בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

תאי גזע בוגרים (גיל) הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות על ידי החלפת תאים מתים ותיקון רקמות שנפגעו על פציעה. גיל אלה מוגדרים על ידי היכולת שלהם לעבור התחדשות עצמית מתמדת להתמיין שושלות תאים שונות ^1-3. המערכות למדו הטוב ביותר, אשר תלוי גיל מבוגר עבור החידוש שלהם, כוללות את מערכת hematopoietic, במעי ^1,2,4 העור.

במהלך עובר, העור מתחיל כמו שכבה אחת של תאי אפידרמיס. המורפוגנזה של זקיק השיער (HF) מתחילה כאשר תאי mesenchymal לאכלס את העור ומהווה הדרמיס collagenous בסיסי ^5. מתמחה תאים mesenchymal, כי מאוחר יותר מהווים את עורי פטמית (העקורים), לארגן ישירות מתחת לשכבת האפידרמיס וממריץ האפיתל כדי ליצור placodes השיער מתחיל לצמוח כלפי מטה ^6. מאוד מתרבים תאי מטריקס, ממוקם בחלק התחתון של HF,מעטפת תאי mesenchymal אלה ויוצרים את השיער הנורה, בעוד השכבה הפנימית מתחילה להתמיין גלילים קונצנטריים לגבש השערה (HS) ואת נדן השורש הפנימי שמסביב (IRS) ^2,3.

לאחר הינקות האפידרמיס בעור מורכב משלושה תאים: האפידרמיס interfollicular (IFE), בלוטת החלב (SG) ואת HF. בניגוד IFE ו SG אשר נמצא במצב מתמיד של הומאוסטזיס, את HF הוא איבר מיני דינמי אשר עובר מחזורים רצופים של צמיחה (anagen), הרס (קטגן) ומנוחה (telogen) ^4,7. תאי גזע זקיק שיער (HFSCs) דלק כי במחזוריות בלתי פוסקת זו, הנמצאים ליד גומחה בתוך HF המכונית הבליטה ^4. במהלך Anagen HFSCs לצאת הבליטה, העוקבים אחר איתות הפעלה מן העקורים, להתחיל מתרבה ויורד כלפי מטה ובכך ליצור שובל ליניארי ארוך של תאים המכונים נדן השורש החיצוני (ORS) ^8-10. תאי מטריקס, כימקיפים את העקורים בבסיס של HF, מחזור במהירות ולהעביר שעברו התמיינות מסוף כלפי מעלה ובכך יצירת HS ואת ¹⁰ IRS (איור 1). משך anagen קובע את אורך השיער תלויה יכולת שגשוג והתמיינות של תאי מטריקס ^6. כאשר HF נכנס קטגן, התאים מטריקס הגברה במעבר בהפסקת הנורה להתרבות, עוברים אפופטוזיס ו לסגת לחלוטין תוך משיכת העקורים כלפי מעלה עד שהוא מגיע אל החלק הלא-אופניים של ^8,11 HF. במהלך הכחשה זו HF יוצרת מבנה זמני הידוע כאפיק אפיתל, אופייני קטגן, ומכילה הרבה תאים אפופטוטיים. בעכברים, קטגן נמשך בין 3-4 ימים, והוא מסונכרן מאוד במחזור השיער הראשון. כאשר HF מגיע telogen כל HFSCs להיות שקט. השלבים ברורים של מחזור HF גם מאופיינים שינויים בצבע העור העכבר של בשל מייצור elanin. השינויים העור משחור במהלך anagen כדי אפור כהה במהלך קטגן לוורוד במהלך telogen ^6,7,12,13.

