Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל עצום הבריאות זקוקה אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, על פי הדגם במבחנה דיכאון באמצעות הפצת בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס, כאמצעי לפתח מטרות טיפולית חדשנית.

Abstract

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל הבריאות הצורך של אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, הדגם במבחנה באמצעות הפצת דיכאון (SD), כאמצעי לפתח מטרות טיפולית חדשנית מיגרנה אפיזודי כרוני. SD הוא הגורם סביר של הילה מיגרנה וכאבי מיגרנה. זהו הפסד התקפי של תפקוד עצבי מופעלות על ידי פעילות עצבית מוגברת בהתחלה, אשר לאט מתפשטת בתוך אזורים במוח רגישים. תפקוד המוח רגיל הוא רגיש להפליא, והוא מסתמך על, חופפות ברמה נמוכה איתות החיסונית. לפיכך, סביר איתות החיסונית העצבית משפיעה הפעילות החשמלית של SD, ולכן מיגרנה. תפיסת הכאב מחקרים SD בבעלי חיים שלמים כרוך בקשיים, אבל כל החיות מתאימים גם לבחון מערכות היבטים בביולוגיה של מיגרנה מאז SD מפעיל מסלולים nociceptive trigeminal. עם זאת, מחקרים בבעלי חיים שלם לבדו לא יכול לשמש כדי לפענח את המנגנונים מעגל הסלולר העצבית של SD. במקום זאת, בהכנות במבחנה שבה התנאים הסביבתיים ניתן לשלוט נחוצים. כאן, חשוב להכיר במגבלות של פרוסות חריפה יתרונות ברורים של תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. פרוסות המוח חריפה לא יכול לגלות שינויים עדינים איתות החיסונית מאז הכנת פרוסות לבדו מעורר: הפרו דלקתי השינויים הימים האחרונים, התנהגות epileptiform בשל רמות גבוהות של מתח החמצן הדרוש כדי להחיות את פרוסות, ופגיעה בלתי הפיכה תא במרכזי פרוסה anoxic.

לעומת זאת, אנו בוחנים איתות החיסונית בוגרת תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מאז תרבויות מקרוב מקבילים שלהם עמיתו vivo עם תפקוד trisynaptic בוגרת; להראות האסטרוציטים שקט, microglia, ורמות ציטוקינים, ו SD מושרה בקלות כהכנה unanesthetized. יתר על כן, פרוסות הם חיים ארוכים ו SD יכול להיגרם על ימים רצופים ללא פציעה, מה שהופך את ההכנה האמצעי היחיד עדכני המסוגל דוגמנות ההשלכות neuroimmune של כרוני SD, ו מיגרנה כרונית ובכך אולי. אנו משתמשים בטכניקות אלקטרו ולא פולשנית הדמיה כדי למדוד תא עצבי פונקציות במעגל ביחד עם SD. עצבית החיסונית ביטוי גנים משתנים נמדדים עם הקרנת qPCR, מערכי qPCR, וכן, חשוב מכך, השימוש preamplification cDNA לגילוי של Ultra-Low מטרות רמת כגון גמא אינטרפרון משופר באמצעות תא שלם, אזורית או ספציפי (באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה לייזר) דגימה. מפל איתות ציטוקין מוערכת נוספת עם מטרות phosphoprotein multiplexed קשור עם ביטוי גנים שינויים phosphoprotein אישר immunostaining דרך תא ספציפי. אסטרטגיות תרופתי ו siRNA משמשים לחקות לווסת את המערכת החיסונית מאותתים SD.

Protocol

קיימות מספר נקודות ראוי להדגיש ללימוד מוצלח של מערכת החיסון הקשורות איתות SD בתוך פרוסות המוח. ראשית, צריך ליזום גירויים סינכרוני depolarize נפח מספיק של החומר האפור במוח ליזום SD. משמעות הדבר היא תצורת ממשק (כלומר, חשיפה נוזל רק למטה חילוף הגזים מעל להכניס תרבות פרוסה) נדרשת. 1,2 שנית, פרוסות המוח חריפה לקיים SD אבל הטראומה של ההכנה שלהם, כמו גם את השימוש של 95% חמצן, סודה הפתרון של רינגר ליצור הפרו דלקתי שינויים בהתנהגות epileptiform בהתאמה, אשר יכול לשנות את תפקוד מעגלים עצביים הומאוסטזיס החיסונית. 3 שלישית, בעוד תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס להתגבר על המגבלות האלה פרוסה חריפה, חשוב לציין כי בתרבויות פרוסה יש לשמור לתקופות נאותה לפני השימוש (כלומר, יותר מ 10 ימים במבחנה), כך microglia ו האסטרוציטים להיות שקט. 3-5 לבסוף, SD צריך להיות מושרה באמצעות טכניקות סטרילית aseptic. טכניקות המפורטים להלן נועדו למלא את הצורך הזה.

