Le protocole est important pour démontrer une déficience motrice du poisson-zèbre et une récupération ultérieure, après l’injection intracérébroventriculaire de neurotoxine 6-hydroxydopamine au niveau du diencéphale ventral. Cette technique démontre des changements dans les effets fonctionnels, qui correspondent à l’ablation spécifique des neurones dopaminergiques dans le diencéphale ventral du poisson-zèbre adulte 6-OHDA, en utilisant une configuration très simple. Des études futures sur les mécanismes sous-jacents à la neurorégénération, ainsi que sur les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui modulent le processus, pourraient fournir des informations importantes sur les stratégies de traitement de remplacement cellulaire contre la maladie de Parkinson.
Maintenir le poisson dans un réservoir d’eau minéralisée distillée gazéifiée avec un gramme par litre de sel de mer commercial, sous une température de contrôle de 28, plus ou moins un degré Celsius. Hébergez un maximum de 25 poissons par aquarium de 45 litres et exposez-les à une photopériode lumineuse de 14 heures et à une photopériode sombre de 10 heures. Nourrissez le poisson au moins deux fois par jour avec des granulés de nourriture, complétés par des vers lyophilisés.
Préparer une solution mère de méthanesulfonate de tricaïne, en dissolvant deux grammes et demi de méthanesulfonate de tricaïne et cinq grammes de bicarbonate de sodium dans 250 millilitres d’eau distillée. Diluer deux millilitres de solution mère pour obtenir 200 millilitres de solution d’anesthésie de travail. Préparer fraîchement 99,96 millimolaires 6-hydroxydopamine, en dissolvant d’abord 0,2 milligramme d’acide ascorbique dans un millilitre de chlorure de sodium filtré stérile de 0,9% en poids par volume.
Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 micron. Ajoutez ensuite 25 milligrammes de 6-hydroxydopamine, sous forme de poudre, dans la solution. Placez le poisson anesthésié sur une éponge imbibée d’eau, placée sous un stéréomicroscope et mouillez le poisson régulièrement.
Identifiez la position d’injection, en fonction de l’intersection entre la suture métopique, la suture coronale et la suture sagittale, reliant le crâne pariétal et frontal du cerveau du poisson-zèbre. Ensuite, faites un petit trou d’un millimètre au carré, à l’aide d’une aiguille tranchante de calibre 27. Abaissez l’injecteur microcapillaire à un angle de 60 degrés, jusqu’à ce qu’il atteigne une profondeur de 1200 micromètres du toit crânien du crâne du poisson-zèbre.
Appuyez sur la limite Z pour fixer la position. Réglez la pression d’injection initiale à 4 000 hectopascal. Durée de l’injection à 2,3 secondes.
Pression de compensation à 10 hectopascal. Réduisez l’intensité de l’injection, à chaque injection ultérieure. Injecter 0,5 microlitre de 99,96 millimolaires de neurotoxine 6-hydroxydopamine ou de solution saline de 0,9 % en poids par volume, dans le groupe témoin simulé, et laisser le microcapillaire reposer pendant 20 secondes.
Continuez à mouiller le poisson avec de l’eau distillée tout au long du processus, pour éviter le séchage. Retirez lentement le microcapillaire et réanimez le poisson sous l’eau distillée courante. Placez le poisson dans un réservoir de récupération isolé et éliminez toute distraction pouvant perturber le processus de récupération.
Rincer le microcapillaire avant la prochaine injection, pour éliminer le blocage et s’assurer que l’intensité de l’injection est suffisante pour donner le volume souhaité de 0,5 microlitre de 6-hydroxydopamine. Effectuer une évaluation locomotrice du poisson-zèbre individuellement, via le test en cuve ouverte, au troisième jour et au jour 30, après la 6-hydroxydopamine. Placez le réservoir expérimental, dont les parois sont recouvertes de papier blanc, sur une plate-forme surélevée.
Illuminez le réservoir par le bas, à l’aide d’une source lumineuse. Remplissez le réservoir avec de l’eau distillée à 80 à 90% et maintenez la température à 28, plus ou moins un degré Celsius. Mesurez la température à l’aide d’un thermomètre et régulez-la à l’aide d’un chauffe-aquarium commercial.
Après un minimum de deux minutes d’acclimatation, enregistrez le comportement de nage des poissons à partir d’une vue planifiée sur le plan bidimensionnel de la zone expérimentale, à l’aide d’une caméra vidéo pendant cinq minutes. Pour éviter les incohérences, dans différents lots d’enregistrements, ne dépassez pas 10 minutes d’acclimatation. Analysez les vidéos à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo avec le protocole de réservoir ouvert, pour l’acquisition de la distance parcourue et de la vitesse moyenne de chaque sujet.
La présente expérience a évalué les changements dans le comportement de nage du poisson zèbre adulte, après une microinjection intracérébroventriculaire avec de la 6-hydroxydopamine. La principale région cérébrale d’intérêt était le diencéphale ventral, composé de la zone préoptique, du tubercule postérieur et de l’hypothalamus. Plus de 85% des neurones dopaminergiques immunoréactifs de la tyrosine hydroxylase dans le diencéphale ventral ont été ablations le troisième jour de la postlesion.
Le nombre de neurones dopaminergogènes immunoréactifs tyrosine hydroxylase augmente ensuite de plus de 50% au jour 14 de la postlesion, avant d’atteindre une régénération complète 30 jours après la postlesion. L’analyse du comportement de nage du poisson-zèbre, à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo, a indiqué que la vitesse moyenne et la distance parcourue par le groupe lésionné, le troisième jour de la post-lèse, étaient significativement réduites à moins de 45% par rapport au simulacre. Le groupe lésé a présenté une récupération de la fonction motrice, 30 jours après la llésion, sans différence significative de la vitesse moyenne ou de la distance parcourue, par rapport à l’imposture.
Il est important que l’évaluation locomotrice soit effectuée dans un délai fixe. Par exemple, de 8h00 à 12h00. Et la température de l’eau maintenue à 28 degrés Celsius, tout au long de l’expérience. D’autres tests comportementaux, comme le haut-fond et les comportements anxieux, peuvent être effectués, pour explorer des changements supplémentaires ou des effets fonctionnels de l’ablation des neurones dopaminergiques, après l’injection de 6-OHDA du cerveau du poisson zèbre adulte.
