איתור ליקויים בChoroidal כלי דם במודל של עכברים של ניוון מקולרי הקשור בגיל בזמן הקורס Indocyanine הירוק אנגיוגרפיה

Indocyanine הירוק אנגיוגרפיה (או ICGA) המבוצעת על ידי הזרקה לוריד זנב מספקת תמונות כמובן זמן ICGA באיכות גבוהה כדי לאפיין חריגות בדמו עין עכבר.

Indocyanine הירוק אנגיוגרפיה (או ICGA) היא טכניקה המבוצעת על ידי רופאי עיניים לאבחון מומים בכלי הדם של רשתית וכורוידאלית של מחלות עיניים שונות, כגון ניוון הקשורה לגיל (AMD). ICGA שימושי במיוחד לתמונת כלי הדם כורוידאלית האחוריים של העין בשל יכולתה לחדור דרך שכבת פיגמנט עם ספקטרום האינפרה אדום שלה. כמובן זמן ICGA ניתן לחלק לתחילה, אמצע ושלבים מאוחרים. שלושה השלבים לספק מידע רב ערך על הפתולוגיה של בעיות עיניים. למרות ICGA זמן כמובן על ידי תוך ורידי (IV) הזרקה היא בשימוש נרחב במרפאת לאבחון והניהול של בעיות דמית העין, ICGA ידי זריקת intraperitoneal (IP) הוא נפוץ במחקר בבעלי חיים. כאן אנו מדגימים את הטכניקה כדי להשיג תמונות ICGA זמן כמובן ברזולוציה גבוהה בעכברים על ידי הזרקה לוריד זנב וophthalmoscopy סריקת לייזר confocal. אנחנו השתמשנו בטכניקה זו לתמונה כורוידאלית leהוא קונה במודל של עכברים של ניוון מקולרי הקשור לגיל. למרות שזה הרבה יותר קל להציג את ICG לכלי דם העכבר על ידי ה-IP, הנתונים שלנו מצביעים על כך שקשה להשיג תמונות כמובן הזמן לשעתק ICGA ידי ה-IP-ICGA. לעומת זאת, ICGA באמצעות הזרקה לוריד זנב מספק תמונות באיכות גבוהה ICGA זמן קורס דומות למחקרים בבני אדם. בנוסף, הראינו כי ICGA שבוצע על עכברי בקן נותן תמונות ברורות יותר של כלי כורוידאלית מזה שבוצע על עכברי פיגמנט. אנו מציעים כי IV-ICGA זמן כמובן צריך להיות מקובל במחקר AMD מבוסס על מודלים של בעלי חיים.

אנגיוגרפיה הירוקה Indocyanine (ICGA) היא בדיקת אבחון לבעיות של תמונה הקשורים לכלי דם בעין. ספקטרום הספיגה של ICG נע 790-805 ננומטר בעוד ספקטרום הפליטה נע 770-880 ננומטר עם פליטת השיא ב835 ¹ ננומטר. זה שונה מהצבע האחר הפופולרי, והעמסת נתרן, קשת שנופל בטווח הנראה לעין. ספקטרום האינפרה אדום מאפשר ICG לחדור דרך אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE), נוזל serosanguineous, ולפליטות שומנים בדם, כל מה שיכול בקלות לחסום את ההדמיה על ידי צנתור והעמסת המבוסס נתרן והעמסת (FA). ICG הוא בכלי הדם וכתוצאה מכך פחות extravasation מאוגד חלבון 98%, המאפשר הדמיה משופרת של כלי כורוידאלית ונגעים כורוידאלית ^1,2. ICGA היא כמעט הברירה היחידה כדי לחזות בכלי דם כורוידאלית, שהוא אחורי לרשתית. איור 1 מציג ההשוואה של ICGA וFA בכלי דם הדמיה בעיני עכבר. FA יכול bדואר משמש לתמונה גם ברשתית כלי דם, אך לא בכלי הדם כורוידאלית. לעומת זאת, ICGA יכול לשמש לתמונת שני רשתית וכלי דם כורוידאלית. ICGA מתבצע עם מערכות ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית או אומטלמוסקופ לייזר סריקה (SLO) יחד עם מצלמות וידאו אינפרא אדום רגישות, שאנו נשתמש במחקר זה.

