דגם עור עכבר עוברי של תיקון פצע צלקות

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

פצעים בעור עוברי לרפא במהירות וscarlessly עד מאוחר בהריון ^1. תיקון פצע צלקות עוברי מתאפיין בהתחדשות של מבנה רקמה תקין ותפקוד. המעבר מצלקות לפנוטיפ הצטלקות מתרחש בשליש השלישי של הריון בבני אדם וסביב יום עוברי 18 (E18) בעכברים ^2,3. בהשוואה למבוגרים, תיקון פצע עוברי מתאפיין בepithelialization המהיר, בתצהיר רקמות חיבור, ונדידת פיברובלסטים.

מחקרים רבים הציעו הסברים אפשריים לתופעה של ריפוי פצע צלקות במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. דלקת היא מרכיב בסיסי של תיקון פצע מבוגר; עם זאת, פצעים עובריים מתאפיינים בחוסר דלקת חריפה ^4. בין אם זה היא תוצאה של חוסר בגרות הפעילות של המערכת החיסונית בשלבים עובריים עדיין לא ברורה. מחקר שנערך לאחרונה הציע כי הבדלים בשפע, המחצלתurity, ותפקוד של תאי פיטום בE15 לעומת עור עוברי E18 עשוי להיות אחראים למעבר מפנוטיפ צלקות, לפחות בעכבר ^3. מחקרים אחרים מניחים כי הבדלים בתכונות והשפע של מקרופאגים פצע העובריים והבוגרים אחראים ליצירה מחדש של מטריצה ​​הנורמלית תאית (ECM) במהלך תיקון פצע עוברי ^5.

הבדלים בגורמים סביבתיים במהלך התפתחות עוברית ובוגרת עשויים להשפיע גם על תיקון פצע. Longaker ועמיתיו הראו כי נוזל פצע מהעובר הוא בעל רמות גבוהות של פעילות גירוי-חומצה היאלורונית בהשוואה לאף אחד במבוגרי פצע נוזל ^6. כתוצאה מכך, רמות גבוהות יותר של חומצה היאלורונית, glycosaminoglycan שמקדם מייקרו-סביבה תורם לתנועתיות של תאים והתרבות, בסביבת הפצע העוברית יכולות להיות אחראית לפנוטיפ הצלקות ראה במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. קווים אחרים של נקודת ראיות לכך שפטהסביבת פצע l היא יחסית hypoxemic ושקוע בנוזל מי שפיר סטרילי עשיר בגורמי גדילה ^7. עם זאת, אין תשובה סופית כבר סיפקה לאירוע קריטי או גורם בעובר שמפעיל את המעבר מהתחדשות צלקות לתיקון fibrotic.

הבנת המנגנונים אחראים לריפוי צלקות בעובר מחייבת מודל מדויק ושחזור. כאן אנו פירוט מודל לשחזור של ריפוי צלקות עוברי פצע בdorsum של E16.5 (צלקות) ועוברי E18.5 עכבר (הצטלקות). בנוסף, שינויים קלים של מודל זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מספר מחקרים נוספים, כגון ניתוח ביטוי גנים מפצעים עובריים ^ו8,9 עור. בהתחשב בכך שהריונות בעיתוי המדויק הם קריטיים לסיכום מוצלח של מודל ריפוי זו עוברי צלקות פצעים, אנחנו גם פירוט הפרוטוקול שלנו להריונות superovulation מתוזמן.

הערה: כל ההליכים המתוארים במאמר זה מבוצעים על פי הנחיות שנקבעו על ידי סטנפורד המנהלי הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC).

1. מתוזמן הריונות - טכניקת Superovulation (איור 1)

הערה: תזמון מדויק גיל ההריון של עוברי עכבר לניתוח עוברי בE16.5 וE18.5 היא בעל חשיבות קריטית. בפירוט שסעיף זה הפרוטוקול שלנו לתזמון הריונות עכבר תוך שימוש בסרום בהריון סוסות (PMS) וזריקות גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) כדי לגרום לsuperovulation.

