L’objectif de cette procédure est d’évaluer l’organisation et la dynamique des microtubules in vivo. Les neurones sont des cellules polarisées avec des compartiments axonaux, dendritiques et synaptiques distincts, maintenus par leur cytosquelette sous-jacent. Les microtubules forment la majorité du cytosquelette neuronal, et la dynamique et l’orientation déterminent les événements clés au cours du développement et de la maturation neuronaux.
Les microtubules sont composés d’hétérodimères de tubuline alpha et bêta et sont intrinsèquement polarisés avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités négatives stables. Lors de la polymérisation aux extrémités plus, un complexe multimoléculaire de protéines de liaison aux extrémités, s’associe transitoirement aux protofilaments et favorise l’assemblage de dimères de tubuline. Cette technique nous aidera à visualiser les microtubules neuronaux in vivo.
En utilisant cette technique, on peut déterminer l’orientation et d’autres paramètres des microtubules dynamiques au cours du développement et de la régénération du neurone C.elegans. Nous utilisons généralement ce rapporteur pour visualiser la dynamique des microtubules dans les neurones sensoriels. Cependant, on peut exprimer ce rapporteur dans d’autres types de cellules telles que les muscles et la peau pour visualiser des microtubules dynamiques dans ces cellules.
Les protéines de liaison finale étiquetées par fluorescence, comme l’EBP à la GFP, apparaissent ici sous forme de comètes. La dynamique de ces comètes a été corrélée avec la croissance concomitante des microtubules, et un indicateur clé pour évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules. Afin d’observer ces comètes dans un type cellulaire spécifique, les transgènes avec l’ADN de l’EBP-2 et du GFP sont exprimés sous un promoteur spécifique.
Pour l’expression dans les neurones PLM, ce transgène est exprimé sous le make for promoter. Ces vers transgéniques peuvent être vus au stéréomicroscope, avec une fluorescence mise en place avant le tri ou le montage. Pour le montage des vers pour l’imagerie des comètes EBP, nous fabriquons un tampon 10% Argos in M9.
et placez une goutte sur une lame de verre. Une autre diapositive est utilisée pour presser la goutte dans un film qui se solidifie en un tampon. Nous utilisons des billes de polystyrène de 0,1 micron comme support de montage, quelques vers sont cueillis et re-suspendus dans la solution de perles.
Un bordereau de couverture est braconné pour immobiliser les vers et pris pour imagerie. Ceux montés peuvent être imagés sur n’importe quel microscope à fluorescence avec une caméra pour une imagerie haute résolution. La configuration est équipée d’une unité de disque rotatif pour une acquisition plus rapide et une réduction du blanchiment photo et de la phototoxicité.
La diapositive est maintenue sur la scène et le champ de vers est focalisé et centré à l’aide de l’éclairage en champ lumineux. Un objectif à faible grossissement comme 5X ou 10X peut être utilisé à cette fin. Les vers peuvent être recentrés à un objectif de grossissement élevé comme 63X en utilisant le même éclairage.
Cet objectif fournit une résolution spatiale optimale pour l’imagerie des comètes. Un centrage fixe du neurone PLM est effectué sous l’éclairage de fluorescence pour éviter une exposition indue à la lumière et un photo-blanchiment du prum. Pour l’acquisition d’images, nous utilisons un logiciel d’envoi hors des sites.
En utilisant la configuration d’imagerie en direct dans le canal de champ lumineux, nous concentrons la région de la queue du ver et la centrons dans le champ de vision. Ceci est suivi par la focalisation du neurone PNM en utilisant une configuration d’imagerie lumineuse avec une lumière d’excitation de 488 nanomètres. Pour une acquisition time-lapse, un cadre expérimental est créé où le temps d’exposition, la durée du time-lapse et l’intervalle entre les images définissent les compétences temporelles de l’imagerie.
Pour les mesures quantitatives, certains films de comètes EBP doivent être analysés sur Image J, qui est un logiciel open source. Le time-lapse acquis s’ouvre sous la forme d’un brin multi-images, qui peut être prévisualisé sous forme de film. Dans ce time-lapse particulier, des comètes peuvent être vues dans le corps cellulaire, processus antérieur et postérieur du neurone PLM.
Les comètes qui s’éloignent du corps cellulaire sont classées comme plus-end-out, et celles se déplaçant vers le corps cellulaire sont classées comme minus-end-out. Pour commencer l’analyse, une ligne segmentée est tracée sur la région d’intérêt, qui dans ce cas est le processus intérieur du neurone PLM. Ce segment de ligne est converti en kymographe à l’aide de la fonction de reslice des images.
Un kymographe est une image de distance temporelle avec des plis diagonals représentant les comètes en mouvement. Des segments de ligne droite peuvent être dessinés sur ces traces et les paramètres de mesure peuvent être définis à l’aide du menu d’analyse. Ces paramètres peuvent être convertis en quantités et unités mesurables standard dans le programme d’analyse de données comme Excel.
La largeur de la trace correspond à la longueur de croissance. La hauteur représente la durée de croissance, et l’angle du pli donne la direction des comètes. Ces comètes peuvent en outre être classées en plus-end-out et minus-end-out, pour trouver l’orientation relative des microtubules.
L’expression transgénique de l’EBTA GFP peut être adaptée pour observer la dynamique des microtubules dans divers contextes cellulaires, tels que la nouvelle régénération. Pour observer la dynamique des microtubules dans la région évaluant les axones, l’axone est blessé à l’aide d’un laser femtoseconde, qui peut couper l’axone avec précision sans causer de dommages collatéraux massifs. Après la blessure, les vers peuvent être récupérés sur des plaques de moteur ensemencées pour des observations ultérieures.
Les neurones PLM présentent une régénération exonérée robuste, qui peut être observée dès six heures après la blessure. Pour éviter la phototoxicité à la régénération de nouveaux droits, l’imagerie en direct est réalisée dans un microscope à disque rotatif. Les acquisitions en accéléré des axones en régénération peuvent ensuite être converties en kymographes pour l’analyse des comètes.
La durée et la direction de la distance des comètes peuvent alors être interprétées en termes d’orientation et de dynamique des microtubules. Mon orientation critique et ma dynamique sont des déterminants clés des processus cellulaires civils tels que la division cellulaire, la migration et la maintenance de l’architecture cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux outils disponibles pour la mesure de la dynamique des microtubules, la mesure in vivo peut être difficile.
L’autoflorescence, la phototoxicité, l’artefact de sur-expression et les intensités variables rapportées sont quelques-unes des difficultés rencontrées lors de l’observation en direct des protéines de liaison finale, pour évaluer la dynamique des microtubules. En utilisant un transgénique intégré avec une faible concentration d’ADN déporté et une imagerie à faible éclairage, cette étude a abordé des méthodes pour atténuer certains de ces défis. Les modules d’imagerie et d’analyse décrits ici peuvent être étendus à d’autres rapporteurs à base de microtubules et au transport de protéines.
Ceci n’est pas seulement applicable aux neurones C.elegance, mais peut être appliqué à d’autres types de cellules et systèmes modèles.