במרפאת, ICGA כבר המליץ ​​באבחון מספר הפרעות chorioretinal מעורב כלי הדם כורוידאלית כולל polypoidal Choroidal vasculopathy (PCV), רשתית Angiomatous למניעת הפצת נשק (RAP), פסי angioid, ניוון מקולרי vitelliform, chorioretinopathy הצפק המרכזי, כלי דם כורוידאלית, רשתית דימום macroaneurysms arteriolar, גידולים כורוידאלית, וצורות מסוימות של אובאיטיס אחורי ^1,3. השילוב של ICGA עם FA והאופטי קוהרנטיות טומוגרפיה (אוקטובר) מספק כלים רבי עוצמה לרופאים באבחון והניהול של קולרים הקשור לגיל exudativeקולרים (AMD) ^4-10. ICGA שימושי במיוחד לאבחון מצבים מעורבים דמית העין. למעשה, ICGA נחשב את תקן הזהב לאבחון PCV, וריאנט של יפליט AMD ^11-13. PCV מאופיין על ידי רשת של הסתעפות כלי עם dilations polypoidal מסוף בכלי הדם כורוידאלית ^11-13. PCV קשור לעתים קרובות עם פלוגות serosanguineous חוזרות ונשנות של הרשתית ורשתית עם דליפה ודימום מרכיבי polypoidal ^11,14,15. לאחרונה דיווחו הדור של מודל החיה PCV תחילה על ידי transgenically להביע HTRA1 האנושי, פרוטאז סרין רב תפקודי, באפיתל הפיגמנט ברשתית עכבר (הרשתית) ^16. הראינו כי HTRA1 המוגבר מושרה תכונות אופייניות של PCV, למשל נגעי polypoidal.

כאן אנו מדגימים את השימוש בICGA זמן כמובן על ידי הזרקה לוריד זנב במחקר AMD שימוש במודל עכבר HTRA1 שלנו. הנתונים שלנו מראים כיIV-ICGA עדיף על ה-IP (או תת עורית (SC))-ICGA שכרגע נמצאים בשימוש בתחום ^17,18 לאפיון נגעים בדמה העין.

הצהרה על מחקר בבעלי חיים

ניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים המוסדי ועדת שימוש (IACUC), ובוצעו בהתאם להצהרת ארוו לשימוש בבעלים חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר.

1. הכנת מכשירים

1. ההליך מבוצע בהליך חדר במתקן בעלי חיים.
2. לובש מסכות, כובעי שיער, שמלות כירורגית, רגל כיסויים סטריליים, וכפפות לפני תחילת הניסוי.
3. מחממים מים בכוס ל~ 40 ° C על פלטה חמה.
4. הנח כרית כחולה סטרילי על גבי כרית חימום שישמש מאוחר יותר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך הדמיה. הפעל את כרית החימום.
5. הכן את מערכת ההדמיה:
   1. הסר את מכסה האבק ולהפעיל את הלייזר.
   2. להוציא את עדשת 55 ° ולהעלות אותו על גבי המכונה.
   3. פתח את תוכנת הדמיה מהמחשב וקלט את המידע של העכבר להדמיה מתחת לסדין של חולה חדש (למשל גנוטיפ, גיל, וכו '.). תחת "סוג ההתקן", בחר מצב אינפרא אדום (IR).

הערה: זה כבר דווח כי o השימושf עדשה אספריים כפולה חיצונית יכולה לשפר את איכות תמונת ^17-20 אם כי אין לנו בעיה בקבלת תמונות באיכות גבוהה על ידי IV-ICGA ללא שימוש בעדשות חיצוניות (ראה תוצאות נציג, איורים 1-4).

2. הזרקה לוריד זנב של ICGA

1. להתרחב עיני עכבר עם 1% פתרון עיני Tropicamide ולהמתין 5 דקות.
2. לשקול את העכבר כדי לקבוע את הסכום של הרדמה (65-100/10-20/1-3 מ"ג / קילוגרם קטמין / Xylazine / acepromazine) לפי צורך.
3. אחזר מזרק 1 מ"ל סטרילי יחד עם מחט G 32. הזרק את העכבר intraperitoneally עם ההרדמה (13 מ"ג / מיליליטר קטמין, 2.6 מ"ג / מיליליטר Xylazine, 0.3 מ"ג / מיליליטר acepromazine בסטרילי PBS). חכה עד שהעכבר הוא בהרדמה מלאה (~ 5 דקות).
4. מניחים את זנב העכבר ל40 מים חמים C ° לגרום vasodilatation של הווריד.
5. אחזר מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 32. למשוך את הסכום הרצוי של ICG, בדרך כלל 50 μl של מ"ג / מיליליטר ICG 1, שהוא סטרילי מסונן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי, לעכבר 25 g (2 מ"ג / קילוגרם). היזהר שלא להציג את כל אוויר לתוך המזרק.
6. נגב את הזנב עם ספוגית אלכוהול כדי לחטא את האזור להיות מוזרקים.
7. החזק את הזנב ביד אחת, כך שוריד הזנב לרוחב הוא כלפי מעלה. עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה, להזריק את המחט ~ 2 מ"מ לתוך הווריד בזווית מינימאלית. היזהר שלא לחורר את הווריד. צייר את הבוכנה מעט ולחפש עקבות של זרימת דם לרכזת המחט, אשר מצביעה על כך שהמחט הוכנסה בהצלחה לווריד.
8. לאט לאט להזריק ICG לווריד. לא צריך להיות התנגדות מינימאלית כאשר הזרקה. הסר את המחט ולהחיל ספוגית אלכוהול ישירות לאתר הזרקה ל~ 5-10 שניות כדי לעצור את דימום. העכבר הוא אז מוכן הדמיה. על מנת לתפוס את השלב המוקדם (0-4 דקות לאחר הזרקה), זה הוא essential לתמונה את העכבר במהירות.