1. להזריק נקבות עכברים (<5 לכלוב) intraperitoneally (IP) עם 3.0-5.0 יחידות בינלאומיות (IU) של PMS בהיקף של 100 μl PBS 1:00-15:00 ליום 1.
2. בין שעתי 12:00 ו14:00 יום 3 (ארבעים וחמישה עד 47 שעות לאחר הזרקת PMS), להזריק נקבות עכברי IP עם 3.0-5.0 IU של HCG בהיקף של 100 μl PBS.
   הערה: גורמת הזרקת HCG ביוץ לאחר הזרקה כ 12 שעות.
3. מייד לאחר זריקות HCG, להזדווג עם נקבות גברים בגילים 8-16 שבועות.
   הערה: אנחנו בדרך כלל למקם את שתי נקבות לכלוב של זכרים בודדים.
4. נקבות נפרדות מזכרים בבוקרו של יום 4 (6:00-10:00) ושיא כE0.5 גיל העובר.
   הערה: ניתן לבדוק תקעי הנרתיק בזמן הזה; עם זאת, ההתבוננות בתוסף נרתיק אינה מבטיחה הריון ונקבות יכולות להיכנס להריון כאשר אין תקע הוא ציין. בהתחשב בכך שההריון הוא בדרך כלל נצפים על ידי בדיקה ו / או מישוש חזותי בE16.5 וE18.5 גילאי הריון, בדיקה לתקעי נרתיק בבוקרו של יום 4 הוא לא הכרחי. מניסיוננו, ובהתאם לזן, כ 30-50% מהנשים-בייץ סופר להריון תוך שימוש בטכניקה שתוארה כאן.

pg "/>
איור 1. סכמטי לטכניקת Superovulation. הליך מראה סכמטי להריונות superovulation מתוזמן בעכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. ניתוח Murine העוברי (הגבי פציעה) על E16.5 וE18.5 עוברים (איור 2)