איור 1: מחזור זקיק השיער. HF מורכב בחלקו העליון קבע וחלק שיפוץ נמוך כל הזמן, רכיבה על אופניים, אשר עוברת מחזורים רצוף של צמיחה מהירה (anagen), הרס (קטגן) ושלב קפאון קרוב משפחה או שאר (telogen). אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

ה- SCS שמירה על HF זוהה בתחילה באמצעות ניסויי מרדף, עם thymidine tritiated, שחשפו אוכלוסייה של תאי שומרי תווית רכיבה איטית (LRC) ששכנו באזור הקבע של HF ממש מתחת SG ^14. התקדמות HFSCאפיון חשף מספר קטן של סמנים כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולבודד גיל ספציפי מן הנישה HF ^15. אולי הסמן הטוב ביותר להעשרת HFSCs הוא CD34, סמן פני התא מזוהה גם כסמן SC hematopoietic בבני אדם ^16. בתוך CD34 זה ⁺ אוכלוסיות שתי אוכלוסיות נפרדות גם בודדו מבוסס על integrin α6 ביטוי ^2. סמן נוסף הוא קרטין 15 (K15) אשר מבוטא בכמות גבוהה באזור הבליטה, שיתוף לוקליזציה עם ביטוי CD34 ו אמרגן K15 משמש למיקוד ולבודד HFSCs בחיות מהונדסות ^15,17-19. בעשור האחרון מספר אוכלוסיות נפרדות אחרות של HFSCs ו ובתאים גם דווחו להתגורר בתוך HF ^17,20-27.

תכונה מרגשת נוספת של HFSCs תרומתם תיקון עור. בתנאים רגילים HFSCs לחדש את HF ואינו לוקח חלק הומאוסטזיס IFE. HoweVer, בתגובה פציעה, תאים אלה לצאת נישה SC שלהם וסיוע repopulating IFE ^9. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי עכברים שנמחקו עבור תצוגת הגן הפר-אפופטוטיים Sept4 / ARTS למספר גדל והולך של CD34, K15 ו Sox9 ⁺ HFSCs, מה שמראה על התנגדות אפופטוזיס. HFSCs בודד Sept4 / ARTS ^{- / -} עורות מגבים ניצול התא מופעל קרינת מיון (FACS) והיה יותר שני גידול של פי מספר CD34 ⁺ ו- K15 ⁺ HFSCs. ARTS Sept4 / אלה ^{- / -} HFSCs הורחב במבחנה ולא הוליד רק מושב יותר אבל היו גם מסוגל לעמוד בתנאים קשים בהשוואה לקבוצת ביקורת ^28.

כתוצאה מכך שיש מספר גדל של HFSCs, Sept4 / ARTS ^{- / -} עכברים נרפאו מהר יותר באופן משמעותי בתגובת פציעות כריתת עור. באופן מפתיע, Sept4 / ARTS ^{- / -} עכברים displayeדה מספר רב של HFS מחדש ממיטת הפצע, וצלקות קטנות באופן משמעותי. יתר על כן, העכברים שנמחקו עבור XIAP (X-linked מעכב אפופטוזיס), ליעד ביוכימיים של ARTS, הפגינו ריפוי לקוי ^28.

תוצאות העבודה שלנו בצעה במעבדות אחרות הראו כי HFSCs לשמש מודל אידיאלי עבור מחקר על הביולוגיה והתפקוד של גיל מבוגר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה של העשרה ובידוד של HFSCs ו קרטינוציטים אפידרמיס מבוסס על הביטוי של ארבעה סמנים: α6 integrin; β1 integrin; SCA-1 (סמן קרטינוציטים אפידרמיס) ו CD34. בידוד דומה K15 ⁺ HFSCs יכול גם להתבצע באמצעות עכבר כתב K15-GFP ^19.

מחקר זה בוצע בהתאם קפדנית עם המלצות שהותוו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של משרד הבריאות הישראלי. כל החיות טופלו על פי פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מוסדי המאושר IL-02302-2015 של הטכניון טכנולוגי.

