Ce protocole permet la fabrication pratique de microgels de chitosane sans solvants toxiques qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications d’ingénierie tissulaire et d’administration de médicaments. Cette technique ne nécessite pas d’équipement ou de formation spéciale et ne nécessite pas de techniques d’émulsion toxique ou de rinçage au solvant, ce qui la rend hautement biocompatible et traduisible en milieu clinique. Nous avons appliqué cette technique comme stratégie de biomatériau pour traiter les blessures des plaques de croissance.
Cependant, nous pensons que cette technique sera également utile dans d’autres applications de médecine régénérative. Cette technique peut être appliquée à d’autres applications de médecine régénérative qui bénéficieraient d’un système d’échafaudage de biomatériaux injectables et biodégradables pouvant entraîner une libération prolongée de médicaments. Commencez par ajouter de l’acide acétique et du chitosane purifié à une seringue Luer lock de 10 millilitres pour former une solution de chitosane à 6 % poids par volume.
À l’aide d’un connecteur Luer lock femelle femelle, connectez deux seringues Luer lock, puis mélangez la solution d’avant en arrière jusqu’à ce que le chitosane soit complètement dissous dans l’acide ascétique. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de la solution de genipine à la seringue contenant du chitosane et mélangez d’avant en arrière entre les seringues pendant 30 secondes, puis éjectez le mélange de la seringue sur une boîte de Petri de 35 millimètres. Couvrir la boîte de Petri avec un film de paraffine et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans une atmosphère humidifiée.
Utilisez une spatule pour briser l’hydrogel en plus petits morceaux, puis placez un filtre de la taille de maille souhaitée à l’arrière d’une seringue propre de 10 millilitres. Transférer les morceaux de gel cassés dans la seringue équipée du filtre et ajouter 6 millilitres d’eau double distillée. Connectez la seringue via un connecteur de verrouillage Luer à une autre seringue propre de 10 millimètres.
Forcez le mélange de gel et d’eau à travers la seringue avec le filtre pour créer des microgels. Après la première filtration, ouvrez la seringue contenant le filtre et ajoutez le mélange dans cette seringue. Forcez à nouveau le mélange à travers le filtre.
Maintenant, transférez le mélange de gel filtré dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez de l’eau distillée double pour porter le volume à 20 millilitres. Vortex la solution pour obtenir une solution homogène. Centrifuger les microgels à 100 fois g pendant 5 minutes à température ambiante.
Après centrifugation, retirer la phase aqueuse supérieure et remettre en suspension les microgels dans 10 millilitres d’éthanol à 70%, puis vortexer les microgels et les placer sous la lumière UV pendant une heure pour stériliser. Maintenant, centrifugez les microgels à 1000 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Jeter l’éthanol et rincer 3 fois à l’eau distillée double.
Remettre en suspension les granulés de microgel dans un volume égal d’eau double distillée. Avec l’augmentation du pH, les microgels ont montré une diminution de l’enflure comme le montre le changement de diamètre de Feret. En outre, la taille des particules de microgel dépend de la taille des pores du filtre utilisé.
Le maillage numéro 200 produisait de petites particules, tandis que le maillage numéro 100 donnait naissance à de grosses particules. La présence de microgels sur le site blessé a favorisé la régénération du cartilage. La coloration à l’hématoxyline bleu Alcian a montré que les microgels injectés sur le tissu lésé empêchaient la formation précoce de barres osseuses et que les microgels chargés d’agents bioactifs SDF-1a et TGF-B3 favorisaient la formation de cartilage.
Il est important de s’assurer que le filtre en treillis métallique est placé correctement dans la seringue afin qu’un filtrage efficace puisse avoir lieu. Il est également important de répéter la filtration plusieurs fois pour assurer une distribution homogène de la taille du microgel. Ces microgels peuvent être appliqués à une grande variété d’applications d’ingénierie tissulaire qui nécessitent un substrat d’échafaudage de biomatériau qui a le potentiel de libérer durablement des produits thérapeutiques.
