Les réseaux de microtubules cellulaires contiennent des sous-populations de microtubules avec des propriétés dynamiques distinctes requises pour la fonction. Ce protocole traite de la façon dont l’activité collective des régulateurs confère des propriétés distinctes à des sous-populations de microtubules proximales. Ce test de restitution ascendant nous permet de visualiser simultanément l’organisation et la dynamique des populations de microtubules proximaux tels que les microtubules et les faisceaux uniques, et de déchiffrer les mécanismes sous-jacents à leur auto-organisation.
La reconstitution multi-composants nécessite d’optimiser les paramètres expérimentaux tels que le pH, la force ionique et la concentration en protéines tout en préservant l’activité de chacun. L’analyse systématique des composants individuels avant les tests multi-protéines est extrêmement utile. Pour commencer, pipettez un mélange de 4,5 microlitres de BRB ADDTT dans un microlitre de solution de microtubules sur une lame de microscope.
Couvrez avec un couvercle de 18 x 18 millimètres et scellez les bords avec du vernis à ongles transparent ou du scellant VALAP. Placez l’objectif TIRF sous le couvercle. Visualisez les microtubules nouvellement polymérisés à une longueur d’onde appropriée pour la tubuline marquée par fluorescence dans le mélange brillant afin de déterminer quelle dilution des microtubules utiliser dans les expériences à venir.
Déterminer empiriquement l’intensité du laser pour l’expérience de manière à ce que toutes les protéines fluorescentes soient éclairées, mais ne subissent pas de photoblanchiment significatif au cours du temps de l’expérience. Réglez la température du microscope à 28 degrés Celsius pour afficher les microtubules dynamiques. Utilisez du papier d’objectif pour nettoyer un objectif 100X avec 70% d’éthanol.
Utilisez la meilleure combinaison de cubes filtrants et de filtres d’émission en fonction des canaux fluorescents à imager. Configurez la séquence d’imagerie. Pour une expérience avec des microtubules biotinylés marqués au fluorophore de 647 nanomètres, des microtubules non biotinylés marqués au fluorophore de 560 nanomètres dans de la tubuline soluble et une protéine d’intérêt marquée GFP, imagez les canaux de 488 nanomètres, 560 nanomètres et 647 nanomètres toutes les 10 secondes pendant 20 minutes.
Pour capturer une image de référence des faisceaux avant l’ajout de tubuline soluble et de protéine associée aux microtubules, établissez une séquence avec une image chacune dans des canaux de longueur d’onde de 560 nanomètres et 647 nanomètres. Vérifiez la position du faisceau laser sur le plafond au-dessus du microscope et apportez des modifications au faisceau à l’aide d’un logiciel. Assurez-vous que l’illuminateur laser est aligné.
Avant l’imagerie, ajoutez une goutte d’huile d’immersion au microscope à l’objectif. Préparez le mélange de tubuline soluble tout en le gardant sur la glace et faites tourner le mélange. Pour immobiliser les microtubules via la liaison biotine-NeutrAvidin-biotine, d’abord s’écouler dans environ 7,5 microlitres de solution de NeutrAvidin jusqu’à ce que la chambre soit remplie et incuber pendant cinq minutes.
Laver avec 10 microlitres de MB froid. Faire circuler 7,5 microlitres de la protéine bloquante KC et incuber pendant deux minutes. Laver à chaud 10 microlitres de MB pour préparer la chambre à l’introduction de microtubules.
Diluer le stock de microtubules biotinylés dans BRB ADDTT et ajouter un microlitre de cette dilution à neuf microlitres de MB chaud. Verser le mélange dans la chambre et incuber pendant 10 minutes. Laver les microtubules non immobilisés avec 10 microlitres de MB chaud.
Versez 7,5 microlitres de KC chaud dans la chambre et incubez pendant deux minutes. Pendant l’incubation, préparez une solution à deux nanomolaires de la réticulation ou de la protéine PRC1 dans KC et faites tourner la solution. Faites couler 10 microlitres de cette solution dans la chambre d’imagerie et incubez pendant cinq minutes.
Pour faire des faisceaux, faites couler 10 microlitres de microtubules non biotinylés dans la chambre et incubez pendant 10 minutes. Lavez la chambre deux fois avec 10 microlitres de MB à chaud. Pendant le temps d’incubation de 10 minutes, préparez 10 microlitres de mélange de dosage contenant des protéines d’intérêt, de la tubuline soluble, des nucléotides, des piégeurs d’oxygène et des antioxydants et faites-le tourner.
Gardez le mélange sur de la glace. Chargez la chambre d’imagerie préparée scotchée au support de diapositive sur l’objectif TIRF 100X. Utilisez les canaux de 560 nanomètres et 647 nanomètres pour trouver un champ de vision qui contient un nombre et une densité optimaux de microtubules et de faisceaux uniques.
Une fois qu’un champ de vision est identifié, prenez une image de référence. Appliquer soigneusement dans le mélange d’essai sans perturber la chambre d’imagerie. Scellez les extrémités ouvertes de la chambre avec le scellant VALAP.
Observez les microtubules et démarrez la séquence d’imagerie. Après avoir immobilisé les graines de microtubules et généré des faisceaux, des images de fluorescence ont été obtenues. Des microtubules simples ont été identifiés par signal fluorescent dans le canal de 647 nanomètres, tandis que les microtubules ont été identifiés comme des faisceaux préformés lorsqu’ils affichaient des signaux fluorescents dans les deux canaux.
La dynamique des microtubules simples et des faisceaux réticulés PRC1 a été étudiée en présence des protéines KIF4A et CLASP1, ce qui a révélé que les microtubules simples s’allongent au cours du test, tandis que la croissance des microtubules réticulés est bloquée. Veillez à maintenir les microtubules polymérisés à température ambiante ou au-dessus. Conservez la tubuline soluble sur la glace et protégez la chambre d’imagerie et les microtubules et protéines marqués par fluorescence de la lumière.
Ces essais ont fourni un aperçu mécaniste de la façon dont un module protéique trouvé au fuseau mitotique pourrait réguler différemment la dynamique de deux populations de microtubules différentes qui coexistent dans le fuseau.