1. הפצת דיכאון תרבויות Slice

  1. תרבות הכנה ותחזוקה.
    1. תרבויות Slice מוכנים ומתוחזק במדיום סוסים סרום המבוסס או בינוני בסרום חינם (SFM) 6,7 כפי שתואר לעיל 8 עם שינויים קלים עד בינוניים. פרמטרים דגירה הן 36 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 95% לחות איזון האוויר.
      1. אנו מוצאים כי תרבויות ניתן להעביר אל SFM לאחר 18 ימים במבחנה ומתוחזק לפחות 35 ימים במבחנה על ידי שימוש SFM שהוגדרו בעבר שלנו הכולל סידן, מגנזיום נוספת.
      2. בנוסף, אנטיביוטיקה antifungicide מתווספים על מנת למנוע זיהום זיהומיות הקשורות פרקים הקלטה מרובות.
      3. זה לטווח ארוך (או הקלטה) בינוני מכיל נוסחה (100 מ"ל): בינוני Neurobosal, 97 מ"ל; Gem-21, 2.0 מ"ל; Glutamax (200 מ"מ), 0.5 מ"ל; Gentamycin (10 מ"ג / מ"ל), 10 μL; D-גלוקוז (45%), 680 μL, חומצה אסקורבית (0.5 מ '), 100 μL; Fungizone, (250 מ"ג / מ"ל), 400 μL; NaCl (5.0 מ'), 820 μL, Mg 2 Cl 2 (1.0 מ ') , 80 μL; CaCl 2 (1.0 מ '), 160-240 μL.
      4. תרבויות משמשים SD 21-35 ימים במבחנה.
    2. אימות Vitality. 3,6,7
      1. תרבויות מוקרנים ראיות המוות נוירון פירמידלי לפני השימוש.
        1. בגיל 18 ימים במבחנה, מוסיף מודגרת במשך 20 דקות בינוני (בתנאים נורמליים הדגירה) המכיל 5 מיקרומטר Sytox גרין, סמן אשר הופך ניאון כאשר הוא נקשר ל-DNA (כלומר, על ידי חדירה לתוך תאים מתים).
        2. הוספת מועברים לאחר מכן חזרה בינוני הקודם שלהם ובדק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (504 ו - 523 עירור פליטה) ראיות לפגיעה CA3 או CA1 נוירון פירמידלי השכבה.
          1. פרוסות עם יותר מ 20 תאים או יותר ברמה סטנדרטית של הקרינה מ 250 IU הוצאו משימוש נוסף.
  2. חומרי ייצור.
    1. אלקטרודות קרקע נעשים עם צינורות זכוכית (2.0 מ"מ OD / 1.16 מזהה מ"מ) לחתוך 4.5 מ"מ אורך ו בקצרה אש מלוטש בשני קצותיו.
      1. אנחנו עושים על 20 אלקטרודות בכל פעם, אשר יכולה להימשך יותר משנה.
      2. מביאים 100 מ"ל KCl 1M לרתיחה ומוסיפים, תוך ערבוב עם אגר, 3.5 גרם ו 0.5 גרם EDTA (ethylenediaminetetraacetic חומצה dihydrate disodium מלח) כדי לייצר פתרון צהוב בהיר.
      3. השתמש אורך קצר של צינורות גמישים מצויד מעל הצינור לכל כוס לצייר פתרון חם KCl / אגר לתוך צינורות זכוכית, כמו גם מרחק קצר לתוך צינורות גמישים.
        1. שאיבה שחרור ולאפשר אגר KCl / לטפטף באיטיות מן הקצה הפתוח של שפופרת זכוכית, ולאחר מכן להחזיק את שפופרת זכוכית פתוח טיפ נגד פיסת קרח.
        2. התמרון האחרון תנחה את אגר כדי ג'ל בקצה האלקטרודה ולא ג'ל לאחר נסוג חזרה לתוך צינור הזכוכית.
      4. לאחר אגר יש בג'ל במים קרים, צינור גמיש ניתן להסירו מבלי לשנות את מיקומו של אגר צינורות זכוכית.
      5. המקום של 0.5 מ"ל 1 M KCl לתוך הבאר כל מתלה 1.5 צנטריפוגות מ"ל צינור. אז במקום אחד קצה הצינור KCl / אגר כל כוס מלא בבארות בודדים.
      6. בשלב הבא, לקיים אורך 80 ס"מ של חוט כסף 15 עם מד hemostat ונקי כל אחד מארבעת הצדדים על ידי גירוד את החוט דרך לוח אמרי שנערך לראש הדלפק.
      7. חותכים את החוט לתוך 4 ס"מ אורך ולמקם אותם לתוך בקבוקון scintillation מלא אקונומיקה במשך 20-30 דקות למקום מעיל Ag-AgCl הפירמה על פני כסף לנקות.
      8. בנד כל חוט במחצית ולהכניס את הקצוות חופשי לתוך קצה אחד של צינור זכוכית מלא wiה KCl / אגר, והשאיר על 4-6 מ"מ חשוף.
      9. לבסוף, המעיל שפופרת זכוכית שוק המכיל את חוט כסף במידה קטנה של חוט כשהחלק, דבק עמיד במים וגמישה, כדי למנוע את KCl / אגר מהתייבשות. חזור על הפעולה עבור כל אלקטרודות. בואו דבק היבש בין לילה.
      10. אחסן את האלקטרודות על 4 מעלות צלזיוס scintillation בקבוקונים (5-6 אלקטרודות / בקבוקון) המכיל 5 מ"ל 1 ~ M KCl ו 25 מ"ג EDTA, אשר מפגרים באופן משמעותי התפתחות חיידקים.
    2. הקלטה אלקטרודות עשויות בקוטר 1.5 מ"מ (0.86 מזהה מ"מ; אורך 10 ס"מ) צינורות זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (איור וידאו 1).
      1. משוך microelectrodes עד קצה קנס עם צינורות זכוכית קצר משך לנקודה חדה.
        1. אנחנו בדרך כלל למשוך אלקטרודות ~ 7.5 ס"מ אורך עם להתחדד 1 ס"מ. זה מאפשר מיצוב הולם קצה להדמיה אלקטרודה.
        2. אלקטרודות נמשכים עם חולץ PE-2 Narishige.
        3. טיפים microelectrode שבורים בחזרה 2-4 מיקרומטר תחת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ המתחם מצויד מיקרומטר אופטי מכויל. אנו משתמשים קצה שקופיות זכוכית רגילה היסטולוגיה (25 x 75 x 1 מ"מ) המחובר micromanipulator חד ממדית הידראולי המוחזקות על ידי מניפולטור 3 מימדי אחר בעדינות לשבור את עצות microelectrode.
          1. ראשית, האלקטרודה הוא רכוב המצורפת המיקרוסקופ שקופית באמצעות חימר.
          2. ואז להחליק את מושם על בעל מיקרוסקופ שקופיות אשר משמש כדי להזיז את קצה microelectrode ליד הקצה של הכוס החליקה המצורפת המניפולטור הידראולי.
          3. לבסוף, בקצה microelectrode הוא נשבר בעדינות על ידי לחיצה על אותו נגד קצה מונע הידראולית שקופיות מיקרוסקופ.
    3. אלקטרודות גירוי שזורות חוטי אלקטרודות דו קוטבית כי:
      1. הם מאפשרים הקלטה של ​​הפוטנציאל בתחום עורר, אשר אחרת יהיה מוסתר על ידי חפץ הגירוי מן גירוי monopolar.
      2. אלקטרודה מגרה דו קוטבית ניתן ליישם בעדינות אל פני השטח gyrus משוננת בלי פציעה, בניגוד מחודדים אלקטרודות דו קוטבית.
      3. לבסוף, להחיל הנוכחי הוא מקומי של (חשוף) משטחים רוחבי עגול של חוטי טפלון מבודדים המשמשים האלקטרודה.
        1. ייצור אלקטרודה מגרה מתחיל עם גזירה ~ 20 ס"מ אורך של אירידיום, פלטינה (125 מיקרומטר קוטר חשוף; בקוטר 200 מיקרומטר מצופה) ואת חוט מצופה טפלון. ואז, לכופף את אורך לשניים לקשור את הקצוות לפקעת מרובע רופף, עוזב ~ 2 ס"מ הקשר עד קצה של חוט.
        2. Secure את הקשר צ'אק של המקדחה החשמלית יד מונחת על השולחן.
        3. בעוד מחזיק את הקצה השני של החוט עם hemostat, בקיצור להפוך את התרגיל לסירוגין עד החוט הוא שזור היטב (כלומר, פני השטח של כל חתך יהיה במרחק שווה זה מזה כאשר נחתך חוט בכיוון רוחבי ללא נפרמים ).
        4. בשלב הבא, את הקצוות החשופים של פלטינה אירידיום חוטים מעוות צריך להיות מחובר להוביל חוטים המשמש לחיבור האלקטרודה מגרה המבודד גירוי.
          1. הדבר נעשה על ידי הלחמה מסתיים ללא חוט פלטינה אירידיום ל ~ 50 ס"מ 30 חוטי מד.
          2. ראשית, הקלטת חוט פלטינה אירידיום מעוות למעלה ספסל ושחרר שלולית של HCl מרוכזת על קצה אחד חופשי של חוט שזור.
            1. בשלב הבא, לפשוט על 1 ס"מ של בידוד מחוט אחד באמצעות מספרי תיל.
            2. מניחים את הסיר על קצה חוט להוביל סמוך לסוף חוט שזור וליישם חום ברזל דק שקצהו הלחמה, הלחמה אז עד שני החוטים מחוברים היטב.
          3. פליטת אורך קטן של צינורות חום לכווץ בחיבור חוט חשוף להתכווץ זה מתאים עם החום.
          4. חזור על חוט השני.
          5. אש ללטש קצה של 15 ס"מ פיפטה פסטר ולכוון את חוט שזור פלטינה אירידיום מטה פיפטה עד כ -6 ס"מ של בולט מעוות החוצה.
          6. השתמש אפוקסי דוחה מים (למשל, JB ולד) כדי לאטום את שני הקצוות של האלקטרודה.
          7. לבסוף, לצרף תקעים בננה עד קצה חוט להוביל לחיבור המבודד את הגירוי.
          8. תחת תצפית סטריאוסקופית, המקום קצה האלקטרודה ב PBS ולחפש בועות המיוצר אלקטרוליטים מגיע בסופו של דבר רק חתך של טיפים אלקטרודה. אם כל הבועות מגיעים הצדדים של חוטים מעוות, לחתוך את אלקטרודה עם חתך רוחבי באמצעות סכין גילוח טרי יחיד להב קצה בידוד להקים מחדש שלם של צירים חוט ארוך.
          9. כאשר פתרון בעיות כדי לפתור תופעות גירוי סוטה, נסה לעשות טיפ טרי אלקטרודה לחתוך.
    4. מנות הקלטה מורכבים כמותרבות כינים להוסיף מנה 35 מ"מ תרבות שיושב על שני 1.0 x 12 מ"מ מוטות זכוכית במרווחים על 1.0 ס"מ זה מזה. צרף מוטות זכוכית לבסס את המנה על ידי חימום צינורות זכוכית ולאחר מכן הקשה על בסיס אותם עם מלקחיים.
      1. התנאים לקבלת הקלטת סטטי, להוסיף 1.5 מ"ל של בינוני עד המנה.
      2. בשלב הבא, להשרות חתיכת ס"מ ~ 10 מ"מ רוחב ו 3-4 ארוכה של כותנה סטרילי בתוך 1.0 מ"ל של מדיום. מקפלים את הכותנה במחצית לאורך ציר זמן ומקום בו לאורך היטב הפנימית על להכניס את עם מלקחיים סטרילית. צמר גפן רטוב מסייע לשמור על לחות צלחת.
      3. שלוש 4 דחיס מ"מ באורכים של צינורות מחולקת באופן שווה סביב להכניס את.
      4. מכסים את צלחת הדוק עם הסרט פוליוויניל כלוריד, אשר מאפשר חילופי גזים.
      5. חותכים סביב הקיר שלה באמצע אנכי עם סכין גילוח חד בקצה כדי להסיר את הסרט עודף פוליוויניל כלוריד.
  3. אלקטרו ההתקנה
    1. תרבות פרוסת הרכבה להכניס מושם לתוך תא ההקלטה PDMI עבור הקלטות אלקטרו.
      1. הרכבה הוספה / תרבות צלחת של תא PDMI מכוסים על ידי דיסק 2 מ"מ פלסטיק עבה מסופק עם הקאמרית PDMI, עם חורים קטנים שונים מיקומו לפי הצורך עבור אלקטרודות הקלטות בינוני יבוא / יצוא צינורות וכו '
      2. אנו מעת לעת לפקח pH בינוני עם אלקטרודה זעירה pH וטמפרטורה בשילוב עם סוג מיניאטורי T תרמי בדיקה רכוב לתוך microelectrode למחצה אטום כדי להבטיח pH 7.3 ו 36.0 ° C התנאים.
      3. החדר הכנס / היא סודה עם אוויר 5% פחמן דו חמצני, מאזן בינוני מוחזק או סטטי או בזרימה (1.2 מ"ל / דקה) עם תצורה במרכז הכנס שהתקיים 35-36 ° C.
      4. התנאים לקבלת זרימה, בינוני הוא התחמם עם דוד מוטבעת, שוב כדי לשמור על מרכז החדר הקלטה ב 36 ° C.
        1. מערכת המשאבה peristaltic בהקלה על לחץ מביא בינוני לתוך לתרבויות פרוסה ללא פעימות מהמשאבה. Aspirator מסופק עם תא PDMI משמש כדי להסיר בינוני מ להכניס את דרך יניקה עדינה.
      5. לגבי יציבות, החדר הוא רכוב על הבמה Burleigh-גיברלטר במיוחד מיקרוסקופ הפוך שמחזיק מיקרוסקופ הפוך ויושב על השולחן רטט חופשי.
      6. חורים קטנים נפתחים דרך להכניס פוליוויניל כלוריד לעטוף עם כלי קטן המופעל באמצעות סוללה נטענת, כויה.
      7. בשלב הבא, אם תצורת הזרימה היא לשמש, כניסת וזרימה לשקע הוא התחיל, ואחריו מיקום האלקטרודה לקרקע. אחרת, פשוט לשים את האלקטרודה הקרקע במקום.
      8. אלקטרודות, שנערך במקום עם micromanipulators, ממוקמות בדיוק מעל פרוסת דמיינו עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 5x (איור 1).
        1. בגין עם אלקטרודה ההקלטה ואחריה האלקטרודה מגרה.
        2. אנו משתמשים צג השמע לציין microelectrode כאשר באה במגע עם הפרוסה. טיפ ממוקמת נקודת האמצע לאורך CA3 שכבת תאים פירמידליים הגוף.
        3. הקלטות הן נכתבו, ואז אלקטרודה מגרה הוא נגע בעדינות אל פני השטח את נקודת האמצע של gyrus משוננת.
        4. בשני המקרים, תנועות אלקטרודה הראשונית הם השיגו עם פקדי גס, והמיקום הסופי רק עם, שולט בסדר הידראולי באמצעות הניגוד תאורה שלב, כך שהגוף שכבות התא ניתן להבחין בקלות.
        5. Advance אלקטרודות ~ 25 מיקרומטר במרווחים תחת להדמיה מיקרוסקופית ישירה.
        6. לאחר אלקטרודות לגעת רקמות, לקדם את האלקטרודות עוד 20-30 מיקרומטר.
        7. הקלטות הן החלו לפני אלקטרודה מגרה הוא לשים במקום כדי להיות בטוח זה לא ההדק SD (כלומר, באמצעות גירוי מכני).
        8. ~ 10 דקות מותר לחלוף לפני הניסויים מופעלים.
  4. המושרה Transynaptically SD.
    1. מטב עורר CA3 פוטנציאלים בתחום כדלקמן (איור 2).
      1. CA3 פוטנציאל השדה עורר עם 100 פעימות μs (0.2 הרץ) החל הנוכחי כי הוא מספיק כדי לעורר תגובה (למשל, ~ μA 1-5).
      2. הזז את האלקטרודה הקלטה במרווחים לאורך ציר נוירון פירמידלי ארוך עד פוטנציאל השדה מקסימלי.
      3. ואז, להגביר את זרם עם אלקטרודה ההקלטה בעמדה זו וציין את התגובה הנוכחית מקסימלית (למשל, ~ μA 10-20).
      4. לבסוף, השתמש בחצי מקסימלי עוצמת הגירוי לניסויים (לדוגמא, זיוף לשלוט גירוי תקופתיות).
    2. קביעת סף SD עורר synaptically (איור 2).
      1. עם אלקטרודות מוגדר כפי שתואר לעיל עבור פוטנציאלים בתחום עורר, לעבור את הפרדיגמה גירוי, עורר פרצי יחיד ידנישל 10 פעימות (10 הרץ @ 100 μs / דופק), פרדיגמה להחיל בעבר במחקרים בבעלי חיים שלמים.
      2. בהדרגה להגדיל את עוצמת זרם לכל גירוי פרץ עד SD מופעל. חכו לפחות 60-120 שניות בין גירויים.
      3. דווח על סף coulombs SD (כלומר, זמן x הנוכחי).
    3. בניסויים אחרים הדורשים מדידת התגובות אינדוקציה של SDS מרובות, להשתמש בכוח סביר כדי לעורר גירוי SD (למשל, 100-500 ~ NC).
      1. טריגר SD כל 9 דקות לשעה.
      2. הקפד להשתמש בטכניקות aseptic בכל הניסויים.
      3. לאחר SD האחרון, להחזיר את הכנס תרבות לתנאי הדגירה נורמלי.
        1. סמן את המנה תרבות לציין את תרבות מנוסה SD.
        2. הרגל שלנו היא המקום סימן אחד שמאלה, שני סימני מימין להכניס את תרבות פרוסה, וציין כל אחת משלוש התרבויות כפי # 1, # 2 ו # 3 משמאל לימין.
        3. שנה בינונית כל 3-4 ימים עד הקציר תרבות.
    4. עבור SD חוזרים, בצע את ההליכים המתוארים לעיל.
    5. אנחנו בדרך כלל מבחן לשינוי SD סף 1, 3, 7, ו - 14 ימים לאחר שעה הראשונית של SDS מרובים.
    6. CA3 מהיר באזור שינויים פוטנציאל פוטנציאל להאט נרשמים דרך להפריד מערכות עיבוד אות דיגיטלי.

2. הדמיה ויטל למופת בתרבויות Slice בהיפוקמפוס

  1. התנהגות תפקודית דינאמית של תאים חיסוניים תושב (כלומר, microglia) יכול באותה מידה להיות פיקוח בתרבויות פרוסה ללא פגיעה בתא או הפעלת המערכת החיסונית (איור 3). 9
    1. לדוגמה, כדי תווית microglia להעריך את תנועתם קשורים לשינויים הפעילות הסינפטית של SD, השתמשנו fluorophore-tagged isolectin IB-4.
    2. "PBS לקטינים" הוא PBS עם קטיונים נוספים (0.1 מ"מ כל CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) מאז קטיונים divalent (0.1-1.0 mM) נדרשים כדי לקשור לקטינים α-D-galactosyl moieties על קרום התא microglial.
    3. בצע פתרון של "PBS לקטינים":
      1. עבור 1 ליטר PBS, באמצעות טכניקה aseptic סינון סטרילי, להוסיף:
      2. 100 μL של 1M MgCl 2
      3. 100 μL של 1M MnCl 2
      4. 100 μL של 1M CaCl 2
    4. מערבבים היטב לשלב ולשמור בקירור ב 4 ° C.
      1. רק 500 μL של "PBS לקטינים" נדרשת לכל בקבוקון של isolectin, אבל מאז זה יכול להיות בקירור ושמר במשך חודשים בכל פעם, זה עשוי להיות שימושי כדי לפצות כרכים גדולים.
    5. מחדש AlexaFluor 594-tagged isolectin-IB4 (isolectin) lyophilized אבקת to1 מ"ג / מ"ל ​​"PBS לקטינים".
      1. כדי למזער photobleaching, לבצע שלב זה מהר ככל האפשר, מזעור חשיפה לאור.
      2. Isolectin ניתן aliquoted כדי μL 20 פעם מחדש על 1mg/ml והמשיך ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
      3. מדולל isolectin עד 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​במדיום הגידול ותרבויות פרוסה דגירה בתנאים נורמליים הדגירה 40-10 שעות לפני הדמיה.
    6. הדמיה הגדרת.
      1. הגדרת הדמיה כוללת: מצלמה, מיקרוסקופ, תריס, אור, 2.0 צפיפות לסנן נייטרלי, 36 ° C, גז: 5% CO2, אוויר (או 20% חמצן, חנקן מאזן).
      2. הפעל מיקרוסקופ, מצלמה, אור UV, בקרת טמפרטורה, גזים לפחות שעה אחת לפני הדמיה.
    7. הגדרת MetaMorph הדמיה פרוטוקול.
      1. מתוך "כתב העת" התפריט הנפתח, בחר "Run ג'ורנל ...".
      2. זה אמור להנחות את פתיחת תיקייה כתבי העת, שממנו אתה צריך לבחור "Motion w-var afs (כתב העת הוקם בעבר כי בעקבות הצעדים הבאים)", לחץ על "פתח".
      3. "מיקוד אוטומטי תדר" חלון יצוץ הבא, לשמור על מספר 1, על "אישור".
      4. בשלב הבא, הגדרת "קובץ Na רצופות ..." החלון יופיע, לשמור הכל כפי שהוא:
        1. שם הבסיס: תמונה;
        2. מספר תמונה: 1;
        3. רוחב מספר: 3;
        4. Save As Type: MetaMorph TIFF;
        5. אם התמונה כבר קיים -> החלף באופן אוטומטי;
        6. לחץ על "Directory בחר ...", זה יגרום" עיון עבור תיקייה "חלון לצוץ. הנה, בחר את התיקייה (או ליצור תיקיה חדשה) שבו מסגרות הסרט צריך להישמר.
        7. לאחר מכן, כאשר התיקייה הנכונה (למשל C: \ Data \ תיקיה חדשה) מוצג בתחתית "סדרתית קובץ ההתקנה Na ..." חלון, לחץ על "אישור".
        8. בחלון רוכשת:
          1. בחר את ההגדרה בפינה השמאלית התחתונה להיות DiIMGBIN2;
          2. "זמן חשיפה": 20ms: "binning": 1.
        9. לאחר מכן, בכרטיסיה מיוחדים:
          1. "חיישן מצב": FT;
          2. "Digitiזר ": 10MHz (רווח EM);
          3. "רווח": Gain3 (3x);
          4. בחר "א.מ. רווח: 45"; תריס מצלמה: פתוח חשוף; מצב נקה: EXP PRE ברור: ספירת נקה: 2, מצב טריגר & מצב טריגר Live: רגיל (מתוזמן).
        10. "מסגרות ממוצע": 3.
        11. לחץ על "סגור".
    8. לאחר הגדרת הדמיה MetaMorph, במקום להכניס בצלחת תרבות 35mm עם שני מוטות זכוכית 1 מ"מ בתחתית.
      1. מקום שלוש עם 2 חתיכות מ"מ צינור גומי מצויד בין קירות להכניס את התרבות ואת צלחת נוספת לייצב את הכנס.
      2. מניחים פיסת רחב ~ 10 מ"מ של גפן טבול בינוני 1 מ"ל נוספים בתוך הכנס את לשמור על סביבת humidified. ודא כי הוא מיושר עם הקירות הרחק פרוסות בהיפוקמפוס.
      3. מכסים את החלק העליון של התבשיל תרבות הדוק עם הסרט פוליוויניל כלוריד כדי למנוע איבוד נוזלים.
    9. ודא כי מוקד הדמיה היא שכבה CA3 תא פירמידה. הערה האוריינטציה של פרוסה על ידי לצלם שלב ב 5x, 10x ו 20x.
    10. בחלון "מצא פוקוס" שמופיע על המסך, טווח מוגדר, הנוכחי + / - כדי להיות "8", ו - דיוק, ב מיקרון (ים), כדי להיות "1" (בשתי תיבות בתחתית יש לבדוק) .
    11. לחץ על "מצא פוקוס" על מנת להבטיח תמונה פוקוס.
    12. בחלון "השג Timelapse", בחר מרווח זמן כדי להיות "1 דקות", ואת משך זמן להיות "6 שעות" (אלה הם פרמטרים המועדפת שלנו הרכישה).
      1. כדי ללכוד במדויק תנועות microglial, הדמיה אמורה להיות תכופים פחות מדקה בכל פעם.
    13. בשנת אחסון תמונה, בחר סטאק.
    14. תמונה עדכן תיבת חלון צריך להיבדק, אבל לא את שני תיבות מתחתיו.
    15. בחר "Illum" להיות "למבדה".
    16. לחץ על "אישור".
    17. הסרט יהיה עכשיו להתחיל לרוץ. זאת אומרת ששום דבר אחר יכול להתבצע במסגרת תוכנית MetaMorph עד מסיים את הסרט או עד שתפסיק את הסרט מוקדם על ידי לחיצה על Esc, ולאחר מכן הסרט אז יהיה להפסיק בכל שלב הרכישה הבאה מתוזמן.
    18. בסוף הסרט, לבדוק פציעה התא על ידי הקרנת Sytox כאמור לעיל (א ').

