xenografts גידול נגזר תאים בתרבית או שורות תאים הוא לחקות באופן הדוק יותר גידולים חולים, ולכן מראת תוקף גבוה ברוב המבחנים לעומת דגמי תרבית תאים במבחנה. תכונות אלו הופכות אותם תקן הזהב של במודלים פרה 4. מלבד היישום שלה בחקר הסרטן, השתלה שלא מבן-מינו של תאים אנושיים בעכברים גם משמש לעתים קרובות במחקר תאי גזע כדי לקבוע את פוטנציאל stemness והבחנה של אוכלוסיית היעד 8.
הוכח כי microvasculature האדם ותאי חיסון אנושיים מוחלפים על התפשטות in vivo של גידולים אנושיים 2,9. גורמים כגון תת סוג הגידול, קצב צמיחה, ואת האזור של השתלה יש השפעות משמעותיות על ברמה הגלובלית של חדירה וכן בהרכב סוגי תאי עכבר נמצא. עם זאת, גם כאשר הגורמים אלה נשמרים קבועים, בסך ורכב תאי עכבר הם משתנים מאוד.
ניתוחי Downstream של רקמות xenografted לעתים קרובות מאותגרים על ידי תאים ממוצא בעכברים. תרבויות עיקריות של תאים סרטניים אנושיים מן xenografts הם מגודלים לעתים קרובות על ידי פיברובלסטים. מלבד פגע הדור של שורות תאים סרטניים במבחנה, מבחנים במורד כגון בדיקות או הפרמקוקינטיקה cytotoxicity תרופה מוטים מאז בתיקון סיליקון עבור תופעות שמקורן זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. מעבר לכך, ההצטלבות הובהרה באופן חלקי בלבד בין פיברובלסטים עכבר ותאי גידול אנושיים יש השפעה ישירה על תוצאות ניסוי של מחקרים 10. יתר על כן, הווריאציה הצפויה הנרחב ביותר של הסתננות בתאי עכבר מחריף ניתוחים במורד מולקולרי מדויקים. ב NGS או proteome מנתח כל אות עכבר נגזרות נמדדה במקום אות גידול אנושית פוחתת רגישות רצף ישירות. גם מנתח הביטוי מבוסס microarray מאותגרים על ידי nuc murineחומצות leic ואולי והכלאה צולבת בדיקות אדם.
על מנת לעקוף את המכשולים של זיהום תאי עכבר בניתוחים במורד זרם של תאים סרטניים אנושיים ממודלי xenograft גישות שונות הוצעו. במחקרים רבים תאי יעד רצויים לניתוח במורד זרם מבודדים על ידי ניצול סמנים או שילובים של סמנים לידי ביטוי אך ורק על תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, העדר סמנים האמינים זיהוי חיובי של תאים סרטניים אנושיים לעתים קרובות מייצג מכשול גדול. אפילו רחבת סמנים הביעו, כגון EpCAM על קרצינומות אדם, לעתים קרובות להראות הבדלי ביטוי מהותי גידול 11. זה מגביר את הסיכון כי נמוך subpopulations להביע, למשל, תאים סרטניים שעברו אפיתל-to-mesenchymal המעבר, הם איבדו במהלך הבידוד. בנוסף, המחייב הישיר של סוכן בחירה לתא היעד עלול להשפיע על תוצאות הניתוח שלאחר מכן. ניסיונות של ומכלת תאי עכבר על ידיבאמצעות שילוב של נוגדנים ספציפיים עבור CD45 murine ו אפיטופים אני בכיתה MHC גם נעשו 12. עם זאת, שילוב סמן זה רק מזהה תת קבוצה של תאי עכבר. גישה נוספת היא לשפר תהליכי ניתוח על ידי תוכנה. אף על פי כן, כל הגישות הללו הן גם לא מתאימות לכל סוג של התקנה ניסיונית או לכל ישות גידול ושיטת השתלה.
במחקר זה אנו מציגים רומן שיטה מהירה עבור ומכלה בתאי עכבר מקיף מרקמות xenografted העצמאיות של זן העכבר ורקמות מוצא. בהקרנות על איברים ורקמות יעד מרובים להשתלה של xenografts (כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד) הצלחנו לזהות שילוב של נוגדנים המאפשרים לגילוי תאי עכבר באופן מקיף. נוגדנים אלה היו מצמידים לחלקיקים פאראמגנטי, טיטרציה אופטימיזציה עבור דלדול באמצעות מיון התא מגנטי. כפי ספציפי עכבר בלבדנוגדנים משמשים, תאי יעד אדם להישאר "נגעו" והשיטה אינה מוגבלת רקמת גידול xenotransplanted. אנו מראים כי תאי עכבר הסרה מקיפה ממדגם גידול xenografted סטנדרטיזציה ומקלים בתרביות תאים סרטניים אנושיים. יתר על כן, אנו מראים כי הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי רצף הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר ספציפי אדם רצף בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יחדיו, הסרת תאי עכבר באמצעות שיטה חדשנית זו מקלת טיפוח של תאים סרטניים אנושיים משפרת באופן משמעותי את הניתוחים במורד הזרם של xenografts הסרטני האנושי.
