Cette méthode décrit un nouveau modèle murin pour étudier la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Il imite plus étroitement ce qui se passe chez les humains. Ce modèle peut être un outil important pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles contre la pneumonie pneumococcique secondaire chez les hôtes sensibles.
Ce modèle reproduit la susceptibilité au vieillissement. Par conséquent, il peut être utilisé pour comprendre quels aspects de l’hôte deviennent défectueux avec l’âge et nous permettre d’adapter les options de traitement aux hôtes âgés vulnérables. La croissance du biofilm pneumococcique est difficile car les différentes souches prennent des temps différents.
Mon conseil est d’essayer de cultiver le biofilm avant d’exécuter l’étude animale. Une fois que les cellules H292 sont 100% confluentes, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 250 microlitres de paraformaldéhyde à 4% par puits pour fixer les cellules et incuber pendant une heure sur de la glace ou une nuit à quatre degrés Celsius.
Strake Streptococcus pneumoniae souche d’intérêt sur plaque de gélose au sang et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, inoculez les bactéries de la plaque dans un milieu frais chimiquement défini ou CDM plus oxyrase en lavant les bactéries de la plaque en ajoutant un millilitre de MDP plus oxyrase et en soulevant doucement les colonies bactériennes à l’aide du côté d’une pointe de pipette d’un millilitre, en prenant soin de ne pas gratter la gélose Diluer la culture bactérienne dans du MDP plus oxyrase jusqu’à obtenir une DO de départ de 600 de 0,05.
Ensuite, cultivez les bactéries dans un tube conique de 50 millilitres à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la DO de 0,2 soit atteinte. Prochain vortex le tube de culture bactérienne. Ensemencer 0,5 millilitre de la culture sur les cellules H292 fixes et ajouter 0,5 millilitre supplémentaire de MDP plus milieu oxyrase par puits.
Ajoutez CDM plus Oxyrase aux puits de contrôle sans bactéries. Incuber la plaque pendant 48 heures à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Toutes les 12 heures, après l’ensemencement initial, remplacez doucement les 0,5 millilitres du milieu par du CDM frais plus de l’oxyrase.
Attention à ne pas perturber la formation du biofilm. Vérifiez le fond de la plaque pour le biofilm et recherchez une nébulosité croissante au fil du temps en raison de la croissance du biofilm. Après 48 heures, retirez le surnageant et lavez le biofilm deux fois avec un millilitre de PBS.
Ensuite, remettez le biofilm en suspension dans un millilitre de MDP frais et pipette vigoureusement de haut en bas pour soulever le biofilm. Pour chaque souche bactérienne, regroupez la culture de tous les puits dans un tube de 50 millilitres. Bien mélanger en inclinant doucement le tube bien bouché de haut en bas plusieurs fois.
Ensuite, ajoutez 40% de glycérol et de CDM à volumes égaux pour obtenir une suspension bactérienne avec une concentration finale de 20% de glycérol. Aliquote d’un millilitre dans un tube microcentrifugeux, congeler sur de la glace sèche et économiser à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les aliquotes cultivées sur la glace et faire tourner à 1 700 G pendant cinq minutes.
Retirez et jetez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille. Ensuite, lavez la pastille en la remettant en suspension dans un millilitre de PBS et faites-la tourner à nouveau. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume nécessaire pour atteindre la concentration désirée.
Inoculer la souris noire C57 six mâles par voie intranasale avec cinq fois 10 à la sixième unité formant colonie ou UFC en pipetant cinq microlitres de l’inoculum dilué dans chaque naris. Après l’inoculation, tenez fermement la souris en stabilisant la tête jusqu’à ce que le volume soit inhalé. Une fois que le virus a dégelé, diluez-le dans du PBS à la concentration désirée.
Placez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux de la souris avant l’anesthésie. Infectez immédiatement la souris anesthésiée avec 50 microlitres de 20 unités formant des plaques, ou PFU, du virus de la grippe A ou IAV par voie intratrachéale en utilisant une pince à épiler émoussée pour retirer la langue de la bouche et pipeter le volume de liquide dans la trachée. Après récupération, inoculer par voie intranasale 10 microlitres de 200 PFU d’IAV en utilisant la méthode d’inoculation décrite précédemment.
Pour le prélèvement des poumons, à l’aide de ciseaux à dissection, coupez les côtés de la cage thoracique exposée et tirez doucement les côtes vers la tête de la souris pour exposer le cœur. Insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 10 millilitres préremplie de PBS dans le ventricule droit et commencez à perfuser lentement. Recherchez le blanchiment des poumons comme indicateur de perfusion réussie.
Rincer lentement pour éviter de casser le tissu pulmonaire. Soulevez le cœur avec une pince et faites une incision pour séparer les poumons et le cœur. Une fois séparé, ramassez tous les lobes du poumon avec une pince et rincez dans un plat avec du PBS stérile pour éliminer tout sang résiduel.
Dans une boîte de Pétri, hacher le poumon en petits morceaux et bien mélanger. Retirez la moitié du mélange pulmonaire pour déterminer l’UFC bactérienne ou le PFU viral et placez-le dans un tube rond de 15 millilitres prérempli de 0,5 millilitre de PBS pour l’homogénéisation. Retirez l’autre moitié du poumon pour la cytométrie en flux et placez-la dans une plaque de 24 puits traitée par culture non tissulaire, chaque puits étant prérempli de 0,5 millilitre de RP10.
Laisser à température ambiante jusqu’au traitement. Pour homogénéiser le tissu collecté, nettoyez la sonde homogénéisante en la mettant dans de l’éthanol à 70% et en allumant l’homogénéisateur à 60% de puissance pendant 30 secondes. Répétez cette étape dans de l’eau stérile pendant 10 secondes.
Homogénéiser chaque tissu pendant une minute. Pour le dénombrement des nombres bactériens, dilutions en série sur plaques sur gélose au sang. Pour calculer le CFU total, utilisez 10 microlitres pour plaquer et notez le volume final en millilitres pour chaque échantillon.
Plaquer les échantillons du nasopharynx sur des plaques de gélose au sang complétées par trois microgrammes par millilitre de gentamycine pour sélectionner la croissance de S pneumoniae tout en inhibant la croissance d’autres micro-organismes. Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour la cytométrie en flux, ajouter 500 microlitres de tampon de digestion à chaque puits d’une plaque de 24 puits contenant un échantillon pulmonaire.
Incuber l’assiette pendant 45 minutes à une heure. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette P-1000, déplacez les poumons digérés et placez-les sur le filtre. Utilisez ensuite le piston d’une seringue de trois millilitres pour écraser l’échantillon.
La croissance du biofilm S. pneumoniae inoculum entraîne un portage pneumococcique constant limité au nasopharynx tout en évitant la propagation systématique. La présentation de la maladie chez les souris co-infectées par S pneumoniae IAV dépendait de la souche bactérienne. Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le nombre de bactéries du nasopharynx entre les souches, S pneumoniae, TIGR4 et D39, mais pas EF3030 disséminé dans les poumons 48 heures après l’infection par le VAI.
40% des souris infectées par S pneumoniae TIGR4 ont présenté une dissémination bactérienne dans les poumons et parmi celles-ci, la moitié d’entre elles sont devenues bactériémiques. Les souris infectées par S pneumoniae D39 ont montré une dissémination de 100% dans les poumons et la moitié d’entre elles ont présenté une bactériémie. Dans le suivi de la survie globale, quelle que soit la souche bactérienne, le taux de survie des souris co-infectées était significativement inférieur à celui des souris individuellement confrontées à S pneumoniae.
Ce modèle a également été utilisé pour évaluer la présence de diverses cellules immunitaires dans les poumons à la suite d’une infection par le VAI. Les souches bactériennes D39 et TIGR4 ont provoqué une augmentation significative par rapport à la ligne de base de l’afflux de cellules immunitaires inflammatoires de la circulation, telles que les neutrophiles et les monocytes, contrairement à EF3030. L’infection par le VAI à elle seule a provoqué une augmentation significative par rapport à la ligne de base de l’afflux de cellules immunitaires telles que les cellules NK et les cellules T gamma delta.
Ces réponses antivirales ont été significativement atténuées chez les souris infectées par voie intranasale par S pneumoniae avant la provocation virale. Chez les souris infectées individuellement, les titres viraux ne variaient pas entre les cohortes jeunes et âgées. Les souris âgées ont montré des signes de maladie plus précoces et significativement plus graves et sont mortes plus rapidement, dans les 24 heures, tandis que les jeunes témoins ont mieux survécu à l’infection.
La séparation du portage et de la maladie en étapes distinctes nous permet d’examiner à la fois la réponse immunitaire et les facteurs bactériens et/ou viraux importants à différentes phases de la progression de la maladie. Nous espérons que ce modèle sera adapté par d’autres laboratoires pour étudier d’autres interactions polymicrobiennes et interactions hôtes-pathogènes au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre les différents hôtes.