1. הכנה ניסויית

1. הכין בסרום שור העוברי chelated
   הערה: תאי אפיתל רגישים מאוד סידן ולכן חשוב לשלוט על החשיפה של תאים אלה סידן. על מנת להבטיח כי התאים אינם חשופים סידן במהלך קלאציה תהליך הבידוד משמש כדי להסיר כל סידן שיורית מן בסרום שור עוברית המשמש להכנת חיץ מכתים ^29. הפרוטוקול הבא מכין כ 1 ליטר של החופשי סידן עוברי שור סרום הנדרש למאגר מכתים הכנת FACS.
   1. להוסיף 400 גרם של חומר chelating יבש, למשל., Chelex, לתוך מבחנה 4 L ולהוסיף מזוקקים H ₂ O ל בהיקף כולל 4 ל כיסוי ומתמשך מוקפצים באמצעות בוחש מגנטי.
   2. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 10 N פתרון HCl תוך ערבוב. המשך ערבוב במשך 20 דקות מחדש ולהתאים את ה- pH לפי הצורך עד pH נשאר יציב במשך יותר מ -20 דקות.
   3. דגירת כוס לני 4 ° C. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H ₂ O ולהוסיף מזוקקים טריים H ₂ O ל בהיקף כולל של 4 ל '
   4. חזור על התאמת pH כמו בשלב 1.1.2.
   5. מניח את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H ₂ O.
   6. לאט לאט מוסיפים שתי 500 מ"ל בקבוקי בסרום שור העובר לחומר chelating. מערבבים לאט על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להבטיח כי הגדרת המהירות אינה מייצרת בועות.
   7. מניחים את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את החומר chelating להקים חינמוןלפעול גלולה.
   8. להעביר בזהירות את הנוזל לתוך בקבוק 1 ליטר זכוכית לסנן אותה דרך פילטר עליון בקבוק בתנאים סטריליים. אחסן את בסרום chelated ב -20 ° C או להשתמש מיד.
2. הכנת מאגר מכתים
   1. הכן 100 מ"ל של 3% chelated FBS ב PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ ולשמור על הקרח.

בידוד 2. של זקיקי השיער למבוגרים אפידרמיס

1. להרדים עכברים באמצעות isoflurane 5% באמצעות תיבת אינדוקציה. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם באמצעות עכברים ישנים 50-80 יום נמצאים בשלב telogen של מחזור HF.
2. להרדים עכברים על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים. הנה, להרדים עכברים באמצעות מנת יתר CO ₂ בתא המתת חסד.
3. לגלח את כל השיער מן העור הגבה באמצעות קוצץ חשמלי. הימנע ראש וגפיים. שמור את הקוצץ קרוב ככל האפשר לעור. למנוע נזק לעור השכבה התת עורית.
4. כאשר כל השיער מוסר, להשתמש 70% אתנול כדי להסיר שאריות שיער כדי לחטא את עור הגב.
5. מניחים את העכבר על כרית לנתח, מלקחיים באמצעות להרים את העור ליד הזנב ולעשות ניק קטן בעזרת מספריים. חותך את עור הגב כולו בכיוון אחורי-קדמי על ידי חיתוך בזהירות את העור ומפריד בינה לבין fascia. למנוע נזק השכבה התת עורית.
6. מניחים את העור על מחצלת לנתח, בצד השיער כלפי מטה, להצמיד שני הקצוות הסמוכים של העור לתקן במקום. בעדינות לגרד את השומן, באמצעות אזמל בוטה עד הדרמיס ברור ומסודר.
   הערה: כאשר מגרדים את השומן, להשתמש במלקחיים מעוקל כדי להפעיל לחץ עדין על העור. החל לחץ על העור באמצעות הצד המעוגל של מלקחיים. פעולה זו תמנע את העור מקריעה.
7. מניחים את העור, הדרמיס בצד למטה, ב 100 מ"מ צלחת תרבות סטרילי, ויישר את העור על מנת להבטיח כי אין קפלים. הוסף 10 מ"ל של PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ (PBS ^-) כדי בצלחת תרבות וליישר את העור במידת הצורך.
8. לשאוב PBS ולהוסיף 10 מ"ל של טריפסין 0.25%. ודא כי העור הוא פרש והוא צף בחופשיות. דגירה פיסת עור אחד לכל 10 מ"ל של טריפסין 0.25%.
9. דגירת דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-120 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. הכנת תרחיף תא בודד מ'שיער' זקיקים