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות אתיות ומשפטיות מקומיות של Regierungspräsidium פרייבורג "רפראט 35.
1. הכנת מגיב
הערה: לפני תחילת הניסוי, להכין את ריאגנטים הבאים מתוך הערכת דיסוציאציה:
2. גידול דיסוציאציה פרוטוקול
הערה: במחקר זה xenografts הנגזרות החולה בסרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC), סרטן הכליה ושלפוחית השתן שימשו. הגידולים נוצרו על ידי השתלת xenografts של סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) סרטן הכליה ושלפוחית השתן ב 4 - 6 שבועות הנקבה NMRI נו / נו עכברים כפי שתואר לעיל 13 .
הערה: ככל פרוטוקול זה הוא עצמאי לחלוטין של סוג הגידול, ניתן להשתמש בו עבור כל סוג של מטופל או תא הנגזרות קו גידול, כמו גם סוגים אחרים של רקמה אנושית xenotransplanted ללא שינוים, את הפרוטוקול.
3. דלדול תא עכבר ידי טכנולוגית הפרדת Cell המגנטית
הערה: כרכי תיוג מגנטי כדלקמן הם עד 2 x 10 6 תאים סרטניים או 10 7 תאים הכוללים כולל תאי דם אדומים. בהתאם לגודל הגידול נמוך או מספרים גבוהים יותר תא יושג. במקרה של פחות תאים, השתמש באותה כרכים כמצוין. בעת שימוש מספרים גבוהים יותר תא, בקנה מידה את כל כרכים מגיבים כרכים הכוללים בהתאם (למשל, עבור 4 x 10 6 תאים סרטניים או 2 x 10 7 תאים כוללים, השתמשו פעמים בהיקף של כל כרכים המגיבים הצביעו ואמצעי האחסון כולל).
4. ניתוח Downstream
גישות שונות הוצעו כדי לזהות אותך או לרוקן בתאי עכבר המופקים מגידולים אנושיים xenografted, למשל שילוב של נוגדנים ספציפיים העכבר נגד CD45 ואני בכיתה MHC עם זאת, רק תת-אוכלוסיות של תאים עכבר התגלו באמצעות שילובים אלה ואילו השילוב המוצע זוהה CD45 ו MHC אני בכיתה לבטא בתאי עכבר, כמו גם את שאר תאי העכבר נמצאים ברקמות יעד להשתלה (איור 1). ניצול שילוב הרומן הזה של נוגדנים עבור מיון תא מגנטי, תאים סרטניים אנושיים יכולים להיות מבודדים עצמאיים של סוג גידול (איור 2).
תאי מתקבל הסרת עכבר מבוסס תאי הליך הפרדת תא מגנטית יכולים להיות מתורבתים, מה שמוביל תרבויות טהורות של תאים סרטניים אנושיים (איור 4). בנוסף, תאי עכבר קיימא יכולים להיות מושגת ותרבותית מןמדגם זהה. מלבד הסרת תאי עכבר, גם פסולת הוסרה על דלדול תא עכבר (MCD) (איור 3).
הדלדול המקיף של תאי עכבר כמו גם להוביל הסרת פסולת לניתוחים במורד מולקולרי השתפרו. זה הודגם על ידי השוואת תוצאות המתקבלות רצף exome כולו (WES) בוצעו על חתיכות גידול בכמויות דגימות מדולדלות עכבר תא משלושה נגזרות חולות שונים מודלי גידול xenograft (איורים 5 - 9). הנתונים שלנו מצביעים כי הסרת תאי עכבר לפני ביצוע WES על דגימות גידולי xenograft לא רק מגבירה באופן משמעותי את הסכום הכולל של קורא (איור 5), אלא גם מפחיתה באופן משמעותי את מספר המארח נגזר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי (איור 6). כפי בטעות ממופה אלה העכבר קורא להפריע לעתים קרובות באמצעות שיחות SNP, צפינו ירידה חזקה של שקר חזהSNPs לאחר MCD (איורים 7 - 8). לבסוף, הראינו כי הסרת סיליקון ב של העכבר הנגזר קוראה בשיטות ביואינפורמטיקה לא יכול להחליף את ההליך הניסיון לחלוטין, כמו משימה מבוססת רצף חד משמעית מיני ממוצא לא הייתה אפשרית עבור כל הקורא. יתר על כן, בהליך סיליקון לא יכול נכון עבור איכות משופרת וכיסוי לקרוא במקביל גבוה של דגימות מדולדלות חוץ גופייה (איור 9).
