Method Article
כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.
הקרנה אקראית מטריצת microseed (rMMS) היא טכניקת התגבשות חלבון שבו גבישי זרע מתווספים למסכים אקראיים. על ידי הגדלת הסבירות כי גבישים יגדלו באזור metastable של דיאגראמת הפאזות של חלבון, מוביל התגבשות נוסף לעתים קרובות מתקבל, את האיכות של גבישים המיוצרים עשויה להיות מוגברת, ואספקה טובה של גבישים לניסויי איסוף נתונים ושרייה מסופקת. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS שניתן להחיל גם ניסויים יושבים טיפה או תליית אדי ירידת דיפוזיה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב96 היטב או בתבנית מגש 24 גם.
מהיישום לראשונה שלה על ידי פרוץ, Kendrew ועמיתים לעבודה בקביעת המבנים של המוגלובין ומיוגלובין, לצינורות אוטומטיים המודרניים תפוקה גבוהה של קונסורציומים גנומיקה המבניים, קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן macromolecular העניקה לנו הצצה מבנית חסרת תקדים אל עולם החלבון . טכניקה זו עדיין השיטה הניסיונית ביותר ישימה נרחב המאפשרת הדמיה הישירה של מבנה חלבון באטומי, או בסמוך לרזולוציה אטומית (כלומר בטווח Å 1-3). תנאי מוקדם לרנטגן עקיפה שיחול על חלבון הוא שזה חייב להיות ראשון התגבש, וזה בשלב זה של התהליך שנשאר צעד אחד הגדול שער הגבלה בקביעת מבנה בשיטות עקיפה 1, 2. למרות התקדמות משמעותית בהבנתנו את התהליך של התגבשות חלבון, ושיפורים משמעותיים באיכות והזמינות של מסכים התגבשות,מגשים, וטכנולוגיות קשורות, הוא נשאר בלתי אפשרי לחזות את הסבירות של התגבשות הצלחה 3 באופן מהימן. ניתן ליישם שיטות ביוכימיות וbiophysical להעריך אם חלבון של מציג עניין מאפיינים נוחים להתגרענות גביש וצמיחה, כלומר הוא זה מקופל היטב, הומוגנית, monodisperse, וכו ', לעומת זאת, תובנות אלו בשום אופן לא מספקות מנבא סופי של גיבוש נטייה.
זריעה כבר התיימרה ארוכה להיות שיטה מעשית לשיפור במספר, הגודל והאיכות של גבישים קיימים או חומר גבישי 4-7. גישה זו מבוססת על ההנחה שתנאים שתומכים בהתגרענות גביש לא יכולים להיות אופטימליים לגידול גבישים שלאחר מכן ולהיפך. על ידי העברת חומר גרעיני ממצב אחד למשנו, אפשר לנסות לנתק ביעילות תהליכים אלה, גישה ובכך נותנת למרחב חדש, שעדיין לא נחקר התגבשות,וכתוצאה מכך להגדיל את שיעור ההצלחה הכולל של ניסוי הקרנה. שיטות הוקמו תועדו לmacroseeding (i), ההעברה של גביש יחיד בשלמותו ממצב אחד לעוד 8, (ii) זריעת פס, העברת חומר גרעיני, בדרך כלל מתקבל על ידי הפעלת לחץ כיוונית באמצעות למשל השפם של חתול אל פני השטח של גביש קיים, ואחרי המעבר הבא של הזיף דרך טיפה חדשה התגבשות 9, וכן (iii) microseeding "קלאסי", ההעברה של "זרעים" קריסטל, שנוצרו על ידי קצירה כתוש גבישים (או גבישים חומר), לתנאים דומים לאלה שהניבו את הזרעים 10. יש לציין את כל שלושת שיטות אלה הם זמן רב וגרוע להרחבה, בוודאי בהשוואה למה שהוא בר השגה עם רובוטיקה התגבשות טיפול הנוזל המודרנית. גורמים אלה תרמו, ברמה מסוימת לפחות, לתפיסה שזרעing הוא שיטה לביקורים רק כאשר גישות אחרות נכשלו לשאת פרי.