1. גרד את כל השיער מעל העור באמצעות מלקחיים מעוקלים אזמל, ב קדמי לכיוון אחורי. מתחי את העור במקום באמצעות צדו הקמור של מלקחיים ולהשתמש אזמל כדי לגרד את השיער.
   הערה: אל תגרד את השיער לתוך התמיסה טריפסין הוסיף בשלב 2.8. התחל הזנב ופעל בכיוון צמיחת השיער. מגרדים נגד כיוון צמיחת שיער יגרום לאובדן משמעותי של HFS ו ירידה בתשואת תא. HFS נוטה לדבוק זה יחד ויוצר גושים קטנים; על מנת לצמצם הגודל דואר של גושי HF לנסות לגרד שטח קטן בכל פעם.
2. מעבירים את העור ללא שיער כדי בצלחת תרבות חדשה ולהוסיף 10 מ"ל של PBS ^- כדי למנוע התייבשות. בדוק את העור לגרד כל שיער נותר.
3. לשבור את HFS באמצעות אזמל מלקחיים עד השעית HF יחידה מתקבלת. במרץ triturate השעית HF באמצעות פיפטה 10 מיליליטר במשך כמה דקות כדי לשבור את כל גושי השיער.
   הערה: בצע את כל השלבים הבאים על קרח.
4. מעבירים את ההשעיה HF בצינור 50 מ"ל מראש שכותרתו.
5. לשאוב PBS ^- מן העור ולהשתמש בו כדי לשטוף את צלחת תרבית תאים שהכילה השעית HF; להעביר את הצינור 50 מ"ל.
6. כְּבָסִים
   1. סנן את ההשעיה על ידי עובר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מ"ל. שטפו את שפופרת 50 מ"ל הראשונית ואת מסננת עם 10 מ"ל של חיץ מכתים (PBS ^- עם 3% chelated FBS).
   2. סנן את ההשעיה על ידי העברהתא מסנן דרך 40 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מיליליטר. לשטוף את הצינור עם 5-10 מ"ל של חיץ מכתים על מנת להבטיח כי כל התאים הועברו אל צינור חדש. שמור את ההשעיה על הקרח עד שכל החיות עובדו.
   3. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. supernatant לשאוב בזהירות מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ מכתים.
   4. צנטריפוגה במשך 5 דקות XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים.
      הערה: הכרכים המפורטים לעיל מספיק תאים מכתימים נגזרים משני עכברים בוגרים.
7. השעיה העביר לתוך צינורות FACS שכותרתו קדם.
   1. עבור צינורות שולטים, לקחת 25-50 μl של השעית תא (או כל שמאל שיורית מן השעית התא) ולעשות עד בהיקף כולל של 300 μl עם חיץ מכתים.
      הערה: הכין צינורות מלאים (μl נפח הכולל 300) עבור בלא כתם (לא נוגדןואין DAPI); DAPI בלבד; Integrin β1; Integrin α6; SCA-1; CD34.
8. מוסיף את הנוגדנים הראשוניים DAPI (ראה טבלת חומרי דילולים מתאימים) בריכוזים הרצויים אל הצינור המתאים. בעדינות קפיצית את הצינורות כדי לערבב את השעית התא. חזור על קרח מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.
9. דגירה במשך 30 דקות על קרח בעדינות קפיץ הצינורות כל 10 דקות כדי להבטיח תאים נשמרים השעיה.
10. שטפו תאים על ידי מילוי כל צינור FACS עם חיץ מכתים (כ 4 מ"ל לכל צינור); צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים.
12. להעביר את השעית תא לתוך צינור FACS עם כובעים מסננים תא כדי להבטיח השעית תא בודדת.

4. ניתוח cytometry זרימה

1. המשך מיון תאים באמצעות מיד cytometer זרימה עם מסננים מתאימים עבור סיגנהאיתור l. השתמש 405 סגול ננומטר (למדידות DAPI), 488 ננומטר כחול (למדידות FSC, SSC, PE, PE-Cy7 ו FITC) ו 633 לייזרים אדומים ננומטר (עירור של APC)
   הערה: ודא כי מכשיר הקלטה מ גלאי עבור כל שלושת ערוצי הניאון.
2. שערי קרינה מוגדרת על סמך דגימות בלא כתם ופיצוי עבור חפיפה ספקטרלית באמצעות פקדים מוכתמים יחידים.
   הערה: השתמש בפקדים צבעוניים אחת להתאמת הפיצוי בין ערוצים על מנת לחסל כל חפיפת אותות הניאון. התאמת התגמול יהיה תלוי סדרן FACS בשימוש.
3. הגדרת שערים העיקרי מבוסס על DAPI להוציא תאים מתים.
4. התאם את עלילת הפיזור (SSC-A vs-A FSC) כדי לבחור לאירועי גופייה.
5. הגדרת FSC וגובה SSC ופרמטרים רוחב לחסל עבור כפילויות ולהפלות לאירועים גופיה.
6. תאי שער עם α6 גבוה והבעה β1 ומתוך אוכלוסייה זו תאי שער גם עם CD34 ביטוי גבוה או ביטוי גבוה Sca1.
7. תאים מיין לתוך צינור FACS מראש שכותרתו.
   הערה: שתי אוכלוסיות של תאים יכול להיות מבודד; α6 ⁺ / β1 ⁺ / CD34 ⁺ / SCA-1 ^- ו α6 ⁺ / β1 ⁺ / SCA-1 ⁺ / CD34 ^-. תאים ממוינים צריכים להישמר על קרח בכל העת עד שהם משמשים ביישומים במורד כגון תרבית תאים או בידוד RNA