הערה: עיני עכבר יכולות לקבל בקלות יבשה ויכולות לפתח קטרקט תחת הרדמה. זה חשוב לשמור על העיניים לחות על ידי יישום סטרילי PBS במהלך ההליך. נגב את PBS העודף עם מקלון צמר גפן סטרילי לפני הקלטת ICGA. מעבדות אחרות השתמשו בעדשות מגע כדי למנוע התייבשות של ^17-20 הקרנית.

3. אנגיוגרפיה ICG

1. להתחיל לקחת תמונות 30-40 שניות לאחר הזרקת ICG, המאפשרת לכידתו של השלב המוקדם של מילוי כורוידאלית עד תפוצה רשתית וכורוידאלית נמצאות בבהירות מקסימלית (0-4 דק '). כלי הדם ברשתית הוא מדמיין הטוב ביותר במוקד ~ 35-45 דיופטריות וכלי דם כורוידאלית היא דמיינו ב10-15 דיופטריות.
   
   הערה: במהלך הבדיקה הראשונה של מודל חיה, מומלץ ללכוד תמונות מכל הזוויות (האף, זמני, הגב וגחון) לזהות את כל abno האפשריrmalities בכלי הדם. במהלך השלב המוקדם, שני עורקים כורוידאלית בינוניים וגדולים וורידים הם דמיינו היטב. במודל של בעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה, נגעים כורוידאלית (למשל polypoidal dilations) עשויים להתחיל להופיע 1 דקות לתוך השלב מוקדם.
2. הגדר את מיקוד תמונה על כלי הדם. שליטה על בהירות ולהתמקד באמצעות מודול הבקרה וידית פוקוס, בהתאמה. ערכים אלה הם מתכווננת דיגיטלית ונשמרים בקלות קבועה. שמור על המרחק מהעין העכבר כדי קבוע עדשת מצלמה כדי להבטיח איכות תמונה היא שחזור תוך שימוש בטכניקה הבאה.
   
   הערה: מאחר והמכשיר יכול רק תמונה חלק של העין האחורית, אנחנו מנסים לשמור את הפוקוס, בהירות, ואת המרחק בין עדשת המצלמה ואת העין העכבר קבועה כפי שתמונת העין כולה האחורית מזוויות שונות. המפתח לכך הוא כדי ליישר את הארה בצורת העיגול הנפלטת על ידי ICG דרך עין עם השדה של view של המצלמה. המטרה זו מושגת על ידי הפיכת משמאל לימין, התאמות למעלה ולמטה, וב- and-out של מיקום המצלמה עד שיש את התמונה כולה אין אזורים כהים. כאשר הארה ואת שדה הראיה של המצלמה הן בשורה, המרחק מהעין לעדשה יהיה לשעתק לסדרה הבאה של תמונות, כמו גם במרחק אופטימלי להדמיה באיכות.
3. ברגע שכלי הדם הוא בפוקוס, ללכוד את מסגרות תמונה על ידי לחיצה על הכפתור השחור העגול במודול הרכישה. גם הכפתור העגול השחור יכול לשמש כדי להפחית או לשפר את האות של ICG לאיכות תמונה הטובה ביותר.
4. לקבוע את הזווית האופטימלית תצוגה ועומק התמקדות לנגעים כורוידאלית תמונה. זה חשוב כדי לשמור על העמדה של העין, עומק ההתמקדות, והגדרות מכשיר אחרות שנקבעו לICGA זמן כמובן כולו. התמונות נשמרות על ידי לחיצה על לחצן לרכוש בפנל מסך מגע של מודול הרכישה.
5. לרכוש תמונות בשלב ביניים ב6-15 ירכתי דקותהזרקה אה.
   