microseeding מטריצה אקראית (rMMS) הוא חידוש המתודולוגי האחרון המשלב את היתרונות של microseeding המסורתי עם אלו של הקרנת תפוקה גבוהה ויכולת רחבה 11-13. גישה זו מסתמכת על הדור של מניית זרע, המיוצר מחומר גבישים גרעיני, אשר עשוי להיות aliquoted ל/ על כל sub-well/coverslip בתוך מסך התגבשות 96 מצב סטנדרטי. שיטה זו ישימה גם בישיבה או בתליית ניסויי דיפוזיה אדי טיפה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב24 גם או בפורמט מגש 96 היטב. rMMS הודגם בניסוי כדי להגדיל באופן משמעותי את שיעור הצלחה של התגבשות, ולייצר גבישים באיכות עקיפה גדולה יותר וכמות 11, 13, 14, ומייצג כלי חדשני בארסנל "crystallographers של גישות בoNgoing מאמץ לקראת הצלחה התגבשות. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS ולספק נתונים לדוגמה הממחישים את היעילות של טכניקה זו.
1. שיקולים אסטרטגיים
2. הכנת מאגר הזרעים
3. הקמתה של התגבשות מגשים
4. בדיקה של התגבשות מגשים
(א) דוגמא לניסוי rMMS
כדי להדגים את האפקטיביות של הקרנת rMMS אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי ההתגבשות של ליזוזים ביצת תרנגולת הלבן (HEWL) וכבד שור קטלאז (BLC). שני אנזימים אלה הם crystallizable בהחלט ומבניים מאופיינים היטב מטרות 15, 16. ככזה גם לספק נבדקי מבחן מצוינים כדי להמחיש את שיעור הצלחה התגבשות המשופר השגה עם rMMS. ניסויי התגבשות הוקמו ב96 היטב יושב בפורמט מגש טיפה באמצעות רובוטיקה טיפול נוזלית. פתרונות של HEWL וBLC הופקו על ידי המסת אבקות lyophilized של כל אחד ב20 מ"מ טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, לריכוזים סופיים של 100 מ"ג / מיליליטר ו20 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. לכל חלבון שלושה מסכים התגבשות 96 תנאי שימש; JCSG, PACT ומורפיוס. הקרנת התגבשות ללא microseeding בוצעה באמצעות כרכי מאגר של 50 μl, ו2 μlיושב טיפות הכוללות 1 μl של פתרון חלבון ו1 μl של פתרון מאגר. שישה המגשים היו מאוחסנים בחדר טמפרטורה קבוע על 18 מעלות צלזיוס ונבדקים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ משקפת. כל ראיה של גידול גבישים נרשמה. אחרי חמישה ימים במצב אחד מכל מגש שנמצא כדי לתמוך בצמיחה של חומר גבישים נבחר ומשמש לייצור מניות זרע. הקרנת rMMS בוצעה כפי שלהקרנה שאינו rMMS, למעט ש2.5 μl יושב טיפות הכוללות 1 μl של פתרון חלבון, 1 μl של פתרון מאגר ו0.5 μl של מניית הזרע היו בשימוש. כל ששת מגשי rMMS הועברו לחדר טמפרטורה קבוע על 18 מעלות צלזיוס ונבדקים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ משקפת. אחרי חמישה ימים מגשי rMMS של שני החלבונים נבדקו ומספר הטיפות עם גבישים נרשם. איור 1 מסכם את התוצאות מניסוי זה ומספק ניתוח כמוני. לHEWL 4-10 פילהגדיל בשיעור הצלחה של התגבשות, בהשוואה למגשים שאינם זרע, נצפה כאשר rMMS היה מוחלת על חלבון זה. יש לציין לBLC מצב אחד בלבד במסך מורפיוס נמצא להניב גבישים לעומת 55 תנאים שזוהו בעקבות השימוש בrMMS. יתר