איור 1. הקמת קוקטייל נוגדן הכרה כל תאי העכבר פני 14 איברים מרובים. הקרנות באיברים רבים, כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד, בוצע. איברים אלה מייצגים את רקמות יעד מרכזיות עבור השתלה שלא מבן-מינית. צירופים כגון אלה mou ההכרהse CD45 ו MHC בכיתה אני אפיטופים כבר שימשו כדי לרוקן בתאי עכבר לאחר השתלה שלא מבן-מינו. עם זאת, שילובים סמן אלה מוכרים רק קבוצת משנה של תאי עכבר בכל הרקמות המנותחות. בשנת הקרנות קודמות שילוב של חמישה נוגדנים זוהה המאפשר זיהוי המקיף של כל התאים ממקור עכבר. לוח זה כולל תאי דם אדומים הוא עצמאי של רקמת מוצא (A, B, ו מידע לא מוצג). שונה מ 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דלדול מהיר ואמין של תאי עכבר 15. Conjugates של שילוב הנוגדן עם n פאראמגנטיanoparticles שמש לפתח פרוטוקול אופטימיזציה עבור דלדול של תאי עכבר xenografts הסרטני האנושי על ידי תא מגנטי מיון (פרדת תא מגנטית) (א). פרוטוקול הרומן הזה מותר לשם מניעה> 99% של זיהום בתאי עכבר בתוך פחות מ -20 דקות, ללא קשר לסוג הגידול. שברים ניידים המתקבלים הליך הפרדת תא מגנטי תויגו עם הקוקטייל של נוגדני הפאן עכבר נוגדן ספציפי אדם נגד CD326 (EpCAM) (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידוד איור 3. של אדם תאי Glioblastoma. ערכת שחסך בתאי עכבר שמש לבודד תאי גליובלסטומה אדם מן mous המבוגרמוח דואר. במהלך דיסוציאציה של כמויות גדולות של רקמה עצבית פסולת נוצרת בדרך כלל. MCDK מכלת תאים מתים ביעילות פסולה כפי שניתן לראות על ידי העלילה מראה גודל תא מול גרעיניות תא. עם קוקטייל המצומד זה, אפשר היה לחסל> 99% של תאי עכבר זיהום ו> 60% של הפסולת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דלדול איור 4. עכבר תאי מקלת תרבויות Downstream של תאים סרטניים אנושיים 14. פיברובלסטים העכבר לעתים קרובות לעכב את הטיפוח של תאים סרטניים אנושיים לאחר הניתוק של רקמות מושתלות או להוביל תרבויות הטרוגנית. פיברובלסטים לצרף ולהרחיב ביעילות רבה יותר, ובכך overgrowing ג היעד אמות. זה מדאיג מבחני תרבית תאים במבחנה (בדיקות רעילות למשל, תרופה), מאז תיקון מתמטי תופעות נובעות זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. הצד השלילי (B) והשברים חיוביים (C) לאחר דלדול עכבר תא היו בתרבית למשך שלושה ימים, קבוע מוכתם עבור סמן פיברובלסטים עכבר ספציפי (vimentin) ואת סמן הגידול האנושי ספציפי CD326 (EpCAM). כביקורת, השבר המקורי המכיל תאי unseparated (א) היה מתורבת ומוכתם גם כן. גם לאחר שלושה ימים של תרבות, אוכלוסייה טהורה כמעט של תאים סרטניים אנושיים נצפתה השבר השלילי (ב), ואילו את החלק היחסי הממוין (א) היה כמעט מגודל על ידי פיברובלסטים. רק חלק קטן של תאי היעד אבד החלק החיובי (C). השתנה מ -14.ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. כל הפריטים Exome רצף (WES) של דגימות גידולים לפני ואחרי דלדול תא עכבר (MCD) 15. ערכנו WES על שלושה מודלים xenograft שונים נגזר כליה אנושית, ריאות וסרטן שלפוחית השתן על מנת להעריך את ההשפעה של MCD על איכות נתוני רצף של הדור הבא. DNA מגידולים בתפזורת מתאי גידול מבודד לאחר שחסך בתאי העכבר היה השתמש כדי ליצור ספריות רצף שנתפס exome החלת ערכה ללכוד exome. עבור סידור על מכשיר ברצף שולחן עבודה, ערכה מגיבה ברצף שולחן עבודה 150 מחזורים, נוצל כדי ליצור 75-נ"ב לזווג סוף הקורא. עלייה משמעותית (p <0.05) בצפיפות אשכול (א) וכן aveזעם עלייה בספירת קריאה של 33% (ב) נצפתה על הדגימות המדולדלות של בתאי עכבר, המציין איכות מדגם השתפרה. במקביל, ירידה חזקה של פסולת תאים מתים על MCD יכולה גם לבוא לידי ביטוי על ידי ניתוח תזרים cytometry (ראה איור 3). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דלדול Cell איור 6. עכבר (MCD) בתוקף מפחית המספר בטעות הממופה העכבר קורא אחרי כל פריטי Exome רצף (WES) 15. כפי oligonucleotides ללכוד המשמש להעשרה ממוקדת של רצפי מקודדי חלבונים נועדו מבוסס על גנום האדם, גידול טרום ראשוני העשרת קטעי דנ"א של fr ממקור אנושיom את התערובת של עכבר תאים אנושיים הייתה צפויה. על מנת להעריך את מספר oligonucleotides לכידת שעשוי לחצות להכליא עם הדנ"א הגנומי העכבר, ערכנו חיפושים תפציץ של כל בדיקה exome ללכוד מהירה אחת נגד גנום העכבר. פרמטרי היישור וכתוצאה ששמשו לקביעת הכלאה צולבת אפשרית. (.. אורך יישור, לא של חוסר התאמה, לא פערים) בהתאם ספי הבחירה, אנו חזינו תגובתיות צולבת של 5 - 10% של בדיקות ללכוד עם תמלילי עכבר (מידע לא מוצג). לאחר גזיר מתאם (trimmomatic v0.32 16), אנו מייפים את הקורא של כל הדגימות נגד הגנום אנושי ועכבר (v0.7.12 BWA 17) וקבענו מהמוצא המשוער שלהם בהתבסס על פרמטרי יישור בהתאמה (פגז LINUX, שורת פקודה פרל) (א). בממוצע 12% של הקורא נגזר דגימות גידולים בתפזורת יוחס בתאי עכבר. סכום זה יכול להיות מופחת ל -0.3% על ידי דלדול מראש של תאי עכבר (B ). כמו ב -15% ממוצעים של עכבר נגזר קורא ממופית בטעות את הגנום האנושי, המקביל ל -1.9% בסך הכל קורא בדגימות הגידול בכמויות 0.04% בתאים הסרטניים הבודדים, השפעה חיובית חזקה של דלדול תא עכבר על ניתוחים במורד זרם ניתן לצפות. איור 6 מדגים את המשימה לקרוא מפורטת גידול בכמויות תאים סרטניים אנושיים מבודדים נגזרים xenograft סרטן שלפוחית השתן. שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. MCD בתוקף מפחית את מספר SNPs חזוי שווא 15. על מנת לקבוע את ההשפעה של העכבר קורא ממופה הגנום האנושי, קבענו את מספר predicteSNPs ד עבור דגימות xenograft לפני ואחרי MCD. מאחר שלא רקמה בריאה היה זמין עבור השוואה, SNP הוגדרה הבדל בין המדגם רצף ואת הגנום הפניה (hg19). לאחר הסרת כפולים קורא, SNP וקראו INDEL נערך 18 ו הוגבל באזורים אליהם מכוון ערכת ללכוד exome. 63 ± 10% מכלל SNPs ניבאו עבור דגימות גידול בכמויות הגדולות אינה אותרו כבר לאחר שחסך בתאי עכבר, 18 ± 1% היו ספציפיים עבור התאים הסרטניים האנושיים המבודדים (א). בעוד שהראשונים נגרמו בעיקר על ידי עכבר ממופה בטעות קורא את זה האחרון נראה להתגלות בשל ספירת קריאה גבוהה וכיסוי בהתאם גבוה בתוך דגימות תאים סרטניים האנושיות המבודדות. אפקט זה היה גלוי גם עבור indels חזה (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.
