Le système de test de transcription in vitro pour Borreliella burgdorferi fournit un outil biochimique aux chercheurs pour étudier les mécanismes de régulation des gènes et les facteurs qui régissent l’activité enzymatique de l’ARN polymérase. Le système nous permet de tester l’impact des facteurs de transcription, des cofacteurs, des concentrations de sel et du pH sur la fonction de l’ARN polymérase de Borreliella burgdorferi, ce qui contribue à notre compréhension globale des mécanismes de régulation des gènes. Cette technique puissante peut également nous permettre de dépister des médicaments qui inhibent sélectivement l’ARN polymérase, ouvrant la porte au développement de nouveaux médicaments pour traiter la borréliose de Lyme.
Pour commencer, prélever la pastille cellulaire de deux à quatre litres de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivée en milieu BSKII dans un environnement microaérophile à une densité de deux à quatre fois 10 constante par millilitre. Ensemencez les cellules à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans des bouteilles centrifuges de 500 millilitres et jetez le surnageant. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 30 millilitres de tampon HN glacé, répétez l’étape de centrifugation et décanter le surnageant.
Pendant le travail, maintenez les cellules, le lysat et les protéines purifiées à quatre degrés Celsius ou sur de la glace à moins de congélation. Conserver l’ARN polymérase dans un environnement réducteur en ajoutant du dithiothréitol fraîchement préparé à une concentration de deux millimolaires à chaque tampon utilisé et maintenir un pH de 8,0. Préparer le lysat à partir de la pastille cellulaire de Borreliella burgdorferi à l’aide d’un kit de lyse bactérienne commercial.
Remettez la pastille en suspension dans 10 à 15 millilitres de solution B-PER sans inhibiteur de protéase et laissez la lyse se dérouler pendant cinq minutes sur de la glace. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase à la solution de lyse et procéder à trois cycles de sonication. Maintenant, clarifiez le lysat cellulaire par centrifugation et filtration à l’aide d’un tube à centrifuger de 50 millilitres.
Ajoutez un tampon de chargement de colonne de cobalt à la solution, ce qui porte le volume total à 30 millilitres. Enduire les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 fois G pendant 30 minutes. Plus tard, filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre et diluer le tampon de chargement de la colonne de lysat et de cobalt jusqu’à un taux de dilution final de 1:10.
Effectuer une chromatographie d’affinité sur le surnageant de lysat cellulaire clarifié à l’aide d’une colonne de résine de cobalt ou de nickel en suivant les instructions du fabricant. Conservez les échantillons à écoulement, lavés et élués pour analyse. Remplacer immédiatement la solution tampon de la solution de polymérase ARN avec la solution tampon de stockage à l’aide d’une colonne d’échange tampon en suivant les instructions du fabricant.
Ensuite, concentrez l’ARN polymérase à une concentration de 0,2 à 0,4 milligramme par millilitre à l’aide d’unités de filtration centrifuges à coupure de 10 kilodaltonnes. Déterminer la concentration par spectrophotomètre et préparer les stocks de congélation. Aliquote 20 à 50 microlitres de volumes d’ARN polymérase congelant les stocks dans des tubes PCR et stockant l’ARN polymérase à moins 80 degrés Celsius.
Préparer les surfaces de travail, y compris le banc de rayonnement, afin de réduire la contamination par les radiations. Décongeler les stocks d’ARN polymérase et de RpoD frais sur la glace et bien mélanger tous les stocks congelés décongelés avant le pipetage Préparer un mélange réactionnel principal dans un mélange NTP séparé pour les nucléotides radiomarqués conformément aux exigences expérimentales. Distribuer les réactions de contrôle dans des ensembles expérimentaux dans des tubes PCR.
Après avoir distribué de l’eau, du mélange réactionnel, de l’ARN polymérase et du RpoD dans des tubes PCR désignés, mélanger les réactifs par pipetage. Transférer les matériaux préparés sur un banc de radiation, ajouter de l’ATP marqué alpha-32P au NTP et mélanger par pipetage doux. Ajouter du NTP aux tubes contenant les mélanges de réaction de transcription in vitro et commencer la réaction de transcription in vitro en ajoutant un modèle d’ADN.
Mélanger le volume de réaction en pipetant doucement et incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocycleur ou un bloc thermique. Retirer les réactions du thermocycleur ou du bloc thermique et arrêter les réactions de transcription in vitro en ajoutant un volume égal de colorant de charge d’ARN 2X contenant 50% de formamide au mélange réactionnel. Dénaturation des enzymes par incubation de réactions à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
À l’aide de l’électrophorèse sur gel, séparer l’ARN transcrit in vitro dans des gels de polyacrylamide d’urée TBE de 10 % à 15 % à 180 volts pendant 30 à 45 minutes. Après avoir retiré toute partie du gel contenant de l’ATP radiomarqué non incorporé, exposez le gel à l’écran phospho pendant la nuit et imagez l’ARN radiomarqué à l’aide d’un imageur phosphoscreen. Le SDS-PAGE a montré trois bandes correspondant à trois peptides, RpoC, RpoB et RpoA du complexe ARN polymérase.
Un peptide de 115 kilodaltons correspondant à la taille du RpoD recombinant Borreliella burgdorferi marqué MBP a également été observé. Le clivage du mélange de protéines avec la protéase de facteur XA a conduit à la génération de deux produits importants, RpoD et MBP. Le site promoteur de Borreliella burgdorferi FLGB a été généré par PCR.
Une double dilution de la concentration de RpoD donne lieu à un niveau plus faible du produit d’ARN accumulé. Une faible concentration d’ARN polymérase donne moins de produits d’ARN dans toute la gamme de concentrations de RpoD. Le signal de densitométrie indiquait une relation linéaire entre la quantité de RpoD présente dans la réaction dans les deux expériences.
L’activité enzymatique de l’ARN polymérase est sensible à divers facteurs au cours du processus de purification, de stockage et d’expérimentation. Des enzymes et des réactifs frais, ainsi qu’une bonne planification, donnent les meilleures chances possibles de succès dans ce protocole.