על כן, חלה עלייה של 3 ופי 7 בשיעור בהתגבשות BLC ההצלחה באמצעות JCSG ומסכי PACT בהתאמה. בכל המקרים, וללא קשר למסך התגבשות הקרנת rMMS משמש הניבה בסך הכל מספר גדול משמעותי של גבישים מהקרנה שאינה rMMS. חזרה על ניסויי הקרנת rMMS תאר באמצעות זרע מדולל 1:100 הניב באופן משמעותי פחות להיטים מאשר כאשר מניית הזרע חי הייתה בשימוש, מה שחזק את הדרישה לשימוש במניות חי בעת ביצוע הסיבוב של ניסויי rMMS הראשוני. עבור שני החלבונים לא הייתה וריאציה לכאורה קטנה באיכות גביש, נשפט על ידי גודל, מורפולוגיה, ושבירה כפולה. הערכה השוואתית של difאיכות שבריר של הגבישים שנוצרו באמצעות rMMS בניגוד לשיטות הקרנה מקובלות הולכת מעבר להיקפו של מחקר זה, לעומת זאת, ניתוח עקיפה ראשוני ראשוני באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים של שני החלבונים מבודדים מrMMS והמסכים שאינם rMMS ציין שם כדי יהיה וריאציה מעט באיכות עקיפה, כמו להישפט על סמך מגבלת רזולוציה ופרופיל מקום.
(ב) דוגמא של אופטימיזציה של מספר גבישים לכל טיפה
טכניקות Microseeding לתת באופן קבוע מקלחות של גבישים קטנים. לכן לעתים קרובות יש צורך לדלל את מניות הזרע כדי להפחית את הרמה של התגרענות. יתר על כן, זה עשוי לעתים להיות בלתי אפשרי לגדל גבישים בלהיט תנאים שנמצאו על ידי rMMS כאשר זריעה אינה משמשת 5. זה מקרים כאלה הוא לעתים קרובות מועיל כדי להשתמש microseeding "קלאסי", שבו כמה טיפות מוגדרות באמצעות אותו פתרון המאגר עם דילולים שונים של מניות זרע. ג זהלהיעשות באופן שיטתי במשך כמה תנאי הובלה על צלחת אחת באמצעות גישה "קומבינטורית" (פול רייכרט, מעבדות מחקר של מרק, תקשורת אישית), כפי שמוצג באיור 2. הנה פתרונות אחד או יותר להיט (H1 - H6) הם ויתרו לעמודות של צלחת התגבשות, תוך דילול של מניית זרעים שונה (S1 - S9) הוא הוסיף הטיפות של כל שורה. לכן כל שילוב של פתרון פגע ומניית זרע מדוללת נבדקים על צלחת אחת, ואת הרמה המתאימה של דילול וכל מגמות הנוכחיות יכולה בקלות להיות מזוהה.
יישמנו גישת microseeding קומבינטורית זה לשלושה חלבוני דגם, xylanase, thaumatin וthermolysin. כל חלבון נבדק עם מצב התגבשות שבעבר הוכח לתת שום גבישים בהעדר הזריעה, אבל נתן באופן עקבי גבישים כאשר זריעה הייתה בשימוש. תנאי ההתגבשות משמשים לxylanase, thaumatin ולאhermolysin מפורט בטבלה 2. ארבעה עד שישה תנאים הוקמו עבור כל חלבון עם או שתיים או שלוש חזרות של כל צירוף מניית חלבון / מצב / זרע כפי שמוצג. טיפות מורכבות 0.3 חלבון μl, 0.29 פתרון מאגר μl, ו10 מניית זרע NL. כל המגשים הוקמו באמצעות רובוט התגבשות טיפול נוזלי. מניית זרע מסודרת ושישה דילוליהן הוקמו עבור כל חלבון. פרטים ניסיוניים אחרים כבר דיווחו בעבר 12. המספר הממוצע של גבישים המתקבלים לכל טיפה זממו נגד הדילול של מניית הזרע באיור 3. נתונים אלו מראים כי מספר הגבישים כדלקמן יחסים בערך ליניארי עם מספר הזרעים הוסיפו. לשלושת החלבונים שנבדקו, 01:10 -3 ל1:10 -6 דילולים נדרשו להשיג 1-10 גבישים לכל טיפה.
