Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique

La taille des nanoparticules lipidiques affecte la biodistribution, l’effet anti-tumoral et les performances de silençage génique. Par conséquent, la méthode de contrôle de la taille LNP est une technique efficace pour produire des nanomédicaments, y compris des systèmes d’administration d’ARN. Ce dispositif microfluidique original, nommé dispositif iLiNP, était capable de contrôler la taille du LNP allant de 20 à 100 nanomètres à des intervalles de 10 nanomètres.

Le dispositif iLiNP peut produire non seulement des LNP chargés en siRNA, mais aussi tous des LNPS chargés en ARNm et des LNP chargés en ribonucléoprotéines. Pour commencer, prenez les solutions d’éthanol lipidique et produisez les LNP chargés en siRNA en mélangeant des solutions de DOTAP, DSPC, cholestérol et DMG-PEG2k à un rapport molaire de 50 à 10 à 38,5 à 1,5. Ajuster la concentration totale de lipides à huit millimolaires.

Prenez ensuite les solutions aqueuses de solution saline de 154 millimolaires et de tampon d’acétate de 25 millimolaires à pH 4 et filtrez-les à travers des filtres à membrane de 0,2 micromètre ou des filtres à seringue. Préparer la solution tampon de siRNA en dissolvant 70 microgrammes de siGL4 en un millilitre de tampon d’acétate de 25 millimolaires. Remplissez les seringues en verre d’un millilitre avec des solutions lipidiques et aqueuses, respectivement.

Connectez les seringues en verre au pic capillaire à l’aide de connecteurs de seringue, puis réglez le débit des solutions lipidiques et aqueuses et introduisez les solutions lipidiques et aqueuses séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues. Collectez les suspensions LNP dans un microtube à partir de la sortie de l’appareil iLiNP. Dialyze la suspension LNP à l’aide d’une membrane de dialyse de 12 à 14 kiloDatons de poids moléculaire à quatre degrés celsius est Celsius pendant la nuit contre une solution saline ou DPBS pour les LNP POPC et les LNP chargés de siRNA, respectivement.

Collectez les suspensions LNP dialysées dans des microtubes, puis pipet 20 à 30 microlitres de la suspension LNP vers une cellule de micro-quartz. Enfin, mesurez la taille LNP, la distribution de taille LNP et l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière. La distribution de la taille du LNP POPC produite dans différentes conditions d’écoulement, telles que le débit total et les rapports de débit, est présentée ici.

Des tailles LNP précises allant de 20 à 100 nanomètres peuvent être contrôlées à l’aide de cet appareil iLiNP. Les LNP de petite taille sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP qui sont formées au FRR 5 sont plus petites que celles du FRR 3, quel que soit le débit total.

La distribution granulométrique des LNP chargés en siRNA est indiquée ici. Les siRNA sont encapsulés dans les LNP par interaction électrostatique entre le LIPique cationique DOTAP et les siRNA chargés négativement. Le dispositif iLiNP a produit des LNP cationiques chargés de siRNA de 90 nanomètres avec une distribution étroite.

L’efficacité d’encapsulation du siRNA était de 95% en raison de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et les siRNA chargés négativement. La cytotoxicité et l’activité de silençage génique des LNP chargés de siRNA de 19 nanomètres ont été évaluées. Les LNP chargés de siRNA ont montré une cytotoxicité à une dose de 10 à 100 nanomolaires siRNA.

Le niveau d’expression de la luciférase a été diminué en fonction de la concentration de siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont supprimé l’expression de 80% de luciférase à une dose de 100 nanomolaires siRNA. Les optimisations des conditions d’écoulement sont les étapes les plus importantes du protocole pour obtenir les LNP de taille souhaitée.

La méthode de production LNP à base microfluidique, y compris le dispositif iLiNP, ne nécessite aucune procédure compliquée et devrait être utilisée comme méthode de production LNP standard.