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ההעשרה ובידוד של שני סוגים של אוכלוסיות:. בליטת SCS ו קרטינוציטים אפידרמיס איור 2 מדגימים את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. ניצול העור הוסר הגבי האחורי של עכברים בן 8 שבוע, אנו מועשרים גיל בליטה באמצעות סמן CD34, אשר באה לידי ביטוי רק HFSCs; ו SCA-1, אשר תוויות קרטינוציטים אפידרמיס. איור 3 מראה דפוסים שונים של CD34 ו SCA-1 ביטוי בתוך α6 ⁺ / β1 ⁺ אוכלוסיית תאי עור אפיתל. תאים היו מגודרים ראשונים על פי בעת-α6 integrin ו integrin-β1, אשר יועד P1 באיור 3. אוכלוסיית תאים עם חיובי עבור α6 / β1expression היה אז מגודרת לפי ביטויו של CD34 ו SCA-1 תאים. שתי אוכלוסיות נפרדות של תאים נראות CD34 לעומת עלילת SCA-1. β1 α6 + / ^{+ / CD34 + / SCA-1 - מייצג את HFSCs (יועד P2 באיור 3) ו α6 + / β1 + / SCA-1 + / CD34 - המייצג קרטינוציטים אפידרמיס (יועד P3 באיור 3). כ 150-500 x 10 3 תאים לכל חיה של α6 + β1 + בריכת הם CD34 + HFSCs.}

איור 2:. HFSC ובידוד keratinocyte בעור הגב הוסר מן העכברים. השומן היה לגרד את העור הודגר ב טריפסין. HFS היה לגרוטאות מן העור ואת השעיית הייתה מסוננת דרך 70 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר מסננות תא. התיוג הבא עם תאי נוגדני משטח מוין באמצעות cytometry הזרים ואת שתי אוכלוסיות של תאים נאספו מבוססות על ביטוי יחסי: CD34 ⁺ / SCA-1 ^- ו CD34 ^- / SCA-1 ^+. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: פרופיל של תאים ממוינים ניתוח FACS עורות הגבו בהערכת אחוז HFSCs מבודד מעכברים.. FACS מטוהרים α6 ⁺ β1 ⁺ תאים מוינו עבור CD34 ⁺ SCA-1 ^- (ורוד, α6 ⁺ β1 ⁺ CD34 ⁺ SCA-1 ^-; כחול, α6 ⁺ β1 ⁺ CD34 ^- SCA-1 ^+; כתום, α6 ⁺ β1 ⁺ CD34 ^- SCA-1 ^-). נתונים שמוצגים הם מארבעה עכברים משולבים מסודרים יחד. בעכברים סוג בר כ 4-6% של α6 ⁺ β1 ⁺ בריכה (P1 המיועד) הם CD34 ⁺ / SCA-1 ^-. HFSCs (P2) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מבוסס היטב לבידוד HFSCs מהעור הגבי של עכברים בוגרים אבל יכול להיות מיושם באופן שווה לבידוד של אוכלוסיות אחרות בתוך מבנה HF, בהתבסס על הבחירה של סמנים ^{2,16,23,28,29.} שיטה זו היא יתרון במיוחד על פני שיטות אחרות של בידוד תא, כגון דיסוציאציה רקמות, בכך סוג תא מסוים ניתן לבחור וקוצר מתערובת של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. יתר על כן, השיטה המתוארת כאן היא מהירה ואמינה וניתן להשתמש בו כדי לבודד עד ארבע אוכלוסיות שונות HFSC מבוססות על רמות ביטוי הפרש של הסמנים בשימוש. זה יכול לשמש להעשרה ובידוד של HFSCs לניתוח מולקולרי נוסף, כגון RNA-seq או ספקטרומטריית מסה אלא גם עבור תרבית תאים עוקבת והרחבה וב השתלת vivo.