טבלת 1. רשימה של חומרים.
חלבוןקוקטייל התגבשות | מספר הטיפות שהוקמו לכל מגש | |
Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 2 סולפט M אמוניום, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 30% (w / v) PEG 4000, 0.2 נתרן אצטט M, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | formate נתרן 4 M | 3 |
Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 3.5 M אמוניום סולפט, נתרן כלורי 250 מ"מ, pH נתרן פוספט 50 מ"מ / אשלגן 7.5 | 3 |
Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | pH אשלגן זרחה 1.5 M 7.0 | 3 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 30% (w / v) PEG 4000, 0.2 M אמוניום אצטט, pH 0.1 ציטראט M נתרן 5.6 | 2 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 20% (w / v) PEG 4000, 20% (V / V) 2-propanol, 0.1 M-pH ציטרט הנתרן 5.6 | 2 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 30 (w% / V) PEG 8000, 0.2 M אמוניום סולפט, 0.1 pH cacodylate M נתרן 6.5 | 2 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 20 (w% / V) PEG 8000, 0.2 אצטט M מגנזיום, 0.1 pH cacodylate M נתרן 6.5 | 2 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 2 סולפט M אמוניום, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 2 |
Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | גופרתי ליתיום 1.5 M, 100 HEPES מ"מ pH 7.5 | 2 |
Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 20.0% (w / v) PEG 6000, pH חומצת לימון 100 מ"מ 5.0 | 3 |
Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 1.26 M אמוניום סולפט, 200 גופרתי ליתיום מ"מ, 100 מ"מ טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 10% (v / v)MPD, pH bicine 100 מ"מ 9.0 | 3 |
Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 800 מ"מ pH החומצה succinic 7.0 | 3 |
טבלה 2. פתרונות חלבון ותנאי התגבשות השתמשו בניסוי microseeding קומבינטורית.
איור 1. (א) השוואה בין rMMS והניסויים הקרנת התגבשות שאינה rMMS. תנאי תמיכה בצמיחת גביש נמצאים בירוקים, תנאים לא תמיכה בצמיחת גביש הם בצבע אפור. תנאים שנבחרו לשימוש בדור מניית זרע הם בצבע ורוד. מסכי התגבשות מסומנים כדלקמן ליזוזים הלבן, JCSG, שאינו rMMS, (ii) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, JCSG, rMMS, (iii) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, PACT, שאינו rMMS, (iv) תרנגולת ביצה (i) תרנגולת לדוגמא: ליזוזים הלבן גרם, PACT, rMMS, (v) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, מורפיוס, שאינו rMMS, (vi) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, מורפיוס, rMMS, (ז) בכבד בקר קטלאז, JCSG, שאינו rMMS, (ח) כבד בקר קטלאז, JCSG, rMMS, (ט) קטלאז, PACT, שאינו rMMS, קטלאז, PACT, rMMS, קטלאז, מורפיוס, שאינו rMMS, כבד כבד שור (x) כבד שור (xi) כבד בקר (יב) שור קטלאז, מורפיוס, ניתוח השוואתי rMMS. (ב) לשיעור הצלחה התגבשות באמצעות rMMS והקרנת התגבשות שאינה rMMS. עבור מים שאינם rMMS הקרנת מספר תנאי התגבשות זוהו כתמיכה בצמיחת גביש של או HEWL או BLC מוצגים בכחול, לrMMS הקרנת מספר תנאי התגבשות זוהו כתמיכה בצמיחת גביש של או HEWL או BLC מוצג באדום. הנתונים מבוססים על בדיקה של מגשי התגבשות הודעה 5 ימי הקמתה.
"/> 2.jpg
איור 2. הפצה של תנאי התגבשות והשעיות מניית הזרע מדוללת לחלבון יחיד בניסוי microseeding קומבינטורית ירושלים. עמודות מודגשות H1-H6 מכילות תנאי התגבשות שונים תמיכה בצמיחת גביש חלבון המטרה. שורות מודגשות S1-S7 מכילות דילולים שונים של השעיה מניית זרע חלבון המטרה.
איור 3. מתאם בין דילול מניות הזרע ומספר ממוצע של גבישים המתקבלים לכל טיפה בניסוי microseeding קומבינטורית. שלושה חלבונים המשמשים היו xylanase, thaumatin וthermolysin. טיפות הוקמו בצלחת 96 היטב MRC באמצעות רובוט טיפול נוזלי, ומהוות 0.3 חלבון μl, 0.29 פתרון מאגר μl, ו10 NL של se הטריed מניות. הנתונים שהוצגו מבוססים על בדיקה של מגשי התגבשות הודעה 5 ימי הקמתה.
במאמר זה שתארנו שיטה כללית להקרנת התגבשות חלבון rMMS. אנחנו הוכיחו באמצעות שני חלבוני מבחן שיפור משמעותי בשיעור הצלחה גיבוש בשיטה זו. ניתוח עקיפה באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים שנוצרו באמצעות rMMS ושיטות שאינם rMMS חשף וריאציה מעט באיכות עקיפה בין הגבישים גדלו בשני שיטות, אם כי מחברים קודמים דיווחו כי גבישים באיכות טובה יש סיכוי גבוה יותר לגדול בניסויי rMMS 11, 13. HEWL וBLC אולי נתנו תוצאות לא טיפוסיות משום שהם קלים בצורה יוצאת דופן כדי להתגבש. אנחנו גם להמחיש את החשיבות של אופטימיזציה של הריכוז של מניות זרע גביש המשמשות בניסויי rMMS, ולהדגים כיצד זה יכול להיות מותאם על ידי דילול כדי להבטיח שמספר אופטימלי של גבישים באיכות עקיפה מיוצר.
rMMS היא תפוקה גבוהה פשוט,, מאודשיטה ניתנת להרחבה, שניתן להשתמש כדי להשלים את שיטות הקרנה מסורתיות. ניתן להגדיר ניסויים על ידי יד או על ידי רובוט, ב96 היטב או מגשי 24 גם, ולתלות או יושבים פורמטי ירידה. המגבלה העיקרית של rMMS היא שהוא מסתמכים על קבלת צורה כלשהי של חומר גבישים של חלבון מטרה (או של חלבון הומולוגי) על מנת ליצור את זרעים בערכאה הראשונה. יצוין, עם זאת, כי חומר גבישים באיכות גבוהה אין צורך, ואכן המחברים השתמשו בהצלחה microcrystals ומשקע אמורפי לעשות מניות זרע. השימוש בהקרנת rMMS אינו מוגבל לצמיחה של גבישים של חלבונים טבעיים. לדוגמא, rMMS מתאים גם לגבישים גדלים של גרסאות להחליף selenomethione או selenocysteine. במקרים כאלה, גבישים של החלבון האם ניתן להשתמש בם כדי להפוך את מניית הזרע. למרות שפרוטוקולי נוקלאציה גביש חלופי תועדו 1,4, אף חלים גם לar הרחב כמוAnge של חלבונים כrMMS.
לאחר rMMS גישת microseeding קומבינטורית ניתן להשתמש כדי לייעל את הרמה של זריעה כדי לייצר גבישים לאיסוף נתונים. התכונה זו שימושית במיוחד עבור ניסויי יגנד השרייה בו מספר גדול של גבישים לעתים קרובות נדרשים. שימוש בגישה זו מסך התגבשות כל ניתן להקים במהירות באמצעות microseeding בשילוב עם מניות זרע בדילול מלא, עם כל מניבים מספר קטן יחסית של גבישים כן.
לסיכום אנו מעודדים את כל מי שעוסקים בהתגבשות macromolecular לעשות rMMS חלק מהעבודה השגרתית שלהם בכל המקרים בהם גבישי diffracting אינם מתקבלים ישירות מהמסכים הראשוניים שלהם.
יש לנו מה למסור.
עבודה זו מומנה בחלקו על ידי BBSRC (BB/1006478/1). PRR הוא הנמען של אוניברסיטת חברה מלכותית מלגת מחקר.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved