Analyse complète des plaquettes procoagulantes présentant des caractéristiques de nécrose, d’apoptose et d’activation plaquettaire

Notre recherche se concentre sur la compréhension du métabolisme et de la signalisation plaquettaires pendant les états prothrombotiques, tels que le syndrome des antiphospholipides et le cancer, dans le but d’identifier de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques. Notre groupe a été à l’avant-garde d’un récent regain d’intérêt pour la façon dont le métabolisme plaquettaire contribue à l’activation plaquettaire et à la thrombose. La caractérisation précise de l’état d’activation plaquettaire dans la circulation des patients pour déterminer le risque de thrombose ainsi que l’efficacité thérapeutique des agents antiplaquettaires reste un défi important.

La glycolyse aérobie, la voie du pentose phosphate et la bêta-oxydation des acides gras ont été démêlées comme les voies métaboliques énergétiques caractéristiques dans les plaquettes et leur potentiel a été établi pour le ciblage thérapeutique. Ce protocole sert à aider à l’identification et à la caractérisation fonctionnelle précise des plaquettes procoagulantes, distinctes des plaquettes proagrégatives, ainsi que des plaquettes subissant la mort cellulaire par apoptose ou nécrose. Pour commencer, complétez les plaquettes humaines lavées avec 2,5 millimolaires de calcium en ajoutant 0,5 microlitre de solution de chlorure de calcium à 0,5 molaire à 100 microlitres de suspension plaquettaire.

Gardez une fraction de plaquettes non stimulée et stimulez la fraction restante avec une combinaison de thrombine et de convulsivant pendant 15 minutes à température ambiante. Après la stimulation, ajoutez un microlitre d’une annexine V, emballez-en un et un anticorps anti-CD62P à 100 microlitres de suspensions plaquettaires stimulées. Incuber les plaquettes dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 % avant d’analyser les échantillons par cytométrie en flux pour quantifier les plaquettes procoagulantes. Pour la préparation des plaquettes, diluez les plaquettes humaines lavées à une concentration d’un million de plaquettes par millilitre et complétez avec 2,5 millimolaires de calcium. Étiquetez les plaquettes avec cinq micromolaires ROD2 pour la détection du calcium mitochondrial et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité.

Pour la préparation des plaquettes pour le dosage de l’activation de la caspase, après avoir complété les plaquettes avec du calcium et stimulé une fraction, ajoutez une matrice de marquage active de la caspase aux suspensions plaquettaires stimulées. Incuber les plaquettes pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après 30 minutes, fixez les plaquettes en ajoutant un volume égal de formol à 2 % avant d’analyser les plaquettes par cytométrie en flux.

Les résultats montrent que la thrombine induit une augmentation dose-dépendante de la proportion de plaquettes exprimant à la fois la phosphatidylsérine et la P-sélectine. La stimulation par thrombine a également provoqué une augmentation temporelle des niveaux de calcium mitochondrial dans les plaquettes. Cependant, la stimulation par thrombine a entraîné une réduction du potentiel de la membrane mitochondriale dans les plaquettes.

La stimulation par thrombine a activé la caspase-8 mais pas la caspase-3 ou 7 dans les plaquettes.