1. לפני ההליך, לנקות את כל המשטחים של חדר הניתוח וציוד עם 70% אלכוהול איזופרופיל. בנוסף, לעקר את כל הציוד כירורגי ומכשירים שישמש בהליך על ידי המעוקר. מוסדות מסוימים עשויים לאפשר השימוש הבא של עיקור חרוז חם. לפעולה, להשתמש בחבילות סטרילי הכוללות גזה ומכשירי ניתוח.
2. לגרום הרדמה באמהות בהריון (E16.5 גיל העובר או E18.5) תחת 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב2 ליטר לדקה ואחריו הרדמה תחזוקה בL 1 לדקה.
3. להונותהרדמה ראויה משרד, להבטיח את הרפלקסים של הדוושה העמוקה של העכבר מדוכאים ומניח את העכבר בעמדה נוטה.
4. החל משחת עיני וטרינר כגון Puralube כדי למנוע גירוי בעיניים או יובש במהלך ההליך.
5. הכן בטן על ידי מתן יישום אור של קרם מקריח לא יותר מ -30 שניות (איור 2 א).
6. הכן בטן לניתוח ספטית עם povidone- יוד ואלכוהול (איור 2 ו2C).
7. בצע laparotomy קו האמצע מתחת למיקרוסקופ באמצעות מספריים מייקרו (איור 2 ד ו 2E).
8. בעדינות לחשוף רחם והעובר שנבחר לניתוח (איור 2F).
9. להשקות שדה ניתוח עם חם (38 מעלות צלזיוס) פוספט שנאגרו מלוח (PBS) באמצעות מחט בוטה, קצה
   הערה: אחת יכול להתבצע על ידי כיפוף קצה מחט גדול נשא בזהירות. (איור 2G ו2H).
10. מקם את העובר באופן שיאפשרזה גישה מלאה לdorsum.
11. לעבור תפר מחרוזת ארנק באמצעות תפר 7-0 ניילון דרך הרחם מעל האתר של פציעת גב המיועד (איור ט 2). מחרוזת עמדת ארנק מעל אזור של dorsum לשמאל או לימין של עמוד השדרה, ובאזור של קיר הרחם נטול כלי דם גדולים.
12. לעשות חתך 3 מ"מ דרך דופן רחם וצק מי שפיר במרכז מחרוזת הארנק (איור י 2).
13. להשקות אתר חתך עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
14. בעזרת מספריים מייקרו, חתך פצע בודד בעובי מלא excisional, 1 מ"מ בערך באורך, בdorsum של העובר.
15. בעדינות אתר חתך כתם יבש עם המוליך כותנה-טיפ.
16. להזריק תת עורי דיו 3 μl נפח הודו לאתר הפצע כדי לסמן את המיקום של פצע (איור 2K).
17. להשקות עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS כדי להבטיח דיו נשמר בתוך אתר פצע.
18. יש לי עוזר כירורגיתnject החם (38 מעלות צלזיוס) PBS באמצעות בוטה, קצה 10 מזרק G לצק מי השפיר כמחרוזת הארנק סגור (איור 2L). לחזור בו מזרק כמו סגירת מחרוזת ארנק מתקרבת להשלמה (איור 2M).
19. בעדינות לחזור רחם לתוך חלל הבטן (איור 2N).
20. עור אוורט והצפק.
21. האם עוזר כירורגית להשקות חלל בטן עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
22. בטן לסגור במהירות על ידי הידוק עור הצפק סגורה (איור 2 טו). הסגירה סטנדרטית מתבצעת בשתי שכבות; הצפק ושרירי בטן בשכבה אחת, רקמה התת עורית ועור בשכבה השנייה. להקרבה וקציר של העובר מיידיים, ההפגנה שלנו מראה סגירה בשכבה אחת.
23. מניחים את החיה תחת השגחה בחממה חמה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד שהחיה להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
24. אל מילכד בעלי החיים לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין מההליך.
25. על התעוררות מהרדמה ובמהלך שעות 48 לאחר מכן, לנהל הזרקה תת עורית של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) כל 12 שעות לשיכוך כאבים לפי צורך בהתבסס על הערכת כאב. לנהל carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקה תת עורית להקלה על כאב לאחר ניתוח נוסף לפי צורך.
26. חזור בעלי חיים לכלוב ולספק להם כרצונך מזון ומים.
27. לפקח על גילויי כאב מקרוב.
28. לאחר ניתוח 48 שעות, להקריב את אמא בהריון עם מנת יתר של isoflurane והעובר קציר נפצע. כדי לעשות זאת, להתאים ריכוז isoflurane עד 5% ומעלה, ולשמור על חשיפת דקות 1 לאחר הפסקת הנשימה. לאשר המתת חסד עם נקע בצוואר הרחם. קציר עובר unwounded לביקורת שווה גיל. עוברים המאוחר צריכים שיטה נפרדת של המתת חסד בקנה אחד עם המלצות IACUC, כגון deהקפיטציה, נקע בצוואר הרחם, או הזרקה כימית.

איור 2. סכמטי לכירורגיה Murine עוברי. צעדים כלליים לגב פצעו בE16.5 ועוברי עכברי E18.5. () אפילציה של בטן עכבר. (B ו- C) הכנה של בטן עכבר. (ד) מיקרוסקופ ניתוחי המשמשת ל חתך יצירת הליך. (E) קו האמצע laparotomy. (F) חשיפה של רחם. בריאה (G) של מחט קהה קצה. (H) השקיה של רחם עם מי מלח חמים. (I) של תפר מחרוזת ארנק. (J) דרך רחם מ"מ קיר ודור 1 פצע מלא עובי excisional. (K) הזרקה תת עורית של דיו הודו. (L ו- M) סגירת תפר מחרוזת ארנק. (N ו- O)סגירת הבטן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לניתוח היסטולוגית, פצעי cutaneous בעור הגב של עוברי עכברי E16.5 וE18.5 צריכים להיות שנקטפו לאחר פציעה-48 שעות, קבוע PFA 4%, ו- מוטבע פרפין. במודלים מהונדסים ניאון, הקפאה עם אוקטובר עשויה להיות מתאימה. יש כמה כתמים שעשויים לשמש כדי לחזות מבנה רקמת חיבור סלולארי ו. Hematoxylin ו eosin הוא כתם בשני צבעים שמכתים גרעינים כחולים ומבני eosinophilic (כלומר., ציטופלסמה וקולגן תאי) בגוונים שונים של וכתום אדום, ורוד,. Trichrome של מאלורי הוא כתם שלושה צבעים בהיקף של אנילין כחול, fuschin חומצה וכתום G, מתאים ביותר להבחנה תאים מרקמות חיבור.