   הערה: שני כורוידאלית וכלי רשתית נעשים פחות ברורים. כלי דם Choroidal מופיע הקרינה מפוזרת כ. נגעי Choroidal מציגים hyperfluorescence לצוץ בניגוד לדהייה סביב הקרינה רקע נורמלית.
6. לרכוש תמונות בשלב מאוחר ב17-25 דקות לאחר הזרקה.
   
   הערה: Hyperfluorescence נמוג. שני כלי כורוידאלית ורשתית הם כבר לא נראים לעין. ראש עצב הראייה הופך לשחור. יש נגעים כורוידאלית Hyperfluorescent ניגוד מקסימאלי עם רקע הדהיה.
7. לאחר שסיים את הרכישה של תמונות, להחיל ג'ל עיני סיכה ברור לעיני עכבר ולעזוב את העכבר על כרית חימום להתאוששות.
8. להחזיר עכברים לכלובים והאזור מחזיק. יצוא תמונות כקובצי TIFF או JPEG לניתוח נוסף.

הערה: התזמון של כל שלב אינו מוחלט. מצאנו כי העיתוי של eaשלב ch עשוי להשתנות בהתאם לכמות של ICG המוזרק. יותר ICG נוטה להאריך כל שלב. הדרך הטובה ביותר להגדיר את השלב היא על פי התכונות העיקריות של כל שלב המפורט לעיל.

ביצענו כמובן זמן ICGA בעכברים הטרנסגניים HTRA1 והמלטת WT שליטה, אשר שניהם על רקע CD1. רקע CD1 בקן נבחר כדי להקל על אנגיוגרפיה הירוקה indocyanine הדמיה (ICGA) (ראה דיון). חלק מהפרצה כמו dilations החלה להופיע בשלב מוקדם בעכבר HTRA1 (איור 2, חץ אדום מציין את התרחבות בקצה של כלי ועיגול אדום מציין נגע polypoidal סוג אשכול). כלי Choroidal נראה בבירור בשני עכברי HTRA1 WT ובמהלך זה מוקדם מילוי בשלב של צבע ICG. בשלב ביניים, נגעי hyperfluorescent בשלב המוקדם הפכו ברורים יותר ויותר נגעים החלו להופיע בעוד כלי כורוידאלית התחילו לדעוך בעכבר HTRA1 (עיגולים צהובים מציינים את המראה של יותר נגעים). בשלב מאוחר, נגעים כורוידאלית של עכבר HTRA1 הפכו ליותר "ברורים" כמו כל כלי נמוגו לתוך הרקע. עצב הראייה הראש היה חשוך בשני עכברי HTRA1 (חיצים ירוקים) WT ו. התכונות העיקריות של שלושה השלבים דומות למהלך זמן ICGA בחולי AMD אדם (שלב מוקדם, 0-3 דקות, שלב ביניים, 5-15 דקות, שלב מאוחר, 18-22 דק ') ^1.

איור 1. השוואה של ה-FA וICGA ברשתית עכבר הדמיה וכלי דם כורוידאלית. עכברי WT CD1 היו הדמיה ידי IV-FA וIV-ICGA באמצעות מערכת הדמיה שיטה רב. ניתן לראות כלי רשתית בשני FA וICGA. ניתן לראות כלי Choroidal רק בICGA. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

/ "= Src" / files/ftp_upload/51061/51061fig2.jpg 51061fig2highres.jpg "/>
איור 2. כמובן זמן ICGA של עכברים הטרנסגניים HTRA1 בזריקה הרביעית. שליטת WT ועכבר מהונדס HTRA1 היו הדמיה ידי ICGA (עם הזרקה לוריד זנב). חץ אדום מצביע על התרחבות בקצה של כלי (פוליפ הבודד) ועיגול אדום מציין נגע polypoidal סוג מצרר, שהופיע ב שלב מוקדם. צהובים עיגולים מציינים כמה נגעים שהופיעו בשלב ביניים. חיצים ירוקים מצביעים על ראש עצב הראייה הכהה בשני עכברי HTRA1 WT ו. שים לב שנגעי polypoidal מופיעים בשלב המוקדם של ICGA ולהיות יותר ברור בשלב האמצעי כמו במחקרים בבני אדם ^21-24. נגעי נקודה דיסקרטיות מופיעים בשלב ביניים ולהיות ברורים בשלבים המאוחרים (למשל העיגול הצהוב הגדול ביותר המצביע על שלושה נגעי נקודה). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. כמובן זמן ICGA של עכברים הטרנסגניים HTRA1 ידי הזרקת ה-IP. עכברים הטרנסגניים HTRA1 היו הדמיה 5, 12, ו20 דקות לאחר הזרקת ה-IP של ICG. התמונות של שתי שורות בלוח נלקחו משני עכברים הטרנסגניים HTRA1 שונים. שים לב שכלי הדם כורוידאלית הוא בעיקר בלתי נראה אפילו 5 דקות לאחר ההזרקה (12 דקות לעכבר בלוחות הנמוכים). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. כמובן זמן ICGA של פיגמנטאד (C57BL6) ועכבר לבקן (CD1) על ידי הזרקת IV. שימו לב להיבדל בבהירות של כלי דם כורוידאלית בין פיגמנט והעכברים לבקנים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

