En utilisant cet outil sophistiqué et non invasif, nous pouvons surveiller en temps réel la cinétique de croissance tumorale et la colonisation métastatique chez la souris, ce qui a un grand potentiel dans la thérapie du cancer du sein et la gestion de la maladie. La combinaison de la luciférase et de la détection par fluorescence est une stratégie utile pour faire progresser les études précliniques sur la progression du cancer du sein et la gestion de la maladie. Cela peut être appliqué pour les études de médicaments anticancéreux.
Ce protocole ne se limite pas au cancer du sein et pourrait être appliqué à d’autres carcinomes, tels que le poumon et le pancréas. Commencez par cultiver les cellules MCF-7, MDA-MB-468 et MDA-MB-231 GFP et luciférase positive séparément dans une plaque de 16 centimètres à 80% de confluence. Après avoir récolté les cellules par trypsinisation, ensemencez un nombre croissant de cellules dans chaque puits dans une plaque noire de 96 puits.
Ensuite, remplissez tous les puits avec 100 microlitres de DMEM et incubez pendant 16 à 24 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Préparer la solution de luciférine dans le PBS à une concentration de 1,5 milligramme par millilitre et conserver la solution à moins 20 degrés Celsius. Après l’incubation, lavez doucement les cellules une fois avec du PBS avant d’ajouter 100 microlitres de solution de luciférine dans chaque puits.
Attendez deux minutes, puis mesurez l’activité de la luciférase dans toutes les cellules cancéreuses du sein à l’aide de la bioluminescence. Avant d’injecter la souris, transférez cinq millions de cellules MCF-7 et MDA-MB-468 dans 200 microlitres de PBS et deux millions de cellules MDA-MB-231 GFP et luciférase positives dans 100 microlitres PBS. Préparez la souris anesthésiée pour l’injection en plaçant un cône sur la tête en position couchée.
Ensuite, essuyez la région abdominale de la souris au-dessus de la glande mammaire avec de l’éthanol à l’aide d’un coton-tige et soulevez la quatrième glande mammaire avec une pince avant d’insérer une aiguille de calibre 27 sous le coussinet adipeux pour injecter lentement 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée. Après l’injection, sortez la souris du capot et transférez-la dans une nouvelle cage sous observation jusqu’à ce qu’elle revienne à la conscience. Avant la détection de la bioluminescence, retenez la souris consciente en tenant son cou avec la main gauche et en inclinant la main vers la gauche, ce qui entraîne le visage de la souris vers le haut avec le bas du corps en position couchée.
Injecter 100 microlitres de 30 milligrammes par millilitre de luciférine par voie intrapéritonéale dans le quadrant abdominal inférieur gauche de la souris à l’aide d’une seringue d’un millilitre. Gardez la souris pendant sept minutes sans anesthésie, suivies de trois minutes dans la chambre d’anesthésie avant de mesurer la cinétique tumorale. Pendant que la souris est en incubation, ouvrez le logiciel et initialisez le système d’imagerie en cliquant sur le bouton Initialiser.
Maintenez la configuration en exposition automatique avec un temps d’exposition dans l’auto à 60 secondes, un milieu de binning à une ouverture de f/stop un, un filtre d’excitation bloqué et un filtre d’émission ouvert. Une fois l’initialisation terminée, sélectionnez Assistant Imagerie et bioluminescence, puis cliquez sur Suivant, Ouvrir le filtre pour sélectionner la souris dans l’objet de l’image. Dans la vue de champ, sélectionnez l’étape C à 10 centimètres et la hauteur du sujet à 1,50 centimètre.
Ensuite, cliquez sur Image Setup Stage pour C.Assurez-vous que la souris est placée sur la scène en position couchée appropriée avant de fermer la porte et de cliquer sur le bouton Acquérir. Attendez qu’une image apparaisse à l’écran. Répétez la procédure pour l’autre souris.
Pour détecter les métastases pulmonaires, couvrez le signal fort de la tumeur primaire à l’aide d’un papier carton épais et exposez uniquement le côté ventral des poumons vers la caméra. Capturez l’image en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits précédemment. Les lignées cellulaires du cancer du sein ont été infectées par un vecteur lentivirus exprimant la GFP fluorescente et soumises au tri FAC.
Les cellules GFP positives ont été triées deux jours après l’infection, plaquées et visualisées au microscope à fluorescence. L’activité in vitro de la luciférase a été confirmée par une augmentation des niveaux d’activité de la luciférase en fonction du nombre de cellules. De plus, une corrélation linéaire a été trouvée entre l’activité de la luciférase et le nombre de cellules.
Après avoir injecté les lignées cellulaires du cancer du sein, les souris ont été soumises à une lecture de bioluminescence toutes les deux semaines pour déterminer la cinétique de croissance tumorale. La cinétique de croissance tumorale était plus rapide dans les lignées cellulaires MDA-MB-231 que dans les lignées cellulaires moins agressives, MCF-7 et MDA-MB-468. L’activité de luminescence a été quantifiée pour trois lignées cellulaires.
Six semaines après l’injection, les tumeurs récoltées ont été trouvées pour maintenir l’expression de GFP. En outre, des lectures de bioluminescence positives ont été obtenues à partir du poumon de la souris entière en temps réel. Le poumon a été prélevé pour vérifier les colonies métastatiques positives, et les colonies métastatiques ont été observées pour la GFP et la bioluminescence.
Il est plus important d’être prudent lors de la procédure d’injection. Une injection incorrecte peut entraîner une déviation du taux de croissance tumorale ou l’absence de tumeur. Nous pouvons examiner les métastases pulmonaires in vivo et ex vivo en détectant l’expression de GFP.
En outre, nous pouvons également étudier l’histopathologie des poumons par coloration à base d’immunohistochimie. Cette technique peut être utile pour explorer les nouvelles questions, telles que l’effet des études d’efficacité des médicaments.
