Tous les organismes ont un trouble dans leur protéome, estimé jusqu’à 33%Ces régions sont observables par spectrométrie de masse d’échange hydrogène/deutérium, mais seulement dans la plage de temps de la milliseconde. Notre protocole vous montrera comment le faire avec succès. Il s’agit d’une technique d’analyse entièrement automatisée.
Il vous suffit de tout configurer, de programmer les mesures de temps souhaitées, de cliquer sur aller et de vous éloigner. Cette technique ouvre la possibilité passionnante de cribler des composés qui stabilisent les confirmations spécifiques de protéines intrinsèquement désordonnées telles que l’alpha-synucléine. Pour commencer la préparation de l’échantillon pour la cartographie peptidique, prélevez d’abord un flacon de stock de protéines alpha-synucléine stockées dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Et une fois qu’il est décongelé, filtrez à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, mesurez l’absorbance de la solution à 218 nanomètres pour déterminer la concentration en protéines en utilisant la loi de Beer-Lambert, et diluez la protéine avec un tampon d’équilibre à une concentration finale de cinq micromolaires. Ensuite, pour configurer le robot échantillonneur automatique, ajoutez 50 microlitres de la solution de protéines micromolaires à un flacon de récupération totale et placez le flacon en position d’échantillon dans la chambre droite de l’échange hydrogène/deutérium, ou HDX, robotique en ligne avec le spectromètre de masse.
Ensuite, placez un flacon de tampon d’équilibre et deux flacons de tampon de lavage de pepsine aux positions de réactif un, quatre et cinq des chambres gauches et un flacon de tampon de trempe à la position de réactif un dans la chambre droite HDX et réglez la température à 20 degrés Celsius à l’aide du régulateur de température Peltier. Ajoutez ensuite un nombre égal de flacons de récupération totale et de flacons de récupération maximale dans les mêmes positions de réaction de la chambre gauche HDX et de la chambre droite HDX respectivement. Ensuite, configurez un exemple de liste avec les méthodes LC et MS appropriées dans le logiciel de planification et démarrez la planification.
Pour obtenir la carte finale de couverture peptidique, organisez manuellement les affectations isotopiques dans le logiciel d’analyse de données DynamX HDX. Après avoir nettoyé l’instrument prototype Fast HDX, ouvrez l’interface utilisateur graphique du logiciel HDX compatible pour initialiser le système. Entrez 20 degrés Celsius et 0,5 degré Celsius comme températures de la chambre d’échantillonnage et de la chambre de trempe respectivement, puis cliquez sur définir pour appliquer les nouvelles températures.
Pour nettoyer et préparer l’instrument, installez les tubes de centrifugeuse avec de l’eau de qualité LC / MS à toutes les entrées, puis vérifiez les seringues gauche et droite dans l’onglet de livraison de la plomberie du titreur et continuez à cliquer sur prime jusqu’à ce que toutes les bulles d’air latentes dans les tubes aient disparu. Pour cocher toutes les cases pour les seringues, allez d’abord dans l’onglet macros et cliquez sur calibrer la position d’accueil des seringues, puis cliquez d’abord sur la boucle de chargement de la seringue de lavage, puis sur laver tous les volumes de la boucle de mélange. S’il y a une bulle dans une seringue tampon, débranchez la seringue et dégazez-la en éjectant verticalement la bulle.
Avant de recalibrer à la position zéro, remplacez la seringue. Pour configurer l’instrument prototype Fast HDX pour les expériences HDX, insérez d’abord le tube d’entrée de titrage gauche dans le flacon de récupération totale. Pour éviter l’oligomérisation et l’agrégation induites par la température, placez le tube dans un réfrigérateur de table.
Ensuite, ajoutez 50 millilitres de tampons d’équilibre, d’étiquetage, de trempe et de lavage à la pepsine aux entrées tampons respectives dans les chambres droite et gauche de l’instrument, puis ajoutez 50 millilitres de tampon de lavage de colonne à l’entrée de lavage de pepsine. Pour amorcer les lignes de lavage des protéines et des colonnes, vérifiez les seringues droite et gauche dans l’onglet de livraison de la plomberie du titreur et cliquez une fois sur prime. Après avoir coché toutes les cases pour les seringues comme illustré précédemment, allez à l’onglet de débit de trempe manuelle pour entrer les paramètres requis.
Pour une expérience de cours temporel, utilisez le bouton de point symbolique pour entrer les heures en millisecondes. Réglez ensuite le temps d’interruption sur trois et l’attente pour que la CLHP piège le temps plus le temps d’exécution plus 1,5 minutes. Si des expériences vides sont exécutées entre des exécutions d’échantillons, cliquez sur la case Exécuter vide après avoir vérifié une entrée dans le logiciel d’acquisition pour l’exécution vide après chaque exécution d’échantillon.
Une fois que la liste d’exemples est prête et que les entrées appropriées ont été mises en surbrillance, démarrez l’exécution en cliquant sur lecture et Fast HDX dans le logiciel. Pour le traitement des données, ouvrez le menu fichier du fichier des peptides attribués spectralement à partir des expériences de cartographie des peptides et cliquez sur Ouvrir dans le logiciel DynamX, puis importez les fichiers bruts dans le logiciel DynamX. Après avoir ouvert le menu de données, cliquez sur MS Files.
Pour créer des états pour chaque condition protéique étudiée, cliquez sur nouvel état. Pour ajouter chaque point temporel HDX, cliquez sur nouvelle exposition, puis sur nouveau brut. Pour importer des fichiers bruts, faites glisser chaque fichier à la bonne position et cliquez sur OK lorsque vous avez terminé.
Après avoir attribué automatiquement des isotopes, organisez manuellement l’affectation isotopique pour garantir une qualité de données élevée. Exportez les données du cluster dans un fichier csv avec l’ordre des colonnes décrit dans le manuscrit. Ouvrez le menu de données dans le logiciel de mesure de masse et cliquez sur exporter les données du cluster.
Pour l’analyse des données, chargez d’abord les données en cluster exportées dans le logiciel d’analyse HDX HDfleX. Pour adapter les données expérimentales à toutes les expériences et à tous les états, sélectionnez les méthodes de correction de back-exchange appropriées pour obtenir les constantes de vitesse observées pour la réaction HDX. Calculez ensuite un seuil de signification global à l’aide d’une méthode préférée dans HDfleX et effectuez des tests de signification hybride pour déterminer les différences significatives entre les états comparés.
L’expérience de cartographie sur l’alpha-synucléine a généré une carte de couverture peptidique qui couvrait 100% de la séquence protéique avec une redondance moyenne de 3,79. De plus, ce protocole a permis la génération de courbes d’absorption du deutérium pour différents peptides de l’alpha-synucléine, qui ont ensuite été exprimées sous forme de graphiques ajustés et corrigés de l’échange arrière. Il était évident que la plupart des échanges hydrogène/deutérium dans l’alpha-synucléine se faisaient en une seconde.
La différence conformationnelle entre les états A et B de l’alpha-synucléine était également évidente à partir de l’absorption plus élevée du deutérium par l’état B à la fois aux niveaux de peptide et d’acide aminé. Pour une technique aussi sensible, il est important d’utiliser des tests de signification statistique robustes lors de la comparaison des données. Ici, nous avons utilisé notre logiciel HDfleX.