במחקר זה, שהדגמנו את השימוש בICGA לנגעים כורוידאלית תמונה בעכברים הטרנסגניים HTRA1. המאפיינים של תחילת, האמצע ושלבים מאוחרים של ICGA במודל של העכברים שלנו להתאים את מהלך הזמן גם במחקרים בבני אדם ^1. זה חשוב לעשות השוואות טובות יותר בין פנוטיפים פתולוגיה וחיה אנושיים, אשר לא יסולא בפז למחקר על מנגנוני pathophysiological ואסטרטגיות טיפול בבעיות הקשורות לדמה עין, כגון AMD.

אנו בוצעו לראשונה ICGA בעכברים על ידי הזרקת ה-IP ומצאנו כי במהלך הזמן היה משתנים מאוד מעכבר לעכבר, כנראה בשל הקליטה משתנה של צבע ICG מהגוף החלל בבטן (איור 3). זה עושה את זה קשה להשוות עם מחקרים בבני אדם שבוצעו על ידי הזרקת IV. בנוסף, תכונות אנגיוגרפיה של שלבים שונים של IV-ICGA הן מאוד שימושיות לאפיון סוגים שונים של נגעים כורוידאלית בבעלי חיים דגמים. רוב האנשים בוחרים להימנע מהזרקת IV (למשל בFA) לעכברים בשל האתגר הטכני של ביצוע הזרקה לוריד זנב (ורידי זנב עכבר הם זעירים). עם זאת, המאמץ הוא בילה גם בהתחשב באופי השחזור של טכניקה זו ואת כמות המידע שהושגה. ברגע שאנו שולטים בטכניקה של הזרקה לוריד זנב, הצעדים האחרים הם די דומים ל-IP-ICGA. כדאי להזכיר כי יש לקבל את כל מה שהכין מראש (למשל מערכת ההדמיה) על מנת ללכוד את השלב קצר מאוד מוקדם (0-4 דק '). אנחנו לעומת IP-ICGA לעומת IV-ICGA ללימוד עכברים מהונדסים HTRA1 שונים. אנחנו עשינו ~ 100 עכברים לכל שיטה. המסקנה היא שIV-ICGA עדיף על ה-IP-ICGA לאפיון נגעים בדמה העין. בזמן הקורס IV-ICGA הפך להיות המנהג הרגיל שלנו כדי לבחון מודלים העכבר של AMD. מאותה הסיבה, אנו מציעים שחוקרים צריכים לשקול ביצוע IV-FA למחקר בבעלי חיים.

למרות אנגלי הוא שימוש נרחב יותר במודלים של בעלי החיים של AMD, ICGA חיוני באיתור מומים בכלי הדם של כורוידאלית. היכולת להתבונן בכלי דם כורוידאלית עכבר ברזולוציה גבוהה בזמן אמת יכולה מאוד לעזור לחוקרים באפיון מודלים עכבר AMD ובמקשר עם נתונים histopathological. השילוב של ICGA, FA ואוקטובר יהיה שימושי מאוד באפיון הפנוטיפ של דגמי AMD כמו באבחון של AMD בחולים אנושיים. מאז העכבר הוא כיום מודל החיה הנפוצה ביותר למחקר AMD ^26-29, בזמן הקורס IV-ICGA יכול לשחק תפקיד רחב יותר בקהילת המחקר.

פותחי עתיד הוא ממציא של שני פטנטים בהמתנה שהם רלוונטיים למודל עכבר AMD משמש בעבודה זו. SK, ZB, ומתכוונן אין לי מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R01EY022901, פיתוח פרס קריירה ממחקר למניעת עיוורון (RPB), קרן CMReeves & MA ריבס, א 'מטילדה זיגלר קרן לעיוור, אבירי טמפלרים עיניים קרן, ומענק בלתי מוגבל למחלקה רפואת עיניים באוניברסיטת יוטה מRPB. אנו מודים Balamurali Ambati לקבלת סיוע טכני בשיטה רב מערכת Spectralis ההדמיה וטאו ז'אנג לדיונים והערות על כתב היד.