La peau contient plusieurs types de cellules, y compris les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules nerveuses de Schwann. Ce protocole permet d’isoler chacun de ces types de cellules pour des expériences in vitro. L’isolement et l’établissement de cultures cellulaires primaires individuelles à partir d’un seul donneur permettent des comparaisons robustes et des expériences de co-culture, tout en atténuant les effets de la variation génétique.
Avec ce protocole, l’analyse des cellules individuelles et de leurs interactions permet d’analyser le rôle des cellules de Schwann dans l’homéostasie et la physiopathologie de la peau. Ces populations cellulaires distinctes peuvent être utilisées pour étudier les cellules de Schwann, les fibroblastes ou les kératinocytes, individuellement ou en combinaison dans la physiologie normale de la peau, la cicatrisation des plaies ou dans les états de maladie de la peau. Jagadeeshaprasad M G, un chercheur postdoctoral dans mon laboratoire m’aidera à démontrer la procédure.
Après avoir acquis le prépuce néonatal selon les procédures de soins standard, placez le prépuce excisé dans un tube de microcentrifugation contenant huit à 10 millilitres de milieu basal DMEM glacé et transportez immédiatement le prépuce au laboratoire de culture cellulaire pour l’isolement cellulaire. Rincez le prépuce deux fois avec 20 à 25 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou DPBS de Dulbecco, contenant des antibiotiques et des antimycotiques. Ensuite, trempez la peau lavée dans 25 à 30 millilitres de milieu basal DMEM glacé dans un plat de culture tissulaire de 10 centimètres.
Après 15 minutes, ouvrir le prépuce à l’aide d’un scalpel pour exposer le derme et le tissu adipeux sous-cutané. Utilisez une pince, une lame de scalpel et des ciseaux pour enlever et jeter le tissu adipeux sous-cutané. Ensuite, coupez le prépuce propre en trois à cinq petits morceaux et incubez les morceaux de peau dans 16 à 20 millilitres de milieu Dispace one DMEM dans un tube conique stérile.
Au cours des 30 premières minutes d’incubation avec Dispace, on mélange par intermittence les morceaux de peau dans le tube conique par inversion. Placez ensuite le tube conique à quatre degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Le lendemain, retirez les morceaux de peau et placez-les sur un plat de culture stérile sec et déroulez chaque morceau de peau de sorte que la couche externe de l’épiderme touche le plat de culture.
En commençant par le bord du tissu, pelez l’épiderme loin du derme à l’aide de deux pinces. Ajouter les fragments d’épiderme séparés à cinq millilitres de HBS dans une boîte de culture de 10 centimètres pour incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, collectez la solution HBS dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez cinq millilitres de tampon de neutralisation de la trypsine ou T et B dans le tube conique.
Mettez le tube de côté. Aux fragments épidermiques dans la boîte de culture, ajoutez trois millilitres de solution de trypsine pour incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, agitez doucement les fragments épidermiques avec des pinces jusqu’à ce que la solution de kératinocytes de trypsine devienne trouble.
Ajoutez ensuite la solution de kératinocytes de trypsine au tube HBS T et B. Après avoir dissous des fragments épidermiques non digérés avec une solution d’EDTA de trypsine, ajouter deux millilitres de FBS au tube HBS T et B contenant une solution d’EDTA de trypsine et centrifuger les deux environ 870 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu de croissance complet des kératinocytes, suivie d’une filtration de la suspension cellulaire avec un filtre stérile de 100 micromètres dans un tube conique stérile de 50 millilitres.
Une fois le nombre de cellules et la viabilité cellulaire quantifiés, ensemencez les cellules dans les plaques de culture pour les placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%. Après deux jours, aspirez les cellules non adhérentes et rafraîchissez le milieu de culture cellulaire tous les deux jours jusqu’à ce que les kératinocytes atteignent 50 à 80% de confluence pour le passage ou les expériences en aval. Préposer les flacons T25 avec de la poly-l-lysine ou de la PLL, en utilisant cinq millilitres de DPBS et placer les flacons pré-enduits à 37 degrés Celsius pendant trois heures.
Plus tard, lavez la matrice de revêtement PLL deux fois avec DPBS. Après avoir lavé les morceaux isolés du derme avec cinq millilitres de milieu basal DMEM, hachez le derme en petits morceaux avec des ciseaux. Digérer le derme haché avec cinq millilitres de collagénase à 37 degrés Celsius pendant deux heures et demie, avec un titrage doux à l’aide d’une pointe de pipette toutes les 30 minutes jusqu’à ce que le derme se dissocie complètement.
Une fois digérée, filtrer la suspension cellulaire avec une passoire cellulaire de 70 micromètres, suivie d’une dilution de la suspension cellulaire filtrée avec cinq millilitres de milieu DMEM complet pour arrêter l’activité enzymatique de la collagénase. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 870 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et remettez en suspension le bulletin de vote de la cellule dans deux millilitres de milieu complet DMEM pour diviser les cellules. Après avoir répété le processus de centrification tel que décrit, aspirez le surnageant pour utiliser la pastille cellulaire afin d’isoler les cellules de Schwann ou les fibroblastes.
Pour isoler les cellules de Schwan, resuspendez la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu complet DMEM frais et quantifiez le nombre de cellules et la viabilité avant d’ensemencer cinq millilitres des cellules remises en suspension dans des flacons T25 précodés à une densité de 4,0 fois 10 aux trois cellules par millilitre. Incuber la fiole à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 16 heures, confirmez l’adhésion cellulaire par microscopie à un grossissement de 10X.
Ensuite, retirez les cellules de non-adhérence et lavez la fiole trois fois avec cinq millilitres de DPBS. Ensuite, incuber les cellules avec cinq millilitres de 10 micromolaires cytosine arabinoside dans un milieu complet DMEM. Après 24 heures, aspirer le milieu contenant de l’arabinoside cytosine avant de rincer la fiole comme démontré précédemment.
Remplissez la fiole de culture avec cinq millilitres de cellules de Schwann pour compléter le milieu de culture pour incuber 48 heures, tout en rafraîchissant le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules de Schwann atteignent 80% de confluence. Pour isoler les fibroblastes, remettez en suspension la pastille collectée dans cinq millilitres de fibroblastes en milieu complet. Cultiver les cellules dans des flacons de culture T25 non codés pendant 24 heures, comme démontré pour les cellules de Schwann.
Après avoir aspiré les cellules non adhérentes et lavé la fiole, incuber les cellules avec cinq millilitres de fibroblastes frais en milieu complet à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Comme les cellules primaires isolées ont été cultivées dans des milieux de culture cellulaire respectifs, les kératinocytes primaires ont atteint 85% de confluence au septième jour et ont présenté une morphologie cellulaire caractéristique avec une forme pavée. Les cellules de Schwann ont atteint 95% de confluence au cinquième jour et semblaient de forme bipolaire ou tripolaire.
Les cultures de fibroblastes ont atteint 95% de confluence au quatrième jour et la plupart des cellules présentaient une morphologie en forme de fuseau. La coloration par immunofluorescence a confirmé l’expression de protéines spécifiques au type cellulaire dans les cultures cellulaires. Les kératinocytes étaient positifs pour les protéines K10 et K14.
Les images fusionnées de l’immunofluorescence de la kératine et de la coloration nucléaire DAPI ont indiqué une pureté de 97,8% des cultures cellulaires. De même, les cellules de Schwann étaient positives pour S100 et P75 NTR et avaient une pureté de 95,2% dans la culture. Les fibroblastes ont exprimé positivement la vimentine, mais n’ont pas exprimé l’actine du muscle alpha lisse, un marqueur myofibroblastique.
La pureté de la culture était d’environ 97,2% Pour améliorer les preuves de Shanse, un plat pré-enduit de poly-l-lysine peut être utilisé. Et pour atténuer davantage la contamination fibreuse, la cytosine arabinoside et l’agent antimycotique ont été ajoutés après l’ajout de cellules pendant une courte période. Il s’agit d’une procédure expérimentale simple et peu coûteuse pour établir les trois cellules primaires, telles que les cellules shwann, les kératinocytes et les fibroblastes, à partir d’une seule peau antérieure humaine.
Ce protocole est idéal pour les expériences in vitro impliquant la communication cellulaire ou la diaphonie entre les types de cellules.
