Comprendre l’efficacité des médicaments dans les modèles animaux est coûteux et coûte beaucoup de main-d’œuvre. Notre protocole qui utilise un modèle ex vivo d’explant tissulaire est significativement plus faible à la fois en termes de coût et de personnel scientifique nécessaire pour mener l’étude. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation d’yeux porcins, qui ont une anatomie et une physiologie très similaires aux yeux humains, contrairement à d’autres modèles de petits animaux.
Lorsque nous testons des médicaments in vitro, ils peuvent montrer une efficacité qui pourrait être absente dans les modèles animaux ou humains. Les systèmes tissulaires ex vivo sont le meilleur moyen de comprendre si nos systèmes in vitro peuvent ou non être traduits en essais sur des animaux et des humains. Le système cornéen porcin, bien que moins exigeant en main-d’œuvre, nécessite des compétences formables pour isoler, maintenir, infecter et traiter avec les médicaments, en particulier le processus d’isolement de la cornée de l’œil porcin entier est difficile à exprimer avec des mots, mais nécessite une démonstration visuelle.
Après avoir reçu des yeux de porc d’un fournisseur approprié, entreposer les tissus sur de la glace jusqu’au traitement et mettre l’équipement de protection individuelle approprié. Désinfectez la zone de travail avec de l’éthanol à 70 % et fixez un couvercle de banc sur l’espace de travail. Lorsque la zone de travail est prête, placez les yeux sur un morceau de gaze de 50 millimètres et utilisez la gaze pour saisir la section postérieure d’une seule main.
À l’aide d’une aiguille de calibre 30, faites soigneusement une seule ponction au centre de la surface épithéliale de l’œil, en prenant soin de ne pas endommager le stroma, et utilisez une lame stérilisée tranchante pour faire une petite incision sur la sclérotique à une distance d’un millimètre de la cornée. En utilisant une action rotative rapide et douce de la main et en faisant attention à ce que l’humeur vitrée ne fuie pas, coupez le bord de la cornée et maintenez la cornée au bord de la cornée-sclérotique avec une pince à épiler plate, utilisez la lame pour couper les membranes d’attache restantes. Au fur et à mesure que chaque cornée est isolée, placez les tissus face vers le haut dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de milieu cornéen par puits et ajoutez cinq microlitres de cinq fois 10 à la cinquième unité formant une plaque de 17 solutions du virus GFP au site débridé sur chaque surface cornéenne.
Lorsque toutes les cornées ont été collectées, placez la plaque dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 72 heures et vaporisez tous les yeux supplémentaires non utilisés dans l’expérience avec 10% d’eau de Javel pour leur élimination en toute sécurité dans des sacs de risque biologique. Chaque jour avant l’ajout de médicaments, placez la plaque de cornées sous un stéréomicroscope et sélectionnez le filtre GFP et un temps d’exposition de 500 microsecondes. Capturez les images au grossissement le plus bas avant d’imager les cornées à une série de grossissements croissants jusqu’à ce que toute la propagation virale et la formation de dendrite puissent être visualisées clairement.
Lorsque toutes les cornées ont été imagées, retournez la plaque à l’incubateur de culture tissulaire. La veille de l’infection, lavez deux fois une culture de cellules vero confluentes avec 10 millilitres de PBS par lavage et traitez les cellules avec un millilitre de 0,05% de trypsine par puits pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, utilisez neuf millilitres de milieu entier pour vous assurer que les cellules se délogent complètement de la surface de la fiole et transfèrent la suspension cellulaire résultante dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Ajouter 300 microlitres de cellules à chaque puits d’une nouvelle plaque de six puits, suivi de l’ajout de deux millilitres de milieu à chaque puits, puis placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, pour prélever le virus dans chaque cornée à des fins de quantification, faites tremper des pointes de coton-tige stériles dans 500 microlitres de milieu sans sérum par écouvillon dans plusieurs tubes de microcentrifugation dans une armoire de biosécurité pendant au moins cinq minutes. À la fin de l’incubation, placez soigneusement les cultures de cornée porcine infectées dans l’armoire.
En utilisant les cotons-tiges humides, faites trois tours dans le sens des aiguilles d’une montre et trois tours dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à cinq millimètres du centre de chaque cornée porcine infectée sans appliquer de pression excessive. À la fin de la série de révolutions, faites pivoter chaque écouvillon dans son tube de microcentrifugation rempli de milieu sans sérum dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre cinq fois avant de couper les écouvillons afin que les embouts s’insèrent dans chaque tube avec le couvercle fermé. Lorsque toutes les cornées ont été écouvillonnées, vortex les tubes à grande vitesse pendant une minute.
Pour quantifier la quantité de virus recueillie dans chaque cornée, préparez une dilution log10 d’une fois du virus dans un milieu sans sérum dans des tubes de microcentrifugation jusqu’à ce qu’une dilution d’une fois 10 à huit négatifs soit atteinte. Après avoir aspiré le milieu de croissance de chaque puits de cellules, transférez un millilitre de chaque dilution virale à partir d’une fois 10 aux trois négatifs aux monocouches cellulaires plaquées et placez les cellules infectées dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures. À la fin de l’incubation, laver doucement chaque puits deux fois avec du PBS avant d’ajouter deux millilitres de milieu chargé de méthylcellulose à chaque puits pour une incubation de 72 heures ou jusqu’à ce que la formation de plaques puisse être observée.
Après observation de la plaque, ajoutez lentement un millilitre de méthanol au coin de chaque puits pour une incubation de 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, aspirez lentement le contenu de chaque puits sans perturber la monocouche cellulaire. Ensuite, étiquetez chaque puits avec un millilitre de solution de travail de violet cristallin, en veillant à ce que toutes les cellules soient recouvertes pour une incubation de 30 minutes à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation, jeter la solution et sécher les puits sur une feuille de papier absorbant, puis compter le nombre de plaques au puits de dilution le plus élevé pour quantifier trois fois la teneur totale en virus dans la solution de départ. Comme l’a observé cette analyse d’imagerie par fluorescence stéréoscopique, l’efficacité antivirale du BX795 est similaire à celle du TFT dans le contrôle de la propagation virale, tandis que les cornées traitées avec véhicule ne démontrent la propagation du virus de la zone d’infection centrale à la périphérie que six jours après l’inoculation virale initiale. De même, les écouvillons oculaires prélevés les deuxième et quatrième jours suivant l’infection présentent une inhibition complète du virus dans les échantillons témoins positifs et traités par BX795, tandis qu’une forte augmentation du titre infectieux du virus est observée dans les échantillons témoins négatifs.
L’isolement de la cornée porcine de l’œil porcin entier est l’étape la plus importante. Les étapes 2.3 à 2.6 sont les plus cruciales dans ce processus. Notre modèle peut être utilisé pour comprendre la propagation dendritique du virus dans les cornées porcines.
Cette méthode peut également être étendue aux infections bactériennes et fongiques. Cette méthode a permis de visualiser la propagation dendritique du virus dans les cornées en dehors d’un modèle humain. Ce modèle est utile pour tester l’efficacité des médicaments avant de passer à des essais sur des animaux et des humains.