3. הפקת רנ"א עבור ברמה נמוכה ציטוקין איתות 11-15

  1. אנחנו קודם לכן הציג הנחיות מפורטות לאיתור ברמה נמוכה ציטוקינים איתות בתרבויות פרוסה qPCR באמצעות טכניקות PCR במערך. 6,7
  2. שיפרנו באופן משמעותי את הרגישות של גישות שלנו לגילוי ציטוקינים mRNA בתרבויות פרוסה ולהציג שיפורים אלו כאן.
  3. השיפורים כוללים את הגישה שלנו הקציר רקמות בידוד RNA, prescreening של דגימות הגידול גורם נמק אלפא (TNF-α) שינוי, preamplfication cDNA, אשר ~ 6 פעמים רגיש יותר טכניקות הקודם, למשל, לאפשר זיהוי של הפעם הראשונה של התרבות פרוסה interferon-gamma (IFN-λ) זיהוי. 15
  4. PCR הכנה.
    1. תרבות Slice הקציר.
      1. בעקבות הניסויים, תרבות מוסיף פרוסת שקועות 2-3 מ"ל RNA כעבור המאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים עד לעיבוד נוסף.
      2. כדי הקציר, להסיר זרים (כלומר, כל הרקמות הסמוכות בהיפוקמפוס תקין) רקמות באמצעות סכין יהלום להרים את פרוסות לתוך הפרט RNase / DNase חופשית 1.5 צנטריפוגות מבחנות המכילות 0.5 מ"ל פוספט מ"ל סטרילי בופר סליין (PBS) באמצעות צבע היטה קנס מברשת.
      3. דגימות ספין (10,000 סל"ד x 1 דקות) בצורה סטריאוטיפית פרוסות כל כך לדבוק באותו צד של צינורות שלהם.
      4. הסר PBS supernatant מדגם resuspend ב TRIzol 500 μL.
      5. דגימות חנות ב -80 ° C, או לשמור על הקרח עד מיצוי RNA.
    2. RNA מיצוי usingTRIzol עם תוצאות RNeasy ערכת מיקרו RNA בתשואה גבוהה יותר (איור 4) מאשר השימוש בערכה לבד.
      1. הפשירי TRIzol-דגימות דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. לנתק את הרקמה על ידי ציור דגימות למעלה ולמטה עם 1 מ"ל היטה pippetor ו / או vortexing עד רקמה מוצק אינו גלוי.
      3. הוספת 100 μL RNase חינם (RF) כלורופורם להפוך צינור 2-3 פעמים כדי לערבב.
      4. דגירה 3 דקות על טמפ החדר, כל vortexing דקות.
      5. צנטריפוגה 13,000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C.
      6. העברת supernatant אל צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל. היזהר לא להפריע ממשק.
      7. הוסף נפח שווה לטמפרטורת החדר RF 70% הביולוגיה המולקולרית כיתה אתנול (~ 300 μL).
      8. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
      9. המשך עם השלבים הבאים לכל הכיוונים RNeasy מיקרו בערכה:
        1. החל מדגם לעמודה מיקרו RNeasy להציב collectio 2mln צינור.
        2. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        3. לשטוף טור RNeasy עם RW1 350 חיץ μL.
        4. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        5. הוסף 10 UL DNase 1 פתרון המניות RDD 70 חיץ μL, מערבבים בעדינות.
        6. החל 80 μL של פתרון DNase ישירות על גבי הממברנה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
        7. לשטוף טור RNeasy עם RW1 350 חיץ μL.
        8. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך צינור.
        9. הוספת 500 הרשתית חיץ μL לעמודה RNeasy.
        10. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        11. הוספת 500 μL RF 80% אתנול ביולוגיה מולקולרית כיתה לעמודה RNeasy.
        12. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 2 דקות, לבטל את הזרימה דרך הצינור.
        13. מקום בעמודה RNeasy צינורות חדשה עם כמוסות פתוח.
        14. צנטריפוגה במלוא המהירות (כלומר, 14,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
        15. העברת עמודה RNeasy לצינור microcentrifuge RF.
        16. החל מים 14 RF μL ישירות הממברנה.
          1. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 דקות 1 עד elute.
          2. דגימות חנות ב -80 ° C או להמשיך לשלבים הבאים.
    3. RNA כימות.
      1. מדולל RiboGreen 1:200 ב-RF 1x טריס-EDTA (TE) חיץ.
      2. הכן tRNA שמרים לשמש תקן RNA.
        1. מלאי עבודה מאוחסן -20 ° C ב 100 מיקרוגרם / מ"ל
        2. מדולל ל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(10 μL ב TE 990 μL).
        3. יצירת סטנדרטים כדלקמן: עבור 100 ng / μL, להוסיף 100 μL, עבור 80 ng / μL, להוסיף 80 tRNA μL 20 ו TE μL, עבור 60 ng / μL, להוסיף 60 tRNA μL 40 ו TE μL, עבור 40 ng / μL להוסיף 40 tRNA μL 60 ו TE μL, עבור 20 ng / μL להוסיף 20 ו 80 tRNA μL TE μL, ובמשך 0 ng / μL להוסיף 100 TE μL.
      3. הכן דוגמאות:
        1. שלב 99 μL TE + 1 מדגם μL.
        2. הפעל כל מדגם כפולים.
      4. שימוש pipettor מרובת ערוצים, להוסיף 100 μL של RiboGreen המדולל היטב.
      5. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
      6. מדידת הקרינה על הקורא צלחת.
        1. והעמסת (485 ננומטר nm/535, 0.1 שניות) בתוכנית.
        2. ייצוא התוצאות לתוך גיליון אלקטרוני של Excel.
    4. קביעת ריכוז RNA.
      1. גרף לספיגה לעומת ריכוז רנ"א ליצור קו מיטבית רגרסיה ליניארית ב-Excel.
      2. קביעת ריכוזי מדגם RNA מן המשוואה רגרסיה הקשורים קו מיטבית.
    5. קביעת איכות RNA.
      1. RNA ריבוזומלי שלמות הלהקה נמדדת באמצעות agarose ג'ל (איור 4).
        1. למרות שזה אינו מעשי לרוץ שבריר של כל דגימה RNA שהושג (מאז = 1 מיקרוגרם של רנ"א נדרש התשואות שלנו הם קטנים), הוא רעיון טוב מדי פעם להפעיל ג'ל denaturing agarose על מדגם למופת כהוכחה לכך השיטה כאשר נעשה כראוי, תשואות גבוהות איכות RNA (כלומר, ללא השפלה).
        2. הכן 1% agarose ג'ל (עבור נפח של 100 מ"ל).
          1. נקו את מיכל אלקטרופורזה, הליהוק מגש ג'ל מסרקים ביסודיות עם RNase מפה.
          2. לשקול את 1 גרם של ultrapure agarose לתוך בקבוק.
          3. הוסף 83 מ"ל מים RNase חופשי 10 מ"ל של מגבים 10x [3 - (N-Morpholino) propanesulfonic חומצה] חיץ ומיקרוגל עד agarose מתמוסס פתרון ברור (~ 3 דקות).
            1. כדי להפוך 10x חיץ מגבים
              1. מערבבים 83.7 מגבים גרם, 13.6 גרם נתרן אצטט, ו - 3.7 גרם EDTA.
              2. מוסיפים 800 מ"ל מים RNase בחינם, לערבב לפזר.
              3. התאם ל-pH 7.0 ולמלא עד 1 ל
              4. סנן לעקר או החיטוי.
              5. אחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
          4. אפשר ג'ל להתקרר 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים 7 פורמלדהיד מ"ל 37% (שלב זה יש לעשות במנדף כימי קטר).
          5. יוצקים לתוך הג'ל הליהוק מגש לאפשר ג'ל לחזק בשכונה.
        3. הכן את דגימות רנ"א.
          1. RNA חיץ המדגם (500 μL, להפוך את טרי).
            1. שלב 50 מגבים 10x μL, 250 לפוראמיד μL, 90 פורמלדהיד 37% μL, 108 μL RF H ​​2 O ו - 2 μL ברומיד ethidium (פתרון המניה 10 מ"ג / מ"ל).
          2. כדי 10-10 מיקרוגרם של רנ"א, להוסיף כפול נפחו באמצעות חיץ המדגם, על דילול פי שלושה.
          3. לפגל על ​​95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על קרח למשך 5 דקות.
          4. ספין briefly עומס המדגם מלא לתוך בארות לצד סולם RNA (להוסיף צבע טעינת אם רוצים).
        4. Electrophorese
          1. מלאו קאמרית עם חיץ מגבים 1x.
          2. Electrophorese ב 50-75 וולט עד סמנים היגרו על אורך 2/3rd של הג'ל.
        5. דמיינו את הג'ל על transilluminator UV.
          1. ודא כי יש 18S חדה -28 RNA ריבוזומלי (rRNA) להקות, וכי הלהקה -28 כפול חזק כמו הלהקה 18S (איור 4).
          2. RNA מושפל יהיה מראה מרוח, להקות מטושטשת, או לא יציגו יחס 02:01.
    6. בדרך כלל אנו משתמשים כדי להעריך את צפיפות אופטית מסך באיכות RNA.
      1. אמנם לא רגיש, לספקטרופוטומטריה UV באמצעות Nanodrop היא אמצעי יעיל ומהיר העלות של בדיקת איכות RNA.
      2. חפש צפיפות אופטית (OD) 260/280 יחס של 1.5-2.0.
      3. זכור כי הפתרון שבו RNA הוא resuspended (TE חוצץ נגד מים) ישפיע על היחס OD.
  5. PCR פעילויות.
    1. Pre-PCR ההתקנה
      1. עיצוב פריימרים ספציפיים
        1. שימוש Primerblast של צמח השדה http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. הזן Refseq את הגן של היעד מספר להצטרפות.
          2. ציין גודל PCR מוצר של 70-200 נ"ב.
          3. ציין אני של ° 55-72, עם הבדל פחות מ 5 ° בין primers קדימה לאחור.
          4. בחר "פריימר יש תוחלת צומת אקסון אקסון," כדי להפחית רקע גנטי.
          5. אפשר לבדוק הספציפיות עבור מסד הנתונים עכברוש RNA Refseq על מנת להבטיח כי primers אינם מכירים מטרות נוספות.
          6. בחר זוג פריימר מתוצאות שמתאים הקריטריונים הבאים:
            1. 18-30 בסיסים ארוכה.
            2. פחות מ 2,000 בסיסים בנפרד על התבנית שלך.
            3. 40-60% גואנין, ציטוזין תוכן כדי להבטיח מחייב יציבה של פריימר על התבנית.
      2. בחירת גן התייחסות.
        1. לא כל גן התייחסות יהיה מתאים הניסוי שלך להגדיר. בכל פעם פרדיגמה חדשה משמש, היציבות של הפניה שלך צריך להיות מאומת. עבור עקביות, בחרנו להשתמש באחד הגנים הייחוס של ארבע מסופק על מערך 2 RT-PCR Profiler.
        2. גן התייחסות טובה צריכה לענות על הקריטריונים הבאים:
          1. רמת הביטוי שלו לא משתנה על ידי פרדיגמה ניסויית.
          2. זה בא לידי ביטוי ברמות דומה לזה של הגן היעד.
        3. כדי לבחור התייחסות מתאימה:
          1. סקירת הספרות כדי לזהות המועמדים האפשריים עבור גן התייחסות יציב במערכת שלך. לדוגמה, בדקנו Rpl13a משום שהיא הוצגה להיות יציב במחקרים של איסכמיה. 11,12
          2. Primers עיצוב כפי שפורט לעיל (או למצוא primers שכבר תוקף עבור גנים התייחסות משותף באתר כמו RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. לצד מטב primers primers גן היעד (ראה להלן).
          4. קבע איזה התייחסות מועמד הוא היציב ביותר באמצעות תוכנה כמו Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) המחשבת ערך יציבות עבור כל גן על בסיס השונות intragroup ובוחר את הגן (ים) עם הביטוי לפחות וריאציה על הדגימות. לדוגמה, Rpl13a הוא הגן התייחסות אופטימלית SD (איור 4).
      3. מטב primers.
        1. כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות מבית qPCR, primers צריך לעמוד בקריטריונים מסוימים, שחזור סגוליות רגישות,.
          1. מומלץ לבדוק את הפרמטרים הללו עבור כל זוג פריימר חדש.
          2. Reproducibility נבדק על ידי הפעלת טכני משכפל.
          3. רגישות ניתן להעריך על ידי ביצועים עם עקומת סטנדרט של 4 פי דילולים רצופים.
          4. הספציפיות נקבעת על ידי אישור מוצר אחד על ידי ניתוח עקומת להמיס ג'ל אלקטרופורזה (איור 5).
        2. הפעל צלחת qPCR כדי לבדוק את איכות primers שלך, את הריכוז של primers לשמש.
          1. שימוש cDNA מסונתז מן המוח כולו RNA, ליצור עקומת סטנדרט (סדרה של 4 פי דילולים ברציפות) כדלקמן: 1, 1:04, 1:16, 1:64, 1:256, ולא לשלוט התבנית (NTC) .
          2. במשך כל דילול, לרוץ 1 μL cDNA ב duplicate ריכוז כל primers, (כלומר, 100 ננומטר, 200 ננומטר, 300 ננומטר).
        3. ודא טכני משכפל לתת עקבי ערכי CT.
        4. בדוק ערכים עבור Ct עקומת דילול.
          1. מגרש הערכים Ct כנגד ריכוז עבור כל אחד דילולים. הגרף שנוצר צריך להיות ליניארי עם מקדם קורלציה טובה (כלומר,> 0.95).
        5. בדוק להמיס עקומה כדי לאשר את קיומו של מוצר הגברה בודד (כלומר, שיא יחיד).
          1. אם יש מספר רב של פסגות, פסגות או אינם דומים, זה עשוי להציע זיהום, mispriming פריימר-dimer חפץ, וכו '(איור 5).
          2. שיא NTC צפוי מתאימות הדימרים פריימר המהווים יותר בקלות בהעדר תבנית cDNA, ולא צריך להיות חשש.
        6. אשר להמיס עקומת נתונים לפתרון מוצרים מוגבר על ג'ל agarose 1%.
          1. הכן 1% agarose ג'ל (עבור נפח של 100 מ"ל)
            1. לשקול את 1 גרם של agarose לתוך בקבוק.
            2. מוסיפים 100 מ"ל של חיץ 1x טריס-Acetate (טה) EDTA ומיקרוגל עד agarose מתמוסס פתרון ברור.
              1. 1 L 50x טה המאגר מורכב מ 2 טריס בסיס, 57 מ"ל חומצה אצטית קרחונית, ו 0.05 M EDTA (pH 8.0).
              2. מדולל חיץ טה כדי 1x עם מים מזוקקים (ריכוז סופי: 40 מ"מ טריס-אצטט ו 1.0 mM EDTA).
            3. אפשר ג'ל להתקרר 55 מעלות צלזיוס לפני הוספת ברומיד ethidium לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל.
            4. יוצקים לתוך הג'ל הליהוק מגש ולאפשר לו לגבש בטמפרטורת החדר.
          2. כדי להפעיל, במקום ג'ל אלקטרופורזה בחדר מלא 1x טה, לשלב 10 μL המדגם מהצלחת qPCR עם μL 2 של צבע טעינת 6x, מערבבים היטב לטעון לתוך בארות לצד סולם משקל מולקולרי.
          3. Electrophorese ב 50-150 וולט עד סמנים היגרו מרחק מתאים, בהתאם לגודל הצפוי של המוצר cDNA שלך.
          4. דמיינו עם transilluminator UV.
          5. ודא מוצר מוגבר PCR הוא בגודל מתאים היעד שלך.
          6. הדימרים פריימר יהיה סביב 50 נ"ב.
    2. טרום המסך גדל TNF-α.
      1. מאז TNF-α יוזם תגובות דלקת בפריפריה, אנו חושדים זה נכון גם לגבי המוח ושימוש סינון ראשוני של mRNA TNF-α כסמן מעמד פרוסה תרבות החיסונית (כלומר, רגיל, דמה, וקבוצות הניסוי) לפני שתמשיך אל מלא מנתח PCR במערך.
      2. אם נורמלי דמה לשלוט TNF-α רמות ה-mRNA שאינם בטווח interassay נמצא בתוך המעבדה שלנו, ניסויים (כלומר, רגיל, דמה, וקבוצות ניסיוני) מבוטלים ואינם להמשיך מלא מנתח PCR במערך.
      3. iScript cDNA סינתזה.
        1. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR: 4 תגובה μL לערבב 5x, 1 transcriptase הפוכה μL, 25 ng-RNA, ו-RF H 2 O לנפח סופי של 20 μL.
        2. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
        3. דגירה: 25 ° C, 5 דקות, 42 ° C, 30 דקות, 85 ° C, 5 דקות.
        4. מדולל 01:04 (60 μL להוסיף מים RNase חינם).
        5. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
      4. qPCR עבור TNF-α.
        1. הכינו תערובת אב כל זוג פריימר.
          1. מערבבים 12.5 μL IQ SYBR ירוק, לערבב 1 פריימר μL ו 10.5 מים μL לדגימה.
          2. עבור שני Rpl13a שלנו TNF-α primers, 200 ננומטר הוא הריכוז האופטימלי.
          3. התאם את כמות primers ונפח waster כנדרש על צינור 1.5 microcentrifuge RF מ"ל ולשמור על הקרח בעוד שהגדרת את הצלחת.
        2. הגדרת הצלחת qPCR עם פקדי / שמס / experimentals. השתמש 1 μL המדגם לכל cDNA בשני עותקים של כל גן.
        3. הוסף 24 μL תמהיל המאסטר שלכם היטב כל פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
        4. היזהר מאוד כדי למנוע בועות, כפי שהם יפריעו קריאות הקרינה.
        5. הפעלה 40 מחזורים של PCR הגברה:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 מחזורים: 95 ° C, 10 שניות; 60 ° C, 30 שניות; 72 ° C, 20 שניות / מחזור.
          3. ממיסים עקומה: 55 ° C, 1 דקות, 80 מחזורים של 0.5 במרווחים מעלות צלזיוס למשך 10 שניות כל אחד החל מ 55 ° C.
      5. ניתוח נתונים (שיטה ΔΔCt;. איור 4). 13
  6. סינתזה cDNA עבור מערכי ה-PCR.
    1. חישוב נפח (μL) של מדגם זה יש 250 ננוגרם של רנ"א.
      1. בחר סכום של RNA (100 ננוגרם ל 1 מיקרוגרם) שניתן באופן עקבי לחלץ דגימות שלך.
    2. RT 2 ערכת סטרנד ראשון - לפי הוראות היצרן. בקצרה:
      1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
      2. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR:
        1. 250 ננוגרם של רנ"א, 2 μL של ה-DNA הגנומי 5x (gDNA) חיץ חיסול מים לנפח סופי של 10 μL.
      3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
      4. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      5. צ'יל על קרח דק 1.
      6. בינתיים, מכינים את שעתוק לאחור (RT) קוקטייל (מדגם לכל):
        1. שלב 4 μL של 5x RT חוצץ 3, 1 פריימר μL ומערבבים בקרה חיצונית, לערבב 1 μL האנזים RT 3, 3 μL של מים.
      7. הוסף 10 μL של קוקטייל RT לטעום כל ומערבבים בעדינות.
      8. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      9. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      10. הוסף 91 μL של RF H ​​2 O לתגובה זו סינתזה μL 20 cDNA (לדלל לנפח הסופי של μL 111).
      11. מערבבים היטב על ידי pipetting.
      12. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
  7. RT 2 Profiler מערך ה-PCR.
    1. ההוראות הבאות לעקוב לאלה של היצרן והם חזרו כאן לנוחות.
    2. הכן ריאגנטים
      1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
      2. הכינו קוקטייל ניסיוני:
        1. שלב 1350 μL של 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR גרין מאסטר מיקס, 102 μL של cDNA בדילול מלא ו 1248 μL RF של H 2 O לנפח הסופי של μL 2700.
      3. מוציאים בזהירות מערך ה-PCR מן שקית אטומה.
      4. לוותר על הקוקטייל לתוך מאגר הטעינה.
      5. הוסף 25 μL היטב עם כל pipettor מרובת ערוצים.
      6. בזהירות חותם PCR הצלחת המערך.
      7. צנטריפוגה את הצלחת בסל"ד 10,000 1 דקות בטמפרטורת החדר.
      8. מניחים על הקרח עד PCR תוכנית מוכנה.
    3. הפעל את תוכנית רכיבה המתאימה למחשב שלך.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 דקות
        2. 40 מחזורים: 95 ° C, 15 שניות; 60 ° C, 1 דקות.
        3. ממיסים עקומה: 55 ° C, 1 דקות, 80 מחזורים של 0.5 ° C במרווחים של 10 שניות כל אחד החל מ 55 ° C
    4. ניתוח נתונים.
      1. בחר "אוטומטי מחושב" על בסיס מחזורי.
      2. בחר "מוגדר משתמש" לתפקיד סף להגדיר באופן ידני את ערך הסף.
        1. ב "הצגת יומן", קבע סף התחתון שליש שלב ליניארי של העלילה הגברה.
        2. הקפד לשמור סף ערך זהה לרוחב פועל.
      3. ייצוא נתונים.
      4. קלט לקובץ Excel.
      5. טען ניתוח SABiosciences PCR מערך נתונים.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. בחר גנים הפניה - השתמשנו Rpl13a.
      6. התרגול שלנו הוא:
        1. לאשר את התוצאות עם לפחות מערך ה-PCR כפולים.
        2. 3 פי השינויים במערך לא צריך להיות מאושרת על ידי הבאים הגברה יעד ספציפי PCR. 6,7
        3. שינויים פחות מ -3 פי צריכה להיות מאושרת על ידי הבאים הגברה יעד ספציפי PCR או שימוש 2-3 מערכי ה-PCR (כדי לאשר את השינויים 2x.
    5. ה-DNA מראש הגברה משמש לנתח מטרות בהבעת Ultra-Low צפוי (איור 6).
      1. RT של SABiosciences 2 ננו סינתזה קדם מגבר ערכת cDNA ו מתערבב פריימר מיועדים מראש הגברה של רנ"א כדי לאפשר שימוש בכמויות קטנות (100-100 ng) של רנ"א מדגם להפעיל מערך מלא PCR.
      2. כל תערובת פריימר מאפשר הגברה של 89 גנים ספציפיים תבניות היעד cDNA עם הטיה מינימלית. השתמשנו במערכת זו כאמצעי להגברת אותות ברמה נמוכה כגון IFN-λ לרמה detectible.
      3. RT 2 ננו סינתזה קדם מגבר ערכת cDNA - לפי הוראות היצרן. בקצרה:
        1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
        2. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR.
          1. 1-100ng של רנ"א, 2 μL של החיץ חיסול 5x gDNA מים לנפח סופי של 10 μL.
        3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
        4. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        5. צ'יל על קרח דק 1.
        6. בינתיים, להכין את הקוקטייל RT (לפי המדגם).
          1. שלב 4 μL של 5x RT חוצץ 3, 1 פריימר μL ומערבבים בקרה חיצונית, 1 סינתזה μL cDNA לערבב האנזים 1 μL מעכב RNase, ו 3 μL של מים.
        7. הוסף 10 μL של קוקטייל RT לטעום כל ומערבבים בעדינות.
        8. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
        9. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        10. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.
      4. cDNA הגברה עם פריימרים ספציפיים.
        1. מערבבים את הבאים צינור PCR:
          1. 12.5 μL PCR לערבב שני, 7.5 פריימרים ספציפיים μL, ו 5 μL של cDNA חי.
        2. הפעלה 12 מחזורים של הגברה PCR.
          1. 95 ° C, 10 דקות.
          2. 12 מחזורים: 95 ° C, 15 שניות; 60 ° C, 2 דקות.
          3. תחזיק ב 4 ° C.
        3. הוסף תגובה 2 כמפחית μL צד מדגם זה.
        4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
        5. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        6. הוסף 84 מים RF μL לתגובה כל הגברה μL 27 cDNA.
      5. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
      6. Amplify מטרות גנים בודדים באמצעות SAB primers ו SYBR ירוק לערבב מאסטר כפי שתואר לעיל.