הכין באיכות גבוהה, השעית תא בודדת הוא מרכיב חיוני של sucמצליח FACS ^29. יעילות של פרוטוקול זה גם תלוי בחומר החל לשמש לבידוד HF. על מנת למזער את כמות הרקמה הלא-אפידרמיס בטיפול חומר המוצא יש לנקוט בעת גילוח וכאשר לנתח את עור הגב. זה משפר את הטוהר ואת התשואה של תאי אפידרמיס. כדי להבטיח השעית תא בודדת אופטימלית, HFS יש לגרד בתוך ראש לכיוון זנב בכמויות קטנות בכל פעם להבטיח כי כל גושי השיער מחולק לחתיכות קטנות באמצעות אזמל וכי השעית HF יחידה מתקבלת . בנוסף, התאים צריכים להיות להישמר מהם בכל עת השעיות צריך להיות כל הזמן על הקרח כדי להבטיח כדאיות התא. לבסוף, טכניקות סטרילי הן קריטיות למזעור הסיכון לזיהום במיוחד אם תאים הם לשמש תרבית תאים.

בפרוטוקול המתואר כאן, בידוד של אוכלוסיות שונות של תאים מושג באמצעות סמנים פני תא ארבעה. אצעד חיוני עבור מיון תא מוצלח הוא ההגדרות ראשוניות המתאימות של FACS, הפיצויים המתאימים באמצעות פקדים מוכתמים יחיד וההיררכיה של פרמטרי gating. מיון תא מוצלח גם דורש חיסול של פסולת ביעילות להפלות אירועי גופייה מן הכפילויות / אגרגטים. Singlets נבדל כפילויות מבוססות על FSC ופרמטרי רוחב וגובה SSC. הפרמטרים עבור מיון התא צריך להיות מותאם בהתאם לסוג סדרן אלא גם המצומד fluorochrome בשימוש. הנה, קרינת PE נאספה באמצעות מסנן 585/42, FITC ו- PE-Cy7 הקרינה נאספו באמצעות 530/30 ו 780/60 מסנן, בהתאמה קרינת APC נאספה באמצעות מסנן 780/60.

מיון תא מתבצע בתחילה על ידי gating עבור תאים חיים המבוססים על ביטוי DAPI נמוך פיזור קדימה. אירועי גופייה בתחילה נבחרו על ידי התאמת שער פיזור כפילויות בוטלו על ידי gating singlets ונגדי קדימה ואחריו singlets פיזור. שני נוגדנים integrin, α6 ו β1 שמשו כדי לבחור עבור תאי אפידרמיס להבטיח והעשרה לכל גיל הבליטה. Blanpain et al., הראו נוכחות של שתי אוכלוסיות של HFSCs בליטה להביע גם רמות גבוהות או נמוכות של integrin α6 אבל חיובית CD34 ^2. כתוצאה מכך, תאי המבטאים הוא β1 ^גבוה / ^נמוך α6 β1 ^גבוה / ^גבוה α6 יש לבחור לפני gating עבור CD34. שתי אוכלוסיות מכן נבחרו על בסיס ביטוי סמן ספציפי להתנפח גיל, CD34, ועם סמן הבוחרת קרטינוציטים אפידרמיס, SCA-1 ^23. SCA-1 שיתוף לוקליזציה עם-α6 integrin ב מַשׁפֵּך ואת IFE אך אינה מתבטאת הבליטה HF. לעומת זאת, הבליטה HFSCs להביע CD34 ו integrin-α6 ^23, המאפשר בידוד ההפרש של שתי אוכלוסיות נפרדות; HFSCs ו קרטינוציטים אפידרמיס.

The authors have nothing to declare

This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.