Mon groupe de recherche porte sur la biologie moléculaire fondamentale et la biochimie des chaînes d’assemblage biosynthétiques chez les bactéries. Notre objectif est de concevoir des bactéries pour fabriquer de nouveaux antibiotiques. Nous sommes passionnés par l’introduction de ce travail dans la salle de classe, en offrant aux étudiants une expérience pratique des techniques de pointe en biotechnologie.
Le clonage à base de topoisomérase est actuellement utilisé dans la classe de biologie moléculaire de premier cycle de Cal Poly pour initier les étudiants au clonage moléculaire. Gibson Assembly est devenu une technique de clonage moléculaire pertinente sur le plan industriel, et nous essayons de fournir aux étudiants des expériences applicables. Le clonage moléculaire est une technique qui peut être difficile à conceptualiser dans une salle de classe traditionnelle de premier cycle.
Nous avons conçu un module de laboratoire pratique dans lequel les étudiants conçoivent et évaluent leur expérience et contribuent à des projets de recherche authentiques. Cela améliore leur compréhension du processus de clonage et des applications de leur travail. Bien que d’autres expériences de recherche de premier cycle utilisant des techniques de clonage moléculaire aient été publiées, aucune n’inclut un module d’assemblage Gibson adaptable.
Nous avons conçu tout le matériel pour mesurer les résultats d’apprentissage de cette expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours. Nous espérons qu’il s’agira d’un outil d’enseignement des sciences facilement réalisable pour améliorer l’évaluation des instructeurs et la formation des étudiants dans les laboratoires de biologie moléculaire de niveau collégial. Pour commencer, déterminez la source de matrice d’ADN pour les inserts de gènes, tels que l’ADN génomique, le plasmide ou l’ADN synthétique.
Récupérez les séquences d’ADN des inserts de gènes et du vecteur. Importez les séquences d’insertion et les séquences vectorielles souhaitées dans Benchling en tant que nouveaux fichiers de séquences d’ADN. Ouvrez ensuite chaque séquence importée à utiliser dans la réaction d’assemblage Gibson.
Localisez maintenant l’outil Assistant d’assemblage en bas de l’écran. Cliquez sur Assistant Assemblage, puis sélectionnez Créer un assemblage. Dans les options proposées, sélectionnez Gibson, puis cliquez sur Démarrer pour commencer l’assemblage.
Dans la fenêtre Séquence vectorielle, sélectionnez les bases du squelette vectoriel à partir de l’extrémité 3 première de l’insert de gène jusqu’au point final souhaité. Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Colonne vertébrale en bas de l’écran et choisissez Définir le fragment. Dans la fenêtre Séquence d’insertion, sélectionnez toutes les bases d’insertion à inclure dans l’assemblage.
Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Insertion en bas de l’écran et choisissez Définir le fragment. S’il y a plusieurs insertions de gènes, cliquez sur le bouton plus sur le côté droit de l’assistant d’assemblage. Dans la fenêtre Séquence d’insertion, sélectionnez toutes les bases de l’insert supplémentaire à inclure dans l’assemblage.
Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Insertion en bas de l’écran et choisissez Définir le fragment. Une fois que tous les fragments sont définis, renommez l’ensemble avec le nom de plasmide souhaité. Cliquez sur Assembler sur le côté droit de l’Assistant Assemblage.
Sélectionnez ensuite l’emplacement de dossier souhaité pour le dossier de séquence et le dossier d’amorce, puis cliquez sur Créer pour assembler la séquence de plasmide recombinant. Ouvrez maintenant le plasmide assemblé et cliquez sur Historique de l’assemblage pour afficher une carte de base du plasmide et une vue d’ensemble des séquences à partir desquelles il a été dérivé. Dans l’onglet Paramètres d’assemblage, affichez les noms des amorces conçues pour l’assemblage.
Vérifiez qu’il y a deux amorces pour chaque encart et que les noms des amorces sont dérivés des titres des fichiers de séquences d’ADN. Assurez-vous que les températures de fusion de l’apprêt et les températures de recuit suggérées sont compatibles. Une fois la conception de l’amorce des plasmides souhaités terminée, cliquez sur Finaliser dans l’assistant d’assemblage.
À l’aide d’une expérience de PCR à gradient avec les matrices d’ADN, testez les paires d’amorces spécifiques à l’insert et au vecteur pour obtenir des températures de recuit optimales. Une fois que les températures de recuit ont été déterminées, créez des aliquotes de solutions d’amorces, des matrices d’ADN et les réactifs nécessaires aux réactions PCR pour les étudiants. Pour commencer, obtenez des amorces et des solutions d’ADN de matrice pour la PCR auprès de l’instructeur.
À l’aide des réactifs présentés ici, préparez des réactions PCR de 25 microlitres pour obtenir des fragments linéaires des séquences d’ADN souhaitées. Cycle de la réaction dans un thermocycleur. Assurez-vous que la température de recuit est appropriée pour les amorces et que le temps d’extension est adapté à la longueur de l’amplicon souhaité.
Ensuite, analysez cinq microlitres de chaque réaction par électrophorèse sur gel d’agarose. Pendant que le gel fonctionne, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction DpnI à chaque réaction qui a utilisé l’ADN plasmidique comme modèle. Incuber ce mélange pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Ensuite, imagez le gel pour confirmer que la PCR a réussi et que l’amplification correcte a été obtenue. Purifiez toutes les réactions PCR réussies à l’aide d’un kit de purification PCR disponible dans le commerce. Mesurez la concentration du produit PCR purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume pour l’utiliser dans les calculs d’assemblage ultérieurs de Gibson.
Pipetez les composants de réaction de l’assemblage Gibson. Incuber la réaction à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant que les réactions incuberont, décongelent des cellules d’Escherichia coli chimiquement compétentes sur de la glace pour les transformer.
Transformez deux microlitres de la réaction d’assemblage Gibson en cellules chimiquement compétentes par choc thermique. Pipeter 100 microlitres des cellules transformées sur deux plaques de sélection et étaler avec des billes stérilisées. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, conservez l’assiette à quatre degrés Celsius. Comptez ensuite les colonies sur toutes les plaques et calculez l’efficacité de la transformation à l’aide de la formule donnée. À l’aide d’un marqueur, sélectionnez et étiquetez quatre colonies distinctes sur la plaque de sélection avec les initiales de l’élève et un numéro.
Prenez une nouvelle plaque de gélose LB contenant des antibiotiques pour la sélection et divisez-la en quadrants. Utilisez environ la moitié de chaque colonie pour vous reposer sur le quadrant respectif. Ajoutez la concentration correcte d’antibiotiques dans les tubes étiquetés avec l’identité de la colonie pour la sélection.
Ensuite, inoculez une culture liquide de cinq millilitres de LB avec l’autre moitié de chacune des quatre colonies sélectionnées. Incuber les cultures liquides dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit et la plaque de gélose dans un incubateur statique à la même température. Isolez l’ADN plasmidique des cultures liquides à l’aide d’un mini kit de préparation.
Mesurez la concentration de l’ADN plasmidique isolé en nanogrammes par microlitre. Après avoir conçu un crible PCR de synthèse de restriction pour analyser les plasmides isolés, pipetez les réactions de digestion de restriction ou les réactions PCR. Analysez ensuite les résultats par électrophorèse sur gel.
Une fois le module d’assemblage Gibson terminé, demandez aux étudiants participants de remplir le questionnaire à choix multiples lors de la réunion de laboratoire. Combinez toutes les données des réponses avant et après le questionnaire pour l’analyse et évaluez leur signification statistique. Après le projet, le score moyen du contenu a considérablement augmenté, passant de 63,7 % à 80,4 %, ce qui indique une meilleure compréhension des concepts de biologie moléculaire et de clonage par les étudiants.
La confiance moyenne à terme a augmenté de manière significative, passant de 3,52 à 3,87, avec une grande taille d’effet démontrant une meilleure compréhension des termes de biologie moléculaire par les étudiants. La confiance de l’étudiant moyen dans l’exécution des techniques de laboratoire a considérablement augmenté, passant de 3,82 à 4,33, ce qui montre une plus grande aisance avec les techniques de biologie moléculaire. Le nombre de réponses indiquant une familiarité avec le terme assemblage Gibson a considérablement augmenté entre le pré et le post-questionnaire, avec une augmentation notable de ceux qui pouvaient expliquer le terme.
La confiance dans l’exécution de la technique d’assemblage Gibson s’est améliorée avec la plupart des réponses, passant de neutre ou en désaccord avant la session à d’accord ou tout à fait d’accord après. La confiance des élèves dans les sujets généraux de biologie n’a montré aucun changement statistiquement significatif. En revanche, la confiance dans les questions d’assemblage Gibson spécialisées a considérablement augmenté.
