Utilisation de la coloration rouge Alizarin pour détecter la perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre

Cette méthode peut aider à détecter la toxicité osseuse induite par les produits chimiques chez le poisson zèbre. La coloration rouge d’alizarine des tissus fixes génère un enregistrement permanent des changements squelettiques qui peuvent faciliter les comparaisons de plusieurs spécimens. Cette technique pourrait être utile pour étudier l’ostéoporose dans le modèle du poisson zèbre, car l’une des caractéristiques de l’ostéoporose est la diminution de la masse osseuse.

Retirer 10 larves de poisson zèbre au hasard de chaque groupe neuf jours après la fécondation et fixer le poisson dans un millilitre d’aldéhyde paraforme à 2% et 1X PBS pendant deux heures. Décanter la solution et laver la larve de poisson zèbre en utilisant 100 millimolaires de Tris HCL avec un pH de 7,5 ou 10 millimolaires de chlorure de magnésium. Pour la décoloration, décantez la solution et incuber la larve pendant cinq minutes dans une série de solutions comme décrit dans le manuscrit.

Après l’incubation finale, décanter la solution et enlever le pigment par blanchiment avec une solution composée de 3% de peroxyde d’hydrogène et de 0,5% d’hydroxyde de potassium. Observer une fois toutes les 10 minutes jusqu’à ce que le pigment soit complètement enlevé. Rincez la larve de poisson zèbre plusieurs fois avec 25% de glycérine, 0,1% d’hydroxyde de potassium pendant 10 minutes chacune jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles.

Colorer dans la larve en trempant dans un millilitre de 0,01% Alizarin. Décanter la solution et ajouter un millilitre de glycérine à 50% ou d’hydroxyde de potassium à 0,1% pour effacer le bruit de fond. Conservez le poisson dans de la glycérine fraîche à 50 % ou de l’hydroxyde de potassium à 0,1 % pour une observation ultérieure.

Transférez une larve à la fois sur la lame de verre en gardant la larve au milieu de la goutte liquide. Observez la larve au microscope stéréoscopique. Allumez l’appareil photo.

Ouvrez le logiciel et conservez les paramètres par défaut. Cliquez sur AE et choisissez un temps d’exposition approprié pour obtenir la meilleure image. Capturez toutes les images sous les mêmes paramètres.

Enregistrez les images au format point tiff pour une analyse ultérieure. Double-cliquez sur l’icône imageJ. Pour analyser les images enregistrées, cliquez sur fichier, puis ouvrez, puis cliquez sur image, puis tapez et sélectionnez huit bits.

Cliquez sur modifier et inversez. Cliquez sur analyser, puis calibrez. Sélectionnez OD non calibré dans l’interface contextuelle.

Vérifiez l’étalonnage global en bas à gauche de l’interface inférieure, puis cliquez sur OK. Cliquez sur analyser, définir l’échelle, puis supprimer l’échelle. Cochez la case globale ci-dessous, puis cliquez sur OK.

Cliquez sur analyser, puis définissez les mesures. Sélectionnez la zone d’élément dans l’interface contextuelle. Vérifiez la limite au seuil ci-dessous pour mesurer uniquement la plage sélectionnée, puis cliquez sur OK.

Cliquez sur l’image, ajustez, puis sur le seuil et faites glisser le curseur au milieu de l’interface contextuelle. Pour sélectionner le seuil approprié afin que toutes les cibles à tester dans une image soient sélectionnées. Et cliquez sur définir.

Cliquez sur analyser, puis mesurer, enregistrer les dates. La coloration rouge d’alizarine est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements dans la minéralisation osseuse chez les larves de poisson zèbre. Neuf jours après la fécondation, de nombreux os du squelette de la tête tels que parasphénoïdes, operculaires, cératobranchiaux et notochordes sont minéralisés et donc colorés en rouge.

En revanche, les structures non osseuses comme les otolithes apparaissent brun noir. L’analyse numérique effectuée pour quantifier la zone colorée totale a montré une diminution significative de la zone colorée pour les groupes de traitement à l’acétate de plomb de 10 et 20 milligrammes par litre. Les changements dans la minéralisation osseuse ont montré une dépendance à la dose.

Pour un meilleur effet de coloration et d’observation, il est important d’enlever le pigment d’origine des larves de poisson zèbre et d’enlever les bulles après le blanchiment.