Cette méthode tente de décrire trois méthodes fréquemment utilisées pour évaluer la migration des neutrophiles normaux in vivo et in vitro ainsi que l’infiltration de neutrophiles pathologiques dans le modèle de l’arthrite de souris. Nous pensons que cette méthode pourrait être utile pour d’autres chercheurs dans ce domaine. Ce protocole contient les détails méthodologiques pour évaluer la capacité de migration des neutrophiles dans les sites d’inflammation en utilisant l’analyse de poche d’air et l’arthrite induite par l’adjuvant.
Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie d’arthrite en comparant le groupe modèle avec le groupe de traitement. Cette méthode pourrait fournir un aperçu de la maladie inflammatoire et peut être appliquée aux maladies inflammatoires de l’intestin. Qingyi Lu et Haixu Jiang, étudiants de troisième cycle de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Après anesthésie des souris le jour zéro, utilisez un filtre de 0,22 micron attaché à une seringue de cinq millilitres pour obtenir un volume de trois millilitres d’air stérilisé. Soulevez la peau arrière de la souris anesthésiée avec des pinces à épiler et utilisez sous-cutanéement une aiguille de calibre 26 par 3/8 pouces pour injecter trois millilitres de l’air stérilisé. Après le traitement, retirez les souris de l’unité respiratoire et placez-les dans une cage bien fixée.
Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles sont vivantes jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer. Le troisième jour, injectez trois millilitres supplémentaires d’air stérilisé dans la poche d’air précédemment établie pour soutenir la poche d’air. Le sixième jour, injectez différents traitements dans la poche d’air.
Injectez un millilitre de PBS comme un contrôle négatif et injectez un millilitre d’un microgramme par millilitre de LPS comme le contrôle positif pour induire l’inflammation locale. Après six heures, sacrifiez les souris. Pour chaque poche d’air, injectez un millilitre de tampon de lavage pour laver la poche d’air et recueillir l’exsudate inflammatoire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Lavez ensuite la poche d’air avec deux millilitres de tampon de lavage deux fois et recueillez l’exsudate inflammatoire dans le même tube de centrifugeuse. Centrifugeuse à 100 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en un millilitre de tampon de lavage.
Comptez les cellules pour quantifier le rapport neutrophile à l’aide de l’analyseur automatique d’hématologie. Suspendez l’adjuvant complet de Freund en vortexant au moins cinq secondes, puis dessinez 100 microlitres de suspension dans un injecteur d’insuline. Après anesthésie, marquer la patte choisie et injecter 20 microlitres de l’adjuvant complet de Freund de l’injecteur en quatre taches périarticulaires sur l’espace articulaire de la cheville.
Mettez les souris traitées dans la nouvelle chambre. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles respirent jusqu’à ce qu’elles retrouvent la capacité de bouger. Tous les trois jours, utilisez une jauge d’épaisseur de poche pour mesurer le diamètre de l’articulation de la cheville.
Évaluez également la gravité de l’arthrite par critère de notation de l’arthrite. Zéro est normal. Aucune évidence de l’érythème et de l’enflure.
L’une est l’arthrite la plus légère. Érythème et gonflement léger confiné aux tarsaux ou à l’articulation de la cheville. Deux est l’arthrite modérée.
Érythème et gonflement léger s’étendant de la cheville aux tarsals. Trois est l’arthrite sévère. Érythème et gonflement modéré s’étendant de la cheville aux articulations métatarsiennes.
Quatre est l’arthrite la plus grave. L’érythème et l’enflure grave englobent la cheville, le pied et les chiffres, ou l’ankylose du membre. Après avoir sacrifié la souris, retirez la peau et une partie du muscle de la patte arrière avec des pinces à épiler et des ciseaux.
Vaporiser l’articulation avec 70% d’éthanol et enlever le reste des muscles à l’aide d’une serviette en papier. Fixer l’articulation de la cheville en paraformaldéhyde à 4% pendant deux jours à température ambiante. Ensuite, décalcifier l’articulation en 10%EDTA pendant un mois à température ambiante et changer le milieu hebdomadaire.
Après un mois, placez le tissu dans un moule marqué avec un certain volume de paraffine liquide à environ 60 degrés Celsius pour intégrer le tissu. Refroidir brièvement. Réglez l’épaisseur sur le microtome à quatre micromètres et coupez les tranches.
Faites ensuite flotter les sections dans un bain d’eau de 43 degrés Celsius pendant une courte période pour agrandir les sections. Montez les sections sur des toboggans et mettez les glissières dans le four à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Pour une utilisation future, conservez les glissières à moins 20 degrés Celsius.
Ensuite, placez les glissières dans une grille et effectuez des lavages au xylène et à l’éthanol selon le manuscrit pour les réhydrater à température ambiante. Enfin, laver l’eau courante du robinet pendant trois minutes. Puis tacher dans la solution verte rapide de 0,1% pendant cinq minutes.
Rincer à 1% d’acide acétique pendant 10 secondes et tacher en solution de coloration Safranin O à 0,1% pendant 20 minutes. Après cela, plongez les diapositives dans les solutions de lavage au xylène et à l’éthanol selon le manuscrit. Montez les sections tissulaires sur le stade de l’objet et observez les tissus au microscope.
Pour visualiser les neutrophiles, effectuer des taches immunohistochimiques en faisant cuire d’abord les sections de paraffine pendant deux heures à 78 degrés Celsius. Placez les glissières dans une grille et effectuez les lavages de xylène, d’éthanol, d’eau et de PBS selon le manuscrit pour les réhydrater à température ambiante. Ajoutez ensuite une goutte de tampon de perméabilisation pour couvrir le tissu.
Incuber les sections dans un plateau contrôlé par l’humidité à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, rincer les diapositives dans PBS pendant trois minutes trois fois. Évitez de rincer le tissu directement.
Ensuite, effectuez la récupération d’épitope d’antigène induite par la chaleur. Disposer les glissières dans une grille. Immerger les glissières dans la chaudière sous pression remplie de tampon de récupération.
Mettez la chaudière sous pression dans le four à micro-ondes et réglez le four à micro-ondes à 600 watts et chauffez les glissières pendant 10 minutes. Après ébullition, garder les glissières dans la chaudière pour les refroidir jusqu’à 90 degrés Celsius. Sortez les toboggans et rincez-les dans PBS pendant trois minutes trois fois.
Pour étancher l’activité endogène de la peroxyde, plongez les glissières dans du peroxyde d’hydrogène fraîchement préparé à 3 % à température ambiante pendant 15 minutes. Rincer les diapositives dans PBS pendant trois minutes trois fois. Décrire un grand cercle autour de l’échantillon à l’intérieur d’un stylo hydrophobe.
Évitez de toucher l’échantillon. Ajouter sur l’échantillon de 50 à 100 microlitres d’albumine sérique bovine à 3 % pour bloquer et placer les échantillons dans une chambre à humidité contrôlée à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Retirez ensuite la solution de blocage.
Ajouter rapidement 50 microlitres d’anticorps primaires dilués PBS à chaque section. Incuber les glissières dans un plateau contrôlé par l’humidité à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, sortez le plateau et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 minutes.
Rincez ensuite les glissières dans PBS pendant trois minutes trois fois. Ajouter 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués PBS aux tissus. Incuber glisse dans un plateau contrôlé par l’humidité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Rincez ensuite les glissières dans PBS pendant trois minutes trois fois. Développez-vous dans la solution DAB diluée pendant cinq minutes. Évitez le développement d’une couleur foncée causée par la réaction excessive du DAB.
Rincer les diapositives à l’eau distillée. Contrestain les diapositives en hématoxyline pendant 10 secondes et rincer les diapositives à l’eau du robinet pendant cinq minutes. Rincer à l’acide la solution de différenciation super rapide de l’alcool pendant trois secondes, puis rincer à l’eau du robinet pendant 10 minutes.
Plongez les diapositives dans l’éthanol et le xylène se lave à température ambiante selon le manuscrit. Fixez le coverslip avec la solution de montage. Observez le tissu au microscope.
Dans cette étude, des expériences de poche d’air ont été exécutées pour étudier le recrutement de neutrophile stimulé par LPS in vivo. Les sous-ensembles de leucocytes dans les exsudats de poche d’air étaient beaucoup plus élevés que dans le contrôle. Comparé au groupe témoin, le groupe arthritique adjuvant-induit a montré l’oedème significatif dans la patte.
Le diamètre de l’articulation de la cheville a augmenté et le score d’arthrite a augmenté de façon constante. Les dommages de cartilage sont le syndrome représentatif de la polyarthrite rhumatoïde. Le défi de CFA a induit une grande quantité d’infiltration de leucocyte, érosion significative de cartilage, et hyperplasie synovial.
Les MPO dans n’importe quels niveaux d’expression sont des marqueurs représentatifs de l’infiltration de neutrophile qui ont été sensiblement augmentés dans la section commune. Assurez-vous que l’air est injecté dans la peau, mais pas dans le muscle. Nous pouvons également étudier la formation des pièges extracellulaires de neutrophile par coloration immunohistochimique des sections communes de tissu de cheville avec l’anti-p84 ou ces méthodes peuvent être employées pour étudier d’autres maladies inflammatoires telles que la maladie intestinale inflammatoire.