4. Phosphoprotein מבחני Multiplexed איתות של ציטוקין

  1. מבחני phosphoprotein Mutliplexed משמשים להגדיר ליגנד לקולטן ציטוקינים במורד איתות (איור 7).
  2. קביעת כמות החלבון הכולל בתרבויות פרוסה.
    1. פרוסה קציר תרבויות על ידי הרמת הפרוסות בעדינות מעל מוסיף ומניחים 1 מ"ל קר (4 ° C) PBS.
    2. צנטריפוגה צינורות למשך 30 שניות ולהסיר PBS. מניחים על קרח יבש עד גמר הקציר.
    3. חנות ב -80 ° C.
  3. Homogenize תרבויות פרוסה עבור assay החלבון הכולל.
    1. הכן תמוגה חוצץ התא בהתאם להוראות היצרן.
      1. הוסף מעכבי הפרוטאז כדי בהיקף כולל של חיץ צריך מקום לפחות 200 μL של חיץ תמוגה על תרבות כל פרוסה.
        1. לדוגמה: להוסיף 20 μL של 1 פקטור, 10 μL של פקטור 2, ו - 20 μL של 500 מ"מ PMSF ב DMSO על 4.95 חיץ תא מ"ל תמוגה.
    2. הפשירי תרבויות פרוסה במאגר 200 תמוגה μL על הקרח.
    3. Sonicate תרבויות פרוסה חמש פעמים 1 פולסים שניות ואת המקום מיד בחזרה על הקרח.
    4. וורטקס דגימות עבור 10 שניות.
    5. צנטריפוגה דגימות 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בסל"ד 13,000.
    6. העברת supernatant לצינור נקי ולשמור על הקרח.
  4. בצע assay החלבון הכולל.
    1. הכנת תקנים חלבון.
      1. המניות מחדש שור בסרום אלבומין (BSA) על פי הוראות היצרן.
      2. הכנת תקנים החל 0-1000 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל במים הטוהר גבוהה עבור assay חלבון BCA.
    2. חישוב נפח של מגיב עובדים על בסיס צורך במספר דגימות משכפל.
      1. לדוגמה: (8 תקנים + 18 דגימות לא ידוע) x (2 משכפל לדגימה) x (0.2 מ"ל מגיב היטב לכל עובד צורך) = 10.4 נפח מ"ל הכולל את כל הדרוש דגימות הועמסו על microplate.
        1. סיבוב עד נפח הכל 12 מ"ל, כדי להבטיח מספיק נפח.
      2. כאשר מגיב ערבוב עם B מגיב על מגיב העבודה, עכירות מסוימים עשויים להתרחש, אבל צריך להיעלם בקרוב.
    3. טען 10 μL של דגימות תקני לכל טוב.
    4. טען 0.2 מ"ל של ריאגנט עובד לתוך בארות.
    5. מכסים בצלחת עם הקלטת איטום ללחוץ למשך 30 שניות כדי לערבב.
    6. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. צלחת מצננים לטמפרטורת החדר (כ 10 דקות) לפני קריאת על הקורא צלחת באורך גל 595 ננומטר.
    7. בניית עקומת סטנדרט באמצעות Microsoft Excel עם ספיגת נמדד ריכוז לעומת הצפוי.
      1. מקדם המתאם טוב שווה או גדול מ 0.98.
    8. חישוב ריכוז חלבון בדגימות באמצעות משוואה ליניארית נגזרת עקומת הסטנדרטי.
    9. מדולל דגימות למאגר תמוגה על כמויות שוות של חלבונים חנות ב -80 ° C עד מוכן להמשך עיבוד.
    10. ריכוז חלבון יש טווח 2-900 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאם להוראות היצרן.
  5. בצע Assay Multiplex.
    1. הערה: מבחני phosphoprotein multiplexed לקחת 2 ימים סה"כ כדי להשלים, עם שעה 1 של הראשוני הגדרת וטעינה של צלחת ואחריו incu לילהצעד bation ו הדגירה לשטוף צעדים נוספים למחרת.
    2. מפת אילו בארות יכיל אשר lysate לפי גליון במדריך.
    3. הפשירי דגימות רקמה הומוגני ו lysates ערכת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם על הקרח. תביאו את כל buffers ו ריאגנטים המסופק בערכה לטמפרטורת החדר (למעט streptavidin וחרוזים).
    4. הכינו חרוזים עבור assay זמנית.
      1. כיסוי צינורות המכילה חרוזים, בשילוב עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. וורטקס צינורות במשך 5 שניות ולשמור על הקרח.
      2. מדולל בשילוב חרוזים 1:50 במאגר לשטוף.
        1. כל טוב אמור להכיל 1 μL של חרוזים בשילוב במאגר לשטוף μL 49 עבור בהיקף כולל של 50 μL לכל טוב.
    5. כייל את מנגנון ואקום.
      1. לשטוף את הצלחת עם חיץ 100 μL לשטוף היטב לכל.
      2. הפעל ואקום יניקה את כל עודף נוזלים בתוך 2-5 שניות.
        1. אם הסרה מלאה של המאגר לוקח זמן רב יותר או קצר יותר מאשר 2-5 שניות, להתאים את שסתום הלחץ בהתאם.
        2. יבש בתחתית הצלחת ביסודיות לפני הוספת דגימות.
    6. וורטקס החרוזים יחד מדולל למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μL לבארות המיועד.
      1. מיד ואקום מסנן ויבש התחתון של צלחת עם מגבת נייר.
    7. לשטוף את הצלחת פעמיים עם חיץ 100 μL לשטוף היטב לכל. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    8. וורטקס מופשר דגימות במשך 3 שניות ומוסיפים 50 μL לבארות המיועד. המקום איטום סרט על צלחת דגירה של 15-18 שעות רועד בסל"ד 300 בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    9. נוזל מסנן אבק עודף צלחת לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 100 לשטוף μL. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    10. מדולל נוגדן 01:25 גילוי מאגר לשטוף.
      1. גם כל דורש 1 נוגדן איתור μL בהיקף כולל של 25 חיץ לשטוף μL.
    11. מניחים על הצלחת הקלטת איטום ולהגן מפני האור עם רדיד אלומיניום. Shake למשך 30 שניות, מהירות בהדרגה עד 1100 סל"ד. המשך רועד בסל"ד 300 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. אבק לסנן את הצלחת לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 100 לשטוף μL. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    13. תוך הגנה על צלחת מן האור, להכין דילול של 1:100 streptavidin-PE עם נפח מספיק כדי להוסיף 50 μL לכל טוב. הגן על פתרון מן האור.
    14. וורטקס ביסודיות להוסיף 50 μL בדילול streptavidin-PE לכל טוב. דגירה עם רועד בסל"ד 1100 למשך 30 שניות ולאחריה 10 דקות ב 300 סל"ד.
      1. עודף מסנן אבק חיץ משם.
      2. לשטוף את צלחת שלוש פעמים עם חיץ 100 resuspension μL לכל טוב.
      3. יבש בתחתית הצלחת לשטוף ביסודיות לאחר כל אחד.
    15. הוספת 125 חיץ resuspension μL היטב כל ולנער במשך 30 שניות ב 1100 סל"ד.
    16. מיד לקרוא צלחת או לאחסן ב 4 ° C מן האור עד 24 שעות.

5. חיקוי ו אפנון של איתות ציטוקין

  1. חלבונים ציטוקינים רקומביננטי (עם הספק) משמשים לחקות שינויים של SD.
    1. חלבונים Lyophilized (למשל, TNF-α) מאוחסנות עד 1 שנה -20 ° C.
    2. לאחר דילול לפתרון מניות עם 0.1% שור בסרום, aliquots אלבומין מוכנים, המאוחסן ב -20 ° C, עד לשימוש תוך 3 חודשים.
    3. כל המניפולציות לתרבויות פרוסה עוברים רענון לפחות בכל יום שלישי.
  2. איתות ציטוקין מושתק על ידי:
    1. השימוש המסורתי ציטוקינים איתות סוכני מפל תרופתי;
    2. השימוש אנטגוניסט ליגנד מסיס [למשל, קולטן מסיס TNF 1 (כפי שתואר לעיל עבור ligands רקומביננטי)]; או
    3. Gene השתקה [כלומר, התערבות קטנה RNA (siRNA)].
  3. משלוח של siRNA תאים עצביים הוא לעתים קרובות בעייתי.
    1. Common השומנים מבוסס ריאגנטים בדרך כלל תוצאה של יעילות transfection נמוך ואובדן כדאיות התא.
    2. במקום זאת, אנו משתמשים Dharmacon של Thermo Scientific siRNAs Accell, המאפשרים מציאה יעילות גבוהה ללא השימוש מגיב transfection.
    3. כאן אנחנו מראים מציאה של cyclophilin B, חלבון שאינם חיוניים לידי ביטוי בכל סוגי התאים, כאישור של השימוש בשיטה זו בתרבויות פרוסה.
    4. פרוטוקול מסירה הותאם עבור תרבויות פרוסה מן ההוראות של היצרן לשימוש בתאי חסיד.
      1. מדולל חיץ siRNA 5x כדי 1x עם מים RNase חינם.
      2. הכן פתרון siRNA 100μM במאגר 1x
        1. SiRNA Cyclophilin B מסופק על nmol 5. Resuspend ב 50 μL של חיץ 1x עבור המניות 100 מיקרומטר.
      3. מערבבים עם siRNA Accell משלוח mediuמ הריכוז הסופי של siRNA 1μM.
        1. הוסף 11 μL של siRNA 100 מניות מיקרומטר עד 1100 μL בינוני מסירה Accell בצלחת 6 באר.
        2. מקום בחממה ולאפשר טמפרטורה לאזן לתנאי הדגירה נורמלי לפחות 20 דקות.
      4. שימוש ברדס BSL-2 ו טכניקה סטרילית, מוסיף העברת לתערובת המכילה את המסירה בארות.
        1. דגירה בתערובת מסירה עבור 96 שעות עבור מציאה חלבון.
          1. הערכת מציאה חלבון על ידי כתם המערבי או הגבירו immunostaining.
          2. כתמים המערבי, בעוד הבחירה הראשונה פוטנציאל יעילות מציאה, עשוי להיות רגיש מדי ברמה נמוכה איתות החיסונית קשורה לתופעה הלא מזיק של SD.
          3. לפיכך, אנו עוקבים שליליים מדידות כתם המערבי עם immunostaining כסף משופרת (DAB) diaminobenzidine והמחשב מבוסס מדידות צפיפות (ראה להלן).

6. Proteomic אישורים

  1. סגוליות Cell שינויים phosphoprotein הוא הוקם באמצעות immunostaining. 6,7
    1. תקן תרבויות פרוסה למשך 24 שעות עם PLP מיצב המורכב:
      1. Paraformaldehyde 10 מ"ל 16%, 1.096 גרם ליזין, פוספט 0.42 גרם נתרן 0.17 גרם נתרן periodate, מלא עד נפח כולל של 80 מ"ל עם מים ultrapure (מקבע הוא 6.2 pH).
      2. לאחר 24 שעות, להסיר בעדינות תרבויות פרוסה מן מוסיף את במכחול דק להעביר אזיד הנתרן PBS המכיל (100 מ"ג / ליטר) עד מוכן סעיף.
      3. ואז, דגירה פרוסות לפחות 24 שעות ב-PBS סוכרוז 20%, לחתוך פרוסת תרבויות שלמות 20 סעיפים מיקרומטר, ו הר לשקופיות ג'ל מצופה.
      4. Immunostaining פלורסנט (למשל, עבור NFκB) מתבצע כדלקמן עם כל הצעדים מצמידים את רועדת ~ 50 סל"ד.
        1. לשטוף תרבויות פרוסה 3 מ"ל PBS שלוש פעמים 10 דקות.
          1. מגלשות המקום רכוב עם 20 מיקרומטר תרבויות פרוסה בצנצנות Coplin עם ~ 40 מ"ל PBS עבור כל הצעדים לשטוף.
        2. לשטוף תרבויות פרוסה PBS שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
        3. מניחים כמה טיפות של SFX אות משפר על תרבויות פרוסה דגירה בתא לח למשך 30 דקות.
        4. דגירה תרבויות פרוסה עבור 2 שעות ב 37 ° C עם נוגדן אנטי NFκβ ארנב בבית 1:100 בדילול מלא 0.75% Triton X-100 ב PBS.
          1. פיפטה פתרון הנוגדן ישירות על גבי פרוסות.
        5. הסר פרוסות מפתרון נוגדן לשטוף שלוש פעמים PBS עבור 10 דקות לכל לשטוף.
        6. דגירה פרוסות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת נגד ארנב נוגדן עז 594 AlexaFluor בשעה 1:50 ב 0.75% Triton X-100 ב PBS.
          1. צנטריפוגה AlexaFluor 594 הנוגדנים במשך 15 דקות בסל"ד 10,000 להסיר כל המשקע שאולי נוצר פתרון.
        7. לשטוף שלוש פעמים PBS, 10 דקות לכל לשטוף.
        8. טובלים שקופיות מים מזוקקים כדי לשטוף את כל המלחים מן PBS.
        9. Coverslip עם להאריך בינוני antifade ולתת להתייבש לפחות 2 שעות, מכוסה מן האור.
        10. דמיינו עם מיקרוסקופיה (איור 7) מסורתי או confocal פלואורסצנטי.
  2. ייצור חלבון השינויים מציאה siRNA ניתן להעריך על ידי שיפור ברגישות DAB המסורתית immunostaining 7 דרך התעצמות כסף 16 וכימות densitometric עוקבות (למשל, כפי שמוצג כאן cyclophilin ב) (וידאו איור 2).
    1. Immunostaining עבור cyclophilin B בעקבות הליכים תקן הדמיה בתחום בהיר אנו מפורט לאחרונה, 7 באמצעות:
      1. אנטי עכבר cyclophilin B (1:100) עבור 24 שעות 4 מעלות צלזיוס;
      2. ואחריו תיוג חזרת peroxidase משני נוגדנים (1:100);
      3. וגם DAB להדמיה.
    2. f התגובות DAB חלשים מכדי לאפשר quantification17 densitometric דיגיטלי, הם יכולים להיות התעצמה עם הליך כסף מובחן על פי קווין Graybiel 16.
      1. רעננותם שקופיות ולאחר מכן לשטוף ביסודיות x 3 למשך 10 דקות במים הטוהר גבוהה.
      2. המקום מגלשות מים טוהר גבוהה בצנצנת Coplin וחם כדי 56 ° C.
      3. הכן כסף חנקתי ammoniacal פתרון (0.5%):
        1. אמוניום כלוריד במלאי (25-30%) הוא טרי מדולל (1:1) עם מים טוהר גבוהה.
        2. הוסף אמוניום הידרוקסיד (~ 500-600 μL 100 מ"ל) טיפה אחר טיפה עם ערבוב של פתרון 0.5% כסף חנקתי אשר בקצרה להפוך מעוננים ברור אז.
        3. חם הפתרון 56 ° C.
        4. דגירה סעיפים 10-12 דקות.
      4. לשטוף שקופיות למשך 15 שניות במים הטוהר גבוהה (זה כל הצעדים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר באמצעות צנצנות Coplin).
      5. טובלים שקופיות של 15 שניות ב thiosulfate נתרן 1% (pentahydrate).
      6. טובלים שקופיות למשך 15 שניות במים הטוהר גבוהה.
      7. טון השקופיות דקות 2 ב כלוריד זהב 0.2%.
      8. טובלים את השקופיות במים הטוהר גבוהה למשך 15 שניות.
      9. לחשוף את שקופיות חומצה אוקסלית 0.5% עבור 2 דקות.
      10. טובלים את השקופיות עבור 15 שניות במים הטוהר גבוהה.
      11. פנקו את השקופיות עבור 5 דקות בתוך thiosulfate נתרן 5%.
      12. שטפו ביסודיות מגלשות מים גבוה מייבשים, טוהר coverslip.
      13. שקופיות מוכנים כעת עבור כימות densitometric 17.
        1. כל הציוד, כולל בתחום התאורה בהירה, מופעלת דקות לפחות לפני 20 הדמיה.
        2. תרבות קטעים שלמים פרוסה הם צילמו בשעה 5-10x על מיקרוסקופ הפוכה.
        3. עוצמת האור מוגדר ברמה אחידה (למשל, ~ 2.6 V) ולא השתנה לאורך כל הרכישות התמונה.
          1. מסננים צפיפות ניטרלי משמשים לפי הצורך כדי להפחית את התמונה המלאה עוצמת האור מועבר אל ~ 1500 בהיקף 12 סיביות (0-4095), שם "0" הוא שחור לגמרי 4095 הוא לבן לגמרי.
        4. תמונות דיגיטליות הן רכשה אז מאוחסנים בצורה אלקטרונית לכל (כלומר, העמדת פנים מלאה דוגמאות ניסיוני), כולל תמונת רקע נגזר טופס שטח של שקופיות ללא סעיפים תרבות פרוסה.
        5. תמונת הרקע מופחת כל התמונות (זיוף, ניסיוני) ואת שטח של עניין (AOI) נמשך סביב תרבות כל פרוסה והעביר עוצמת האור רשום.
        6. עוצמת הטווח תמונה מוגדרת מגוון מתמיד כל הניסויים.
        7. לשם הבהירות, כפי שבאה לידי ביטוי כתוצאה צפיפות יחסית לעומת רמות השליטה (איור 8).

7. נציג תוצאות:

figure-protocol-74791
באיור 1. תרבות Slice הקלטה אלקטרו פרדיגמה. Microelectrode הקלטה ממוקם ראשון שכבת CA3 נוירון פירמידלי ואז אלקטרודה מגרה דו קוטבית ממוקם gyrus משוננת (DG).

figure-protocol-75099
איור 2. CA3 מעוררים פוטנציאלים השדה המושרה synaptically הפצת דיכאון. (א) ניסויים להתחיל עם הקביעה הנוכחית הדרוש על מנת למקסם את תקן CA3 שדה באזור התגובות פוטנציאל ואז חצי בעוצמה מקסימאלית משמש לעורר CA3 מעוררים פוטנציאלים באזור שדה. זה מתעד את הנורמליות של תגובות סינפטיים מעוררים בין ההכנות. אם הגירוי בשדה של פרוסת הודעה הפוטנציאל הסינפטי אינן לפחות 3 mV, פרוסות מבוטלים. (ב) על הסף הבא, עורר טרנס synaptically מפעילה דיכאון הפצת נקבע (מימין, תגובות לאט) תוך הפוטנציאלים בשדה באותו זמן (משמאל , תגובות מהר) משמשים מסמך ההכנות בריאים מספיק כדי לעקוב אחר גירויים 10 הרץ (למשל, אמפליטודות של סטיות אנכיות ברשומות פוטנציאל מהיר דומים).

figure-protocol-75904
איור 3. תנועה Microglial הקשורים עדות הקטינה פעילות. הסינפטי מראה כי הענפים microglial להרחיב לחזור עם הפעילות הסינפטית גדלה, אך למרחקים ארוכים תנועה של תאים אלה בתגובה הפעילות הסינפטית לא תוארה במוח וללא כל פגע. התוצאות שלנו באמצעות ניאון תיוג B4 isolectin של microglia להראות כי חלק קטן של תאים אלה לעבור מרחקים ארוכים בתנאים רגילים. יתר על כן, במספר microglia אלה נסיעה הוא גדל באופן משמעותי כאשר הפעילות הסינפטית הוא בוטל על ידי חשיפה תרבות tetrodotoxin כפי שמוצג בתמונה המלווה. השבילים האדום קווי סימן נסע microglia על פני תקופה של 6 שעות עם חיצים כחולים לציון מקור microglia למופת ספורים. בר כיול, 50 מיקרומטר.

figure-protocol-76692
איור 4. PCR פעילויות ההקרנה. (א) אנו משתמשים TRIzol יחד עם Qiagen ערכות עבור בידוד RNA מאז, בידיים שלנו, זה תוצאות גדול משמעותית (p <0.001, t-test). תשואה RNA מתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מאשר השימוש ערכות Qiagen לבד (ב) בנוסף, אנו מאשרים כי מעת לעת נהלים RNA החילוץ שלנו לייצר RNA באיכות גבוהה ללא פגע, כפי שנקבע באמצעות ג'ל שמראה חד להקות RNA. (ג) אנו משתמשים בתוכנה NormFinder לבחור גן התייחסות עם ערך יציבות הטוב ביותר. לדוגמה, בתרבויות פרוסה חשוףכדי lipopolyssacharide (100 ng / mL עבור 2 שעות) נותחו עבור שלושה גנים הפניה (Rpl13a, β-אקטין, 18s). ערכים Ct משמשים כדי לחשב ערך יציבות. הנתונים שלנו כאן [וכי לניסויים אחרים באמצעות הפצת דיכאון (מידע לא מוצג)] עולה כי Rpl13a הוא הגן התייחסות אופטימלית. (ד) אנו משתמשים בשיטת "ΔΔCt" כאמצעי לשחזור רגיש כדי לזהות שינוי לקפל-RNA הבדלים בין קבוצות הניסוי בקרות דמה.

figure-protocol-77695
איור 5. בדיקות PCR התגובה. (א) אנו מודדים את עקומת amplifications דילול עבור primers כאמצעי כדי לאמת את איכות התגובות PCR. לדוגמה, amplifications אופטימלי להראות גידול אחיד (1-5) על סף CT. (ב) לעומת זאת, amplifications אינם אחידים עם primers עניים (1-5). (ג) בנוסף, אנו מבצעים עקומה להמיס את המסקנה של מבחני PCR כדי לוודא amplicons הרצוי מזוהים (כלומר, עקומת שיא יחיד), אשר מצביע על היעדר כל גדילי הדנ"א הכפול כולל הדימרים פריימר, זיהום דנ"א המוצר misannealed PCR (אשר יופיע עקומות שיא מרובים).

figure-protocol-78378
איור 6. ננו מראש הגברה מאפשר זיהוי של λ-IFN בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. מאז רק ~ 50 מתאי T נמצאים בתרבות פרוסה (מתוך ~ 55,000-90,000 תאים סה"כ), השתמשנו 2 RT ננו סינתזה קדם מגבר קיט cDNA כמו אמצעי ביטוי לזהות פוטנציאל נמוך במיוחד ברמה של IFN-λ. המשמעות של preamplification cDNA בתנאי גידול של פי 12 רגישות RNA רמות. התוצאות הראו מעל להדגים את היכולת של preamplification להגדיל את רגישות הזיהוי. Ct סף לעיון גן Rpl13a היה 20.5 עם הגברה הראשוני וזה היה גדל ל 14.1 עם השימוש בערכה preamplification, עלייה של פי 12 המקביל ל 12 מחזורים של PCR הגברה של cDNA. במקביל, IFN-λ לא היה ניתן לגילוי (0.0), אך היה גם בתוך טווח גילוי (29.0) עם preamplification.

figure-protocol-79189
איור 7. מולדת מסלול ציטוקינים phosphoprotein זירחון שינויים. (א) השפעה למופת של TNF-α המקדים (כלומר, neuroprotection) על מסלול מולדת זירחון phosphoprotein ציטוקינים 24 שעות לאחר פציעה excitotoxic בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. תוצאות להראות שינויים באזור CA1 בין פרוסות pretreated במשך 3 ימים עם 100 ng / mL TNF-α לפני החשיפה N-methyl-D-aspartate (NMDA) בהשוואה לאלה שנחשפו NMDA לבד (כלומר, הניסוי לעומת דמה), כפי שבאה לידי ביטוי אחוז. שימו לב TNF-α גרם לעלייה זירחון מתמשכת JNK ו ATF-2, כמו גם עלייה זמנית של NFκB. (ב) הפריסה המרחבית של הפעלת NFκB (כלומר, נוכחות של NFκB phosphorylated בגרעין) מתגלה על ידי immunostaining ( אדום). YoYo גרעינים כתמים ירוקים בסעיף פרוסה תרבות [למשל, האסטרוציטים ב (ראש החץ)]. עצב פירמידליים, אשר אחרת היו מופיעים גם ירוק, הם במקום צהוב בגלל במקביל לסימון עם phosphorylated NFκB (אדום). בר כיול, 25 מיקרומטר.

figure-protocol-80197
איור 8. . האישור proteomic של יעילות siRNA התעצמות כסף רמות של immunostaining peroxidase-diaminobenzidine מבוסס cyclophilin B מראה siRNA שניתן באופן משמעותי (p <0.001; ANOVA-הולם-Sidak שיטה) להפחית פרוסה העולמי בהיפוקמפוס cyclophilin ביטוי ב 3 ימים לאחר היישום של 200, 500 , או siRNA 1000 ננומטר.

Discussion

SD הוא ההפרעות התקפי של המוח שתכונותיהם הן שמור ביותר בכל אזורי המוח המינים שנבדקו עד כה. SD הוא למד בדרך כלל הניאוקורטקס. עם זאת, את המורכבות של מעגלים עצביים המבנה הזה (לעומת ההיפוקמפוס), כמו גם חוסר היכולת לשמור הניאוקורטקס בחיים במבחנה עם פונקציות החיסונית שקט לתקופות ממושכות, להפוך אותו לשימושי פחות כהכנה במבחנה להגדרת השלכות ארוכות טווח הרגישות של SD. לעומת זאת, ההיפוקמפוס אינו רק מבנה המוח, כי הוא רגיש ביותר SD, הוא גם מבנה archicortical עם מבנה פשוט יותר מעגל תפקוד עצבי, וזה גם מתאים להגדרת אמצעי neuroimmune שבאמצעותו ניתן לווסת את הפעילות העצבית הרגישות SD .