איור 8. MCD משפר את חיזוי מרשימות SNPs 15. (א) השפעת MCD על חיזוי SNP בתוך אקסון המקודדים חלבונים של הגן POLA1 19 מודגם. בעוד העכבר ממופה בטעות קורא גרם למספר SNPs ניבא באופן שקרי ב xenograft סרטן הכליה בתפזורת, SNPs אלה חסרים לאחר MCD. בנוסף, MCD גם שיפרה את התחזית של השפעה גבוהה SNPs. לדוגמא, עכבר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי במדגם גידול בתפוצה הרחב גרם להרס חזה בטעות של קודון ההתחלה של גן GRIA3 (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 9. סיליקו דלדול של עכבר נגזר קורא לא יכול מלא להחליף לי n Vitro 15 MCD. קורא צפוי להיות ממוצא העכבר הוסרו מחשוב מנתוני הרצף, וקראו SNP חזר על עצמו. לפי גישה זו, מספר SNPs ניבא עבור דגימות גידולים בתפזורת הופחת באופן משמעותי מ -63% ל -8.5% של המספר הכולל של SNPs (להשוות עם איור 8). עם זאת, זה בגישת סיליקון לא יכול להחליף לחלוטין את במבחנת MCD, במיוחד אם איכות המדגם המשופרת והעלייה במקביל בספירה לקריאה והכיסוי נחשב. שונה מ 15."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטיות מיון תא מגנטי. מלבד דלדול של כל התאים בעכבר גם את כמות תאים מתים ופסולת מצטמצם משמעותית בשבריר תא המטרה. יחדיו, שיטה זו משפרת ניתוחים במורד מולקולריים משמעותית וטיפוח התאים סרטניים אנושיים.
בניגוד לשיטות חלופיות, אין צורך בידע של סמנים ספציפיים תאים סרטניים, התאמה שונה קומפוזיציות של תאי עכבר או הקמת אלגוריתמים. השיטה המוצגת היא עצמאית של זן העכבר וסוג הגידול. לכן, הטיה דרך בידוד של תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם על בסיס סמנים ספציפיים אנושיים אחת אשר עשוי להשתנות ביטוי, כפי שמוצג על EpCAM 11, היא להימנעed. יתר על כן, זה אינו מוגבל לחומר גידול אך יכול לשמש לכל סוג של רקמת xenotransplanted כתאי עכבר ממוקדים במקום תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם ספציפיים (מידע לא מוצג).
הסרה מקיפה של תאי עכבר היא הקלה על ידי מיקוד אפיטופים שטח לידי ביטוי אך ורק על תאים ממוצא עכבר. מלבד השיטה המבוססת היטב עבור דיסוציאציה גידול כפי שהוצג במחקר זה, קיימים נהלים רבים באמצעות סוגים שונים של אנזימים. שימור אפיטופים פני התא הוא תנאי הכרחי שיטה חדשנית זו, אלא גם עבור ניתוחים מדויקים של אוכלוסיות תאים סרטניים אנושיות. לכן, חשוב כי אנזימים עדינים משמשים לעיכול של רקמת גידול. לפיכך, דלדול תא עכבר ניתן להשתמש רק בשילוב עם נהלי עיכול אנזימטי שכנראה אינו משפיעים אפיטופים ממוקדים במהלך הליך שחסך בתאי עכבר. במקרה של ספק זה ניתן לאמת רק על ידי היצרן, בהתאמה.
שיטה זו עובדת גם עבור תאים סרטניים אנושיים במחזור (CTCs). עם זאת, כמו תדרים של תאי היעד הם בדרך כלל <0.1% סרים של תאי עכבר בנוסף דורש תמוגה תא דם אדום purities של יותר מ -50% לא ניתן לצפות. במקרה זה, דלדול תא העכבר יכול לשמש להעשרת מראש של CTCs ואחריו העשרה באמצעות סמנים חיוביים (מידע לא מוצג).הסרת תאי עכבר משפרת באופן משמעותי את התרבות של תאים סרטניים אנושיים על ידי הימנעות לגדול תרבות של פיברובלסטים עכבר. בנוסף, הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי הרצף של הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי טופל. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר רצף ספציפי אדם ממוקד בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט.
יתר על כן, השיטה המוצגת מקלה ACCURAמחקרים מולקולריים te של תת-אוכלוסיות גידול בתוך גידולים אנושיים xenotransplanted. הסרת תאי עכבר ממדגם בהתאמה בשלב הראשון ולאחר מכן מיון תאים סרטניים אנושיים בשתי תת-אוכלוסיות שונות מאפשרת השוואה מולקולרית ישירה של תת-אוכלוסיית הגידול מעניין תאים סרטניים בתפזורת אדם 20. ביטוי גנים דיפרנציאלי בין תת תא גידול ניתן להעריך בצורה מהימנה יותר כפי שהוא אינו מושפע הכלאה צולבת של מולקולות נגזרות עכבר.
David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia Rüberg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio and Olaf Hardt are or were employees of Miltenyi Biotec GmbH, Germany. Kerstin Klingner and Julia Schüler are employees of Oncotest GmbH, Germany.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved