Ces méthodes peuvent aider à étudier la progression de l’inflammation chronique associée aux reins chez les patients atteints de lupus. Nous offrons une alternative fiable et rentable qui peut être utilisée pour surveiller l’évolution de la maladie dans le lupus. Commencez à stériliser la hotte en pulvérisant de l’éthanol à 70% et placez une feuille de plastique stérile sur la surface.
Préparez ensuite des embouts, des tubes de 1,5 millilitre et une pipette pour recueillir environ 20 microlitres d’urine. Prenez la cage et vaporisez de l’éthanol à 70% avant de la placer à l’intérieur de la hotte. Ensuite, tenez la souris d’une main et utilisez l’autre main pour masser doucement la région ventrale de haut en bas.
À l’aide d’un tube ou d’une pipette de 1,5 millilitre, recueillir l’urine directement. Ou si les gouttes d’échantillon le recueillent sur la feuille de plastique. Remettez ensuite la souris dans la cage.
Couper les reins disséqués en granulométrie et les digérer dans cinq millilitres de tampon de digestion contenant de la collagénase et de la DNase 1 dans un milieu RPMI 1640 contenant de l’HEPES pendant une heure avec agitation douce continue à 37 degrés Celsius. Ajouter 10 millilitres de PBS glacé contenant 10 millimolaires d’EDTA et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Puis vortex la suspension deux fois.
Plus tard, filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire de 100 micromètres et lavez avec 10 millilitres de HBSS plein. Ensuite, centrifuger à 350 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Préparer une solution de Percoll isotonique à 30, 37 et 70 % et ajouter une couche de solution de Percoll à 37 % par-dessus la solution à 70 %.
Re suspendre les cellules dans cinq millilitres de Percoll isotonique à 30%. À l’aide d’une pipette Pasteur, chargez lentement 37% de cinq millilitres en haut et 70% de cinq millilitres en bas, ce qui rend le gradient de Percoll isotonique du stock. Ensuite, centrifuger avec le numéro neuf et le numéro zéro à 1000 fois G pendant 30 minutes à température ambiante.
Ensuite, collectez les leucocytes de l’interface 37 à 70% et remettez-les en suspension dans cinq millilitres de C 10. Encore une fois, centrifuger à 350 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Par la suite, remettre en suspension la pastille de la cellule dans trois millilitres de tampon de télécopie et centrifugeuse à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez ensuite le surnageant en laissant environ 50 microlitres du volume total. Ajouter 50 microlitres de bloc récepteur FC par tube. Ensuite, mélangez et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 10 minutes.
Plus tard, ajoutez deux millilitres de tampon fax pour le lavage. Ensuite, centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant en laissant environ 50 microlitres du volume total. Ensuite, ajoutez 20 microlitres du colorant fluorescent approprié et laissez-le reposer pendant 15 à 30 minutes sur de la glace.
Ajouter 50 microlitres de mélange d’anticorps par tube contenant CD 138 brilliant violet seven 11 et CD 45 Alexa Fluor 700 et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de tampon de fax. Centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Retirer le surnageant par aspiration en laissant environ 50 microlitres du volume total. Plus tard, remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de PBS. Pour prélever l’échantillon, intégrez le demi-rein dans le petit cryomoule en plastique avec le composé à température de coupe optimale.
Ensuite, ajoutez de la glace sèche dans une boîte en mousse de polystyrène et placez soigneusement le cryomoule sur la glace sèche. Ensuite, retirez le cryomoule, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Ensuite, fixez les sections sèches à quatre micromètres avec de l’acétone froide pendant 10 minutes.
Après avoir fixé les lames, séchez-les à l’air pendant 0,5 à une heure et conservez-les à moins 20 degrés Celsius pendant une courte période ou moins 80 degrés Celsius pendant une longue période. Pour colorer les échantillons, refixez les lames dans de l’acétone froide pendant cinq à 10 minutes et laissez les sections se réchauffer à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un stylo pat, tracez un cercle hydrophobe autour de la section et laissez-la sécher.
Ensuite, placez les lames dans TBS dans le pot Copeland pendant 20 minutes et agitez doucement en mettant le pot sur le shaker. Ensuite, versez TBS et remplissez le pot avec TBS 5% BSA et 0,1% TW 20. Plus tard, incuber le pot pendant 20 minutes en agitant doucement sur le shaker.
Ensuite, retirez les diapositives et essuyez le bas des diapositives. Ajouter 100 microlitres d’anticorps conjugués C3 fit C et IgG2 APE à la section et incuber la température ambiante dans une chambre humidifiée pendant une heure. Laver la section trois fois dans du PBS 5%BSA et 0,1%TW 20 pendant 10 minutes sur le vibreur, puis sécher les lames.
Montez la section avec un réactif anti-décoloration, puis avec un couvercle. Conservez ensuite les lames à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient observées au microscope. Pour l’analyse d’image à l’aide du logiciel image J, décrivez la région souhaitée.
Ensuite, définissez les paramètres standard en cliquant sur analyser, puis définissez les mesures et mesurez la zone pour obtenir les résultats. Ensuite, transférez les données obtenues à partir des fenêtres de mesure vers une feuille de calcul. Une fois cela fait, cliquez sur analyser pour mesurer la région et transférez à nouveau les données vers la feuille de calcul précédente.
Les niveaux de protéines dans l’urine des souris LMR LPR ont été détectés au fil du temps lorsqu’elles ont été traitées avec une solution saline tamponnée au phosphate comme groupe témoin et lactobacillus reuteri comme groupe de traitement. Le groupe de souris traitées avec L. reuteri à une progression protéinurique plus agressive que le groupe témoin. L’analyse par fax a été effectuée pour les leucocytes rénaux isolés afin d’analyser les plasmocytes.
En outre, les souris ont été traitées avec de la vancomycine ou de la vancomycine avec de l’ADN double brin d’Escherichia coli. Bien que l’on s’attendait à ce que l’ADN double brin d’Escherichia coli déclenche l’infiltration rénale, aucune différence significative n’a été observée dans le pourcentage de plasmocytes. Le complément C3 et les IgG2a ont été détectés par coloration par immunofluorescence sur des coupes rénales LMR féminines IPR.
Les facteurs environnementaux efficaces sur les dépôts rénaux de C3 et d’IgG2a ont été comparés pour le pain de souris maison dans l’animalerie et ceux achetés auprès d’un vendeur. L’analyse immunohistochimique n’a montré aucune différence entre les deux groupes. L’ajout de chaque couche de la solution ISO 20 Percoll en pourcentage peut être difficile, et si elles se mélangent, vous devez recommencer.
Cette procédure aide avec le cytomètre de flux et dans les expériences de vitter, de sorte que vous ne pouvez pas étudier les différents types de cellules rénales des populations. Cette procédure nous permet d’étudier les infiltrats de cellules B dans les reins et il n’y a pas beaucoup d’informations dans la littérature.
