Ce protocole a permis la détection continue d’effets transitoires sous la forme de certains changements morphologiques au cours d’une infection virale, tels que le décollement et la flottaison des cellules adhérentes. Ce protocole a permis une approche non invasive et sans demande de main-d’œuvre pour la surveillance continue des changements morphologiques cellulaires et la capture d’effets transitoires tels que les fuites vasculaires qui pourraient être manqués par le test final. Ce protocole peut être utilisé pour analyser les changements d’intégrité vasculaire d’autres lignées cellulaires dans différentes configurations expérimentales si les cellules sont des cellules adhérentes.
Après avoir préparé les HUVEC, lancez l’application logicielle RTCA en double-cliquant sur l’icône sur le bureau. Saisissez le nom d’utilisateur et le mot de passe dans la fenêtre de connexion. Placez une plaque de résistance RTCA à 96 puits avec le puits A1 orienté vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
Accédez ensuite à l’onglet Notes de l’expérience du logiciel RTCA et tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil. Dans l’onglet Mise en page sous l’onglet de cellule du logiciel RTCA, mettez en surbrillance tous les puits et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés. Ensuite, ouvrez l’onglet de planification du logiciel RTCA.
Cliquez sur Step_1 et définissez les balayages sur 10 et l’intervalle sur 30 secondes. Cliquez ensuite sur Démarrer continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel pour commencer l’exécution de la vérification. Après l’exécution, ouvrez l’onglet d’index des cellules pour vérifier les données.
Toutes les valeurs d’index de cellule doivent être inférieures à 0,063. Vérifiez ensuite les données brutes de numérisation dans la partie inférieure de l’onglet d’index des cellules pour les modèles de valeurs répétées, comme décrit dans le manuscrit. Pour terminer l’exécution de vérification, cliquez sur plaque et sélectionnez plaque de dégagement.
Retirez la plaque de résistance RTCA à 96 puits de la station RTCA. Pour obtenir une lecture de fond sur le RTCA, lavez deux fois la plaque de microélectrode en or spécialisée recouverte de collagène de type un avec 60 microlitres par puits de HBSS. Jetez le HBSS restant et ajoutez 50 millilitres par puits de matrice extracellulaire.
Placez ensuite la plaque dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire avec le puits A1 tourné vers l’intérieur. Dans l’onglet exp notes du logiciel RTCA, tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil. Accédez à l’onglet cellule du logiciel RTCA et sélectionnez l’onglet de mise en page.
Mettez en surbrillance les puits à utiliser et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés. Allez maintenant dans l’onglet planification du logiciel RTCA. Cliquez sur Step_1, puis sur Démarrer ou Continuer dans le coin supérieur gauche pour obtenir une lecture en arrière-plan.
La plaque est maintenant prête pour l’ensemencement des cellules et le retrait de la station RTCA. Ensuite, ensemencer 10 à la quatrième cellule par puits de HUVEC dans la plaque de microélectrode d’or avec 50 microlitres par puits de milieu conditionné. Replacez la plaque dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire, avec le puits A1 tourné vers l’intérieur.
Ensuite, dans l’onglet planification du logiciel, cliquez sur ajouter une étape dans le coin supérieur gauche. Cliquez sur Step_2. Définissez les balayages sur 601, l’intervalle sur deux minutes, puis cliquez sur Appliquer.
Cliquez sur Step_2, puis cliquez sur Démarrer ou Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel. Après 20 heures d’incubation, lorsque les valeurs de l’indice cellulaire dans l’onglet graphique du puits montrent un plateau, la plaque est prête pour l’infection. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Abandonner l’étape.
La plaque est maintenant prête à être retirée de la station RTCA. Pour infecter les HUVEC, récupérez le stock de virus Zika dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Diluer le stock de virus Zika avec une matrice extracellulaire sans sérum dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre pour obtenir des multiplicités d’infection de 0,1 et un.
Ensuite, jetez le milieu conditionné de chaque puits et rincez chaque puits avec 60 microlitres de HBSS tout en utilisant le côté du puits. Ajouter 40 microlitres d’échantillon de virus dilué dans le puits, en commençant par la dilution la plus élevée jusqu’à la dilution la plus faible, en utilisant le côté du puits. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre l’absorption du virus.
Faites tourner la plaque cinq fois toutes les 15 minutes pour permettre l’absorption du virus dans toute la monocouche cellulaire. Après une heure d’incubation, retirez et jetez la suspension virale de la concentration la plus faible à la plus élevée. Lavez les cellules infectées deux fois avec 60 millilitres de HBSS.
Superposer les puits avec de la matrice extracellulaire complétée par 2% de FBS. Pour les puits de contrôle positifs, diluer la thrombine à raison de 20 unités par millilitre avec de la matrice extracellulaire complétée par 2 % de FBS, et recouvrir les puits d’un milieu de matrice extracellulaire contenant de la thrombine, en utilisant le côté du puits. Cliquez maintenant sur l’onglet Planification et ajoutez une étape dans le coin supérieur gauche.
Naviguez jusqu’à Step_3 et modifiez les balayages sur 3, 601 et l’intervalle sur deux minutes. Cliquez sur Appliquer, puis sur OK dans la fenêtre qui s’affiche. Placez la plaque de microélectrode en or spécialisée infectée avec le puits A1 tourné vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture.
Enfin, cliquez sur Step_3, puis cliquez sur Démarrer continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel. La valeur de l’indice cellulaire des HUVEC infectés par le virus Zika P6-740 à une multiplicité d’infection de 0,1 a commencé à baisser 15 heures après l’infection, par rapport au témoin d’infection négatif. Les HUVEC infectés par une dose plus élevée de virus Zika P6-740 à une multiplicité d’infection de un ont montré une baisse de l’indice cellulaire 11 heures après l’infection.
À 24 heures après l’infection, il y avait une baisse de 5 % et 7 % de la valeur de l’indice cellulaire normalisé lorsque les cellules endothéliales étaient infectées à une multiplicité d’infection de 0,1 et 1 respectivement. Une réduction de 50 % de la valeur de l’indice cellulaire normalisé a été enregistrée 96 heures après l’infection et 66,75 heures après l’infection à une multiplicité d’infection de 0,1 et 1 respectivement. La valeur de l’indice cellulaire normalisé a atteint son point le plus bas à 107 heures après l’infection, avec une réduction de 51 % et 60 % lors de l’infection à une multiplicité d’infection de 0,1 et 1 respectivement.
La valeur de l’indice cellulaire normalisé a augmenté de 4 % et de 13 % entre 107 heures après l’infection et la fin de l’expérience, 168 heures après l’infection. Avant chaque expérience RTCA, une vérification de la résistance à l’aide de la plaque RTCA à 96 puits est essentielle pour s’assurer que chaque biocapteur fonctionne bien pour produire des valeurs d’indice cellulaire fiables.