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS-19108), המכון הלאומי לבריאות הילד מחלות (PO1-HD09402), המחקר מיגרנה קרן וקרן הלבן. גב 'פ' מרשה Kraig סייעו בהכנת ותחזוקה של מערכות תרבות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
בינוני בסל הנשר Invitrogen 21010
ארל של פתרון מאוזן מלח סיגמא E2888
סוס סרום Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
גנטמיצין Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-גלוקוז סיגמא G8769

. טבלה 1 תרבות הכנה ותחזוקה: סרום סוס בינוני

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex ג'מיני Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
גנטמיצין Invitrogen 15710-064
D-גלוקוז סיגמא G8769
חומצה אסקורבית סיגמא A4544
Fungizone Invitrogen 15295
נתרן כלורי סיגמא S6546
מגנזיום כלוריד סיגמא M1028
סידן כלוריד סיגמא 21115

. 2 לוח תרבות הכנה ותחזוקה: סרום ללא בינוני

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
Millicell-CM בתרבית רקמה מוסיף (30 מ"מ) תרמו פישר PICM0-3050
6-Falcon היטב מנות תרבות תרמו פישר 08-772-1B
Sytox גרין Invitrogen S7020

3. טבלת ייצור חומרים: אלקטרודות קרקע

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
צינורות זכוכית נימי AM Systems, Inc 2 מ"מ x 1.16mm, 4 אינץ'
KCl סיגמא P5405
אגר פישר סיינטיפיק A360
EDTA סיגמא 5134
צנור Masterflex 95809-34
צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות מתלה פישר סיינטיפיק
חוט כסף Medwire AG15X
Hemostat כלי מדעי פיין 13018-14
אמרי הלוח Walgreens
Scintillation בקבוקון פישר סיינטיפיק
דבק איטום גמיש מדהים goop
מלבין Clorox

. טבלה 4 ייצור חומרים: אלקטרודות קרקע

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
בורוסיליקט נימה סאטר מכשירים BF150-86-10 1.5 x 0.86 מ"מ
Microelectrode חולץ Narashige PE-2
חתיכת עין אופטית מיקרומטר Zeiss
שלב אופטי מיקרומטר Zeiss
מתחם מיקרוסקופ Zeiss
מיקרוסקופ שקופיות Surgipath 00210
1-Dimensional microelectrode מניפולטור Narashige MO-10
3 מימדי microelectrode מניפולטור Narashige MM-3
דבק מרק סקוטש
100 מ"מ Nalgene מכולות פישר סיינטיפיק

. לוח 5 ייצור חומרים: אלקטרודות הקלטה

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
מצופה טפלון אירידיום פלטינה חוט AM מערכות 7780 125 מיקרומטר חשוף, 200 מיקרומטר מצופה
מצבטים תרמו פישר 13-812-38
Hemostat כלי מדעי פיין 13018-14
30 מד תיל Tensolite
מלחם קופר כלים 100 UTC
לרתך Bernzomatic הליבה שרף, להוביל נושאות חינם, כסף
ריכוז HCl פישר סיינטיפיק A144-212
פיפטה פסטר פישר סיינטיפיק 13-678-30
עמיד במים אפוקסי JB וולד
שקעי בננה ניוארק אלקטרוניקה

. לוח 6 חומרי ייצור: אלקטרודות גירוי

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
פלקון 35 מ"מ תרבות צלחת בקטון דיקינסון labware
צינורות זכוכית נימה סאטר Instrument ושות BF100-58-10 1.0 מ"מ, 12 מ"מ אורך
כותנה ריבועים Walgreens
מצבטים תרמו פישר 13-812-38
צנור Masterflex 95809-34
פולי ויניל כלוריד הסרט פישר סיינטיפיק 01810 18 ס"מ x 1000 מטר
# 9 להב חד כתער קצה נפח

. לוח 7 ייצור חומרים: צלחות הקלטה

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
הקלטה קאמרית מדיקל סיסטמס קורפ PDMI-2 הקלטה קאמרית
הפרעה דו קוטבית בקרת טמפרטורה מדיקל סיסטמס קורפ TC-202
PH שילוב אלקטרודה Microelectrodes בע"מ MI-413
ה-pH מטר Beckman 250 סוללה המופעלות
מיני סוג-T צמדים תרמיים Physiotemp סדרת ה-IT
DigiSense מדחום קול-פאלמר 8528-10
בשורה דוד וורנר מכשירים SH278
Gibraltor שולחן Burleigh
הפוך מיקרוסקופ לייקה DMIRE2
אנטי רטט טבלה יצרן טכני של קורפ 63-541
מצרב כלי מזל תאומים סוללה המופעלות
Microelectrode micromanipulators Narashige WR60 שמאל וימין
מיוצב אספקת החשמל MGE UPS מערכות אליפסה 1200 ± 5 וולט (120 סה"כ)
מגבר Axoprobe מערכת אקסון מכשירים 1-A
פעיל מסנן תדירות התקנים דגם 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope תוכנה Axoscope נ 9  
מערכות המחשב Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab קורפ נ 8.1
ממריץ יחידת בידוד בק אלקטרוניקה, Inc BSI-II
½ עמדה מגנטים אינץ דקסטר PMO90-3
3 עמדת מגנטים אינץ דקסטר PMC-800T
מספר X-Blocks Narishige X-12 עבור המפרקים הכדור מיצוב
שסתומים המילטון HVD-3 למסירה בינוני
משאבת מזרק רזאל A99
אוסצילוסקופ דיגיטלי Agilant טכנולוגיות
מצלמה דיגיטלית מערכת קוואנט EM 512-SC
MetaMorph תוכנה מולקולרית התקנים נ 7.5.04
מטרת המוקד מיקרוסקופ עם Pi foc פיזיק Instrumente E-662.LR
חכם תריס Lambda SC
כפול אורך הגל פלורסנט מיקרוסקופית מכשירים מדעיים יישומית צבעוני II
Peristaltic משאבות Masterflex 77120-62
Aspirator הרווארד Apparatus PDMI מרכיב

לוח 8. הגדרת אלקטרו

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
1 M מגנזיום כלוריד סיגמא 057K8620
1 M מנגן כלוריד סיגמא 018K6107
1 M סידן כלוריד סיגמא GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin IB-4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
פוליוויניל כלוריד הסרט פישר סיינטיפיק 01810
MetaMorph מולקולרית התקנים נ 7.5.04
הפוך מיקרוסקופ לייקה DMIRE2
מצלמה QuantEM 512SC
אור UV קובלר CODIX
הפרעה דו קוטבית בקר טמפרטורה מדיקל סיסטמס קורפ TC-202
חכם תריס Lambda SC
Sytox גרין Invitrogen S7020
פלקון 35 מ"מ תרבות מנות בקטון דיקינסון labware
צינורות זכוכית נימה סאטר Instrument ושות BF100-58-10 1.0 מ"מ, 12 מ"מ אורך
צנור Masterflex 95809-34
הקלטה קאמרית מדיקל סיסטמס קורפ PDMI-2 הקלטה קאמרית
הפרעה דו קוטבית בקרת טמפרטורה מדיקל סיסטמס קורפ TC-202
PH שילוב אלקטרודה Microelectrodes בע"מ MI-413
Gibraltor שולחן Burleigh
אנטי רטט טבלה יצרן טכני של קורפ 63-541

לוח 9. הדמיה ויטל בתרבויות Slice בהיפוקמפוס

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
RNA מאוחר יותר Ambion AM7021
RNase / DNase ללא microcentrifuge צינורות 1.5 מ"ל ארה"ב מדעי 1615-5500
יהלום סכין המדע כלים פיין 10100-00
עדין קצה מברשת צבע טד פלה 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
סרכזת Eppendorf 5451C
וורטקס-השד VWR G-560

. לוח 10 הכנה PCR: תרבות Slice קציר

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר תגובות
כלורופורם סיגמא C-2432
סרכזת Eppendorf 5451C בחדר קר
, אתנול 200 הוכחה ביולוגיה מולקולרית סיגמא E7023
RNeasy מיקרו בערכה Qiagen 74004

. לוח 11 PCR ההכנה: הפקת RNA

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
Nanodrop 2000 תרמו פישר ND-2000
3 - (N-morpholino) propanesulfonic חומצה סיגמא M-1254
ssRNA סולם חוד N032S
נתרן אצטט סיגמא S-9513
EDTA סיגמא E5134
Ethidium פתרון ברומיד Bio-Rad 161-0433
OWL easycast אופקי מיני ג'ל מערכות תרמו פישר B1
מקור כוח אלקטרופורזה Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure agarose GibcoBRL 15510-019
מיקרוגל סמסונג SJ0390W
RNase חוץ מולקולרית Bioproducts 7000

. לוח 12 PCR ההכנה: כימות RNA

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler אופטי מודול
iCycler תוכנת המערכת Bio-Rad נ 3.1
iCycler IQ PCR צלחות, 96 גם Bio-Rad 2239441
כובע פסים שטוח - ברור אופטית. 8-כובע רצועה Bio-Rad TCS0803
iScript ערכת סינתזה cDNA Bio-Rad 170-8890
IQ SYBR גרין supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure agarose GibcoBRL 15510-019
חיץ 10x טה GibcoBRL 15558-026
מיקרוגל סמסונג SJ0390W
RNase חוץ מולקולרית Bioproducts 7000
Ethidium פתרון ברומיד Bio-Rad 161-0433
OWL easycast אופקי מיני ג'ל מערכות תרמו פישר B1
מקור כוח אלקטרופורזה Bio-Rad PowerPac HC
שם רצף
TNF-α F 5 "-ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG-3"
TNF-α R 5 "CTG-ATG AGA GGG AGC המרכז לאמנות עכשווית TTT G-3"
Rpl13a F 5'-TTG CTT ACC TGG GGC GTC T-3 "
Rpl13a R 5 "-CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C-3"

לוח 13 פעילויות PCR:. אופטימיזציה qPCR פריימר מראש ההקרנה

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
RT 2 Profiler מערך ה-PCR SABiosciences פרן-021
RT 2 ננו סינתזה קדם מגבר ערכת cDNA SABiosciences C-06
RT 2 Nano פריימר preamp cDNA לערבב סינתזה SABiosciences PBR-3021
RT 2 SYBR ירוק / והעמסת qPCR אב מix SABiosciences PA-011
RT 2 qPCR Assay פריימר עבור Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
רב pipettor קורנינג
25 מ"ל ביו טהור מאגר עם מחיצה מגוונים ביוטכנולוגיה REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler אופטי מודול
iCycler תוכנת המערכת Bio-Rad נ 3.1

לוח 14. הצלחות qPCR מערך האיתות רמה נמוכה

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
סרכזת פישר סיינטיפיק מיקרו 7
תמוגה Cell ערכת Bio-Rad 171-304011
BSA מניות חלבון Bio-Rad 500-0007
Assay BCA חלבון ערכת Thermo Scientific 23225
איטום קלטת Bio-Rad 2239444
96 גם צלחת הקורא פרקין אלמר 1420-multilabel לדלפק
6-Plex Assay Phospho lysates Bio-Rad X7000000502
6-Plex Phospho בשילוב חרוזים Bio-Rad X700000050

לוח 15. Phosphoprotein Assay Multiplex

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
Accell הצפת siRNA 5x Thermo Scientific B-002000-UB-100
משלוח Accell siRNA בינוני Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin בריכת-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

לוח 16. SiRNA

שם מגיב / ציוד חברה קטלוג / דגם מספר
16% paraformaldehyde אלפא Aesar 43368
ליזין סיגמא L-6001
סודיום פוספט פישר סיינטיפיק S374-1
נתרן periodate סיגמא S-1878
נתרן אזיד סיגמא S-2002
Cryostat לייקה CM3050 S
רקמות-Tek טד פלה בע"מ 27050
עדין קצה מברשת צבע טד פלה 11806
רקמות שקופיות Surgipath 00210
Coplin צנצנות דיג 08-815
מי חמצן (30%) סיגמא H1009
SFX אות משפר Invitrogen A31631
עיזים בסרום קולורדו החברה סרום CS 0920
טריטון X-100 סיגמא T-8787
Anti-NFκβ נוגדן סנטה קרוז SC-109
נגד ארנב עיזים IgG אלקסה פלואוריד 594 Invitrogen A11012
יויו גרעיני counterstain Invitrogen Y-3601
להאריך antifade Invitrogen P7481

לוח 17. אישור proteomic באמצעות אימונוהיסטוכימיה

שם ציוד מגיב / (בנוסף הרישום immunostaining לעיל) חברה קטלוג / דגם מספר הערות
Anti-B cyclophilin R & D מערכות MAB5410
3,3-diaminobenzidine סיגמא D8001
המים באמבטיה Pharmacia ביוטק 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
אמוניום הידרוקסיד JTBaker 9721-03
כסף חנקתי סיגמא S-0139
נתרן thiosulfate (pentahydrate) JTBaker 3949-01 &nsp;
זהב 0.2% כלוריד סיגמא G-4022
חומצה אוקסלית סיגמא O-0376
CoolSnap fx מצלמת CCD Photmetrics
MetaMorph תוכנה מולקולרית התקנים נ 7.5.04
הפוך מיקרוסקופ לייקה DM IRBE
צפיפות מסננים ניטרלי Chroma 0.5-3.0 צפיפות אופטית יחידת טווח

לוח 18. אישור proteomic באמצעות כסף משופרת אימונוהיסטוכימיה

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. , (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6 (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. , (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience52hormesismicrogliaTqPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved