Cette méthode de dissection et d’immunofluorescence est utilisée par de nombreux laboratoires de C. elegans. Il peut être adopté pour détecter toute protéine pour laquelle un anticorps ou une protéine de fusion marquée est disponible. Bien qu’il faille un peu de pratique pour obtenir cette dissection correctement, ce protocole est flexible et simple à dépanner.
Pour nous, la coloration DAPI fonctionne toujours et nous pouvons généralement trouver une condition qui fonctionne pour chaque anticorps. Le plus grand défi pour cette technique est l’étape de dissection. Vous devez travailler rapidement mais en toute confiance pour obtenir de bonnes extrusions de lignées germinales.
La pratique est la clé. Pour commencer, placez une lame de maintien sur la scène d’un microscope à dissection et placez la lamelle de couverture sur la lame de maintien. Ensuite, pipeter quatre microlitres de la solution disséquante au centre de la lamelle de couverture et déplacer la glissière de maintien d’un côté de la scène pour libérer la vue.
Prélever 10 à 20 hermaphrodites d’une plaque NGM dans la goutte de solution de dissection. Il est préférable d’en choisir environ 10 par diapositive, mais pas au point de ne pas pouvoir être disséquées en cinq minutes. Pour disséquer les animaux, croisez les pointes des aiguilles pour former une forme de X et utilisez le bas du X pour épingler un adulte à la surface de la lamelle de couverture.
Ensuite, positionnez la forme en X immédiatement derrière le pharynx, environ un cinquième de la longueur du corps d’un jeune adulte ou juste en dessous de la partie claire de la tête. Ensuite, décapitez l’animal avec un mouvement de ciseaux, libérant complètement de la cavité corporelle, avec une ou les deux moitiés de l’intestin. Pour fixer l’échantillon avec du formaldéhyde, pipeter quatre microlitres de la solution de fixation sur la lame, très près de la goutte avec les animaux, tout en évitant de pipeter directement dans la goutte de dissection et de déplacer les carcasses disséquées.
Épinglez le bordereau de couverture à la lame de maintien à l’aide d’un doigt. De l’autre main, effleurez doucement le bordereau plusieurs fois pour mélanger les gouttes. En tenant une lame chargée positivement à l’avant vers le bas, utilisez-la pour ramasser la lamelle de couverture au centre de la lame en touchant doucement la goutte d’échantillon, et la tension superficielle de la goutte ramassera la lamelle de couverture.
Placez la glissière sur le banc et fixez pendant exactement cinq minutes à température ambiante. Pendant ce temps, étiquetez la diapositive avec un crayon. Pour congeler, craquer l’échantillon à l’aide d’azote liquide tout en maintenant le bord marqué de la lame avec une pince à épiler, abaissez-le doucement en azote liquide.
Relâchez la glissière, de sorte qu’elle s’appuie contre le côté du bécher avec le côté couvercle vers le haut, et les glissières sont gelées dans les 10 secondes. Si vous utilisez de la glace sèche pour geler, après avoir gratté le givre de la surface du bloc d’aluminium avec un rasoir, maintenez fermement le bord étiqueté de la glissière et placez-le sur la surface dégagée, en appliquant une certaine pression vers le bas pour assurer un contact complet avec le bloc. La congélation se produit dans les 10 secondes lorsque l’échantillon sous la lamelle de couverture se transforme en glace.
Retirez la lame gelée en saisissant fermement le bord court étiqueté de la glissière et en calant un long bord contre le banc. De l’autre main, saisissez fermement un rasoir et faites glisser le bord du rasoir le long de la glissière pour retirer le bordereau et l’éloigner de l’échantillon. Placez immédiatement la lame dans un pot Coplin contenant 95% d’éthanol et laissez les lames dans l’éthanol pendant au moins cinq minutes.
Ensuite, lavez les lames dans PBST trois fois pendant cinq minutes chacune à température ambiante, tout en utilisant du PBST frais pour chaque lavage. Les résultats de l’imagerie par fluorescence des noyaux germinaux ont démontré que le DAPI se lie fortement à l’ADN. La coloration par immunofluorescence était efficace lorsque l’anticorps ciblant RAD-51, un marqueur des cassures double brin, était présent sous forme de foyers discrets dans les noyaux miotiques, co-localisés sur des chromosomes marqués par DAPI.
Les mutants hétérozygotes kle-2 présentent des défauts mineurs dans la structure chromosomique, comme le montrent une coloration DAPI légèrement désordonnée et une augmentation du nombre de cassures double brin, reflétées dans le nombre plus élevé de foyers RAD-51. Les étapes de dissection et de congélation peuvent être délicates, il est donc important de travailler rapidement et en douceur. Nous vous recommandons de pratiquer ces étapes avant d’essayer l’ensemble du protocole.
Par exemple, vous pouvez vous entraîner à disséquer dans un plus grand volume de liquide, comme 200 microlitres, et à travailler progressivement jusqu’à notre volume recommandé de quatre microlitres dans un couvercle. Cette technique peut être utilisée pour l’imagerie à haute résolution sur un microscope confocal ou à illumination structurée, ou elle peut être utilisée en combinaison avec l’ADN ou l’ARN-FISH, hybridation in situ par fluorescence, pour visualiser comment les protéines se localisent par rapport à des séquences spécifiques.