איור 3. היסטולוגיה מפצעי צלקות E16.5 העוברי. () Hematoxylin וכתם eosin מחדשveals reepithelialization מלא ועלייה מתונה במספר התאים דלקתיים הנוכחיים (חיצים). (100x; בר = 100 מיקרומטר) כתם (B) Eosin תערוכות דיו הודו (ראשי חץ) סביב זקיקי שיער התחדשות (חץ) (400x; בר = 25 . מיקרומטר) (כתם Trichrome C) של מאלורי מגלה דפוס משובח רשתי קולגן עורי עם הנוכחות של זקיק שיער (400x; בר = 25 מיקרומטר). הודפס מחדש באישור מet al המחקר קולוול. ¹⁰ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אם פצעי excisional גב הם בגודל המתאים (1 מ"מ) והעומק (עובי מלא), מכתים hematoxylin ו eosin יגלה שמרפא עור E16.5 עם צלקות מינימליות, reepithelialization מלא, ועלייה קטנה בלבד במספר דלקתי תאים (איור 3 א). יתר על כן, woun אלהds צריך לרפא עם ארכיטקטורת עור כ נורמלית ומכיל התחדשות זקיקי שיער באתר של פציעה (חיצים; איור 3). יישום נכון של דיו הודו לפצע הטרי שנוצר צריך לגרום לתצהיר דיו באתר של פציעה (ראשי חץ; איור 3). לבסוף, Trichrome מכתים צריך לחשוף מאפיין דפוס קולגן קנס עורי רשתי של הדרמיס ללא צלקות (איור 3 ג).

איור 4. היסטולוגיה מפצעי הצטלקות E18.5 העוברי. Hematoxylin () וכתם eosin מגלים עלייה בצביעת eosin בדרמיס באתר של פציעה (חיצים). (200x; בר = 50 מיקרומטר) (ב) כתם Trichrome של מאלורי תערוכות קולגן הצפוף עורי (חיצים) (400x; בר = 25 מיקרומטר). הודפס מחדש באישור מאל המחקר קולוול et.¹⁰

בהשוואה לפצעים שנעשו בE16.5, hematoxylin והכתים eosin מפצעי גב שנעשה בE18.5 וקצרו 48 לאחר פציעה-hr צריך לחשוף צלקת צפופה עם הפסד של אדריכלות עור רגילה באתר של פציעה (איור 4 א). באופן דומה, Trichrome צביעה מגלה דפוס צפוף של תצהיר קולגן לא מאורגן (חיצים; איור 4). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הפרוטוקול כירורגית המוצג כאן מתאר מודל excisional של ריפוי צלקות עכבריות העוברי שפורסם לראשונה בשנת 2006 על ידי המעבדה שלנו ^10. בנוסף למודלים מבוססים אחרים של פציעת excisional ^11, מודלים incisional של ריפוי צלקות עכברי עוברי קיימים גם ^12,13. חקירות של ריפוי פצע צלקות עוברי בקוף, הכבש, ארנב, האופוסום, והעכברוש דווחו ^14-17. עם זאת, עכברים מייצגים מודל אידיאלי לחקר ריפוי פצע צלקות עוברי בשל עלותם הנמוכה יחסית ל- דיאם כלוב והגנום מאופיין היטב. יתר על כן, הפסד / רווח גנטי של זמן ומרחב של פונקציה יכול להיות מושגים במהלך התפתחות עוברית באמצעות הזדמנויות הנפקת מערכות מהונדסים עכבריות לפענח בדיוק את מנגנוני תיקון צלקות.

למרות יתרונות אלה, עכברים להציג אתגרים טכניים מסוימים במהלך ניתוח עוברי בשל גודלם הקטן. בהתחשב בלחץ של הרדמה על אמא בהריון, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לפקח על רמת isoflurane / חמצן להיות מנוהל. תערובת של 2.5% isoflurane / חמצן ב2 ליטר לדקה ואחריו הרדמה תחזוקה בL 1 לדקה צריכה להיות דבקה בזהירות ל. סטיות או תנודות בגורם קריטי זה יכול להשפיע באופן משמעותי לתחלואה. מיקום נכון של תפר מחרוזת הארנק מייצג את ההיבט ביותר מבחינה טכנית המאתגר של הניתוח. כישלון למקום התפר הזה בצורה נכונה יגרום לדליפה של מי שפיר ולאחר סגירת PBS. נפח מספק של נוזל ברחם יגרום לטראומה לעוברים ועלול לגרום להתכווצות רחם מוקדמת. מסיבה זו, החלפת הנוזל מי שפיר איבד עם פתיחה של הרחם היא גם שלב קריטי במודל זה כירורגית. יש להקפיד להוציא הרף PBS החם כמו מחרוזת הארנק סגורה. גורמים אלה נדרשים לפתרון בעיות משמעותיות ואנו מדגישים את תשומת לב שלפרטים אלהיגדיל את הסבירות לניתוח מוצלח. עם זאת, גם לאלה עם ידיים כירורגית מנוסים צריכים לתכנן לשיעור תחלואה של כ -40% בעוברים E16.5.

הבנת ריפוי פצע צלקות עוברית מחזיקה ערך עבור רפואת translational במטרה אפנון in vivo של התנהגות fibrogenic בשלבים בוגרים בפיתוח. בהשוואה לעור מבוגר, יש לו עור של העובר הדרמיס פיתוח, כוח מופחת מתיחה, זקיקי שיער המתהווים, ורכיבי ECM שונים ^2,4. יש עור עוברי יחס גבוה של קולגן סוג III להקליד אני בהשוואה לעור מבוגר, תאי פיטום פחות ופחות בוגרים, ביטוי של Keratins 8 ו -19, ורמות גבוהות יותר של חומצה היאלורונית בהשוואה ^ל4,9 עור בוגרים. על ידי פענוח מנגנוני ריפוי צלקות בעובר, אנו יכולים להתחיל לנווט את המסלולים המולקולריים ותאיים האחראים לסיסטיק במבוגרים כלפי פנוטיפ משובי. O ההופעהשושלת f התחקות וכלים גנטיים אחרים בעכבר פתחו אפיקים חדשים ומבטיחים לחקירה של ריפוי צלקות עוברי פצע. בהתחשב בשיעורים הגבוהים מיסודו של תחלואה והתכווצות רחם מוקדמת הקשורים לניתוח עוברי, חקירות של עור צלקות עוברי ריפוי פצע in vivo דורש מודל כירורגית מדויק ודיר. כאן אנו פירוט מודל לשחזור של ריפוי צלקות עוברי פצע בdorsum של E16.5 (צלקות) ועוברי E18.5 עכבר (הצטלקות).

The authors have nothing to disclose.

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מNIH מענק R01 GM087609 (לHPL), מתנות מאינגריד Lai וביל שו לכבוד אנתוני שו (לHPL), HL099776 U01 מענק NIH (לMTL), המעבדה Hagey ל ילדים רפואת רגנרטיבית וקרן האלון (לMTL וHPL). GGW נתמכה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, תכנית הכשרת המדען הרפואי סטנפורד, וGM07365 מענק הכשרת NIGMS. MSH נתמכה על ידי CIRM קליני עמית הדרכת גרנט TG2-01159. WXH נתמכה על ידי מימון מסארנוף הלב וכלי דם הקרן.