Cette technique facilite la visualisation des rencontres d’adduits à l’ADN marqué par un antigène réplisome et peut être étendue aux interactions de toute protéine ayant une structure ou une lésion d’ADN susceptible d’être immunodétectée. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les fréquences d’interaction au sein de cellules individuelles, plutôt que dans une population, et permet de visualiser in situ les interactions dépendantes du cycle cellulaire sans endommager les cellules. La procédure sera présentée par Ishani Majumdar, post-doctorante du laboratoire Seidman.
La veille de l’expérience, semer 1,5 fois 10 à la cinquième cellule dans deux millilitres de milieu sur des boîtes de culture à fond de verre de 35 millimètres prétraitées avec une solution adhésive cellulaire. Le lendemain, remplacez le surnageant dans chaque boîte par un milieu supplémenté en TMP micromolaire à 37 degrés Celsius Five micromolaire aux cultures cellulaires confluentes de 50 à 70% et remettez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes pour permettre au Dig TMP de s’équilibrer. Pendant l’incubation des cellules, préchauffez une boîte UV à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’équilibre, transférer les plaques dans la boîte préchauffée pour exposer les cellules à une dose de lumière UVA de cinq minutes de trois joules par centimètre carré et remplacer les surnageants par deux millilitres de milieu de culture frais préchauffé avant de retourner les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure. À la fin de l’incubation, laver doucement les cultures avec du PBS et fixer les cellules avec un millilitre de formaldéhyde à 0,1% dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules une fois avec du PBS avant de traiter les cellules deux fois avec 80 microlitres de tampon d’extraction du cytosquelette complété par la RNase pendant cinq minutes à température ambiante par traitement pour éliminer le cytoplasme.
Après la deuxième incubation, laver les cellules avec deux millilitres de PBS trois fois avant de fixer les cellules avec un millilitre de formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après la deuxième fixation, laver les cellules trois fois avec du PBS comme démontré, suivi d’un traitement avec un millilitre de méthanol froid à 100% pendant 20 minutes à moins 20 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois dans deux millilitres de PBS, suivies d’une incubation de 10 minutes dans 80 microlitres de cinq millimolaires Triton X-100 à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, traiter les cellules avec 100 microlitres de cinq millimolaires d’EDTA dans du PBS, complété par un microlitre de 100 milligrammes par millilitre de RNase A pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans du PBS avant de les stocker dans 5% d’albumine sérique bovine et 10% de sérum d’âne dans du PBS dans une chambre humide pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Pour effectuer un test de ligature de proximité, ajoutez 40 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt au centre de chaque plaque et incuber les plaques dans la chambre humide pendant une heure à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois avec deux millilitres de PBST avant d’ajouter 40 microlitres de solution de sonde PLA fraîchement préparée à chaque boîte pour une incubation d’une heure dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec trois lavages de 10 minutes dans deux millilitres de tampon A sur une plate-forme basculante à température ambiante. Après le dernier lavage, ajouter 40 microlitres de mélange de ligature fraîchement préparé à chaque assiette pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, suivie de trois lavages de deux minutes dans le tampon A sur la plate-forme basculante.
Après le dernier lavage, ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification fraîchement préparée à chaque plaque pour une incubation de 100 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. À la fin de l’incubation, laver les cellules six fois avec un tampon B frais pendant 10 minutes par lavage sur la plate-forme basculante. Après le dernier lavage tampon B, laver les cellules une fois avec 0,01x tampon B pendant une minute à température ambiante avant de marquer avec les anticorps secondaires appropriés dans la chambre humide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec trois lavages de 10 minutes sur une plate-forme basculante en PBST à température ambiante avant de les monter dans un support de montage complété par du DAPI. Dans les quatre jours suivant le montage, imager au moins 100 observations par échantillon ou cellules conditionnelles sur un microscope à épifluorescence ou confocale, en utilisant les mêmes paramètres d’exposition pour les échantillons expérimentaux et témoins. L’étiquette Dig peut être visualisée par immunofluorescence pour révéler la présence de liaisons croisées interbrins dans tout le noyau.
Pour visualiser l’interaction des réplisomes avec les liaisons croisées interbrins, le PLA peut être appliqué pour visualiser la fréquence d’association de MCM5 et de la balise Dig, une heure après l’introduction de la liaison croisée interbrin. Comme la contrainte de réplication active la kinase ATR, le PLA entre pMCM deux sérine 108 et le tag Dig est également positif. Les résultats PLA des noyaux individuels peuvent être présentés dans une reconstruction tridimensionnelle permettant la visualisation des rencontres de réticulation interbrin répliquables dans tout le noyau.
L’analyse de la fourche de réplication indique que les rencontres de réticulation interbrin démontrent un phénomène de redémarrage de réplication inattendu, car les protéines du complexe GINS ne présentent pas de signal PLA avec les liaisons croisées interbrin. En revanche, le dosage avec CD 45 est positif, ce qui indique que l’autre protéine de verrouillage est conservée. Lorsque les cellules sont incubées avec un inhibiteur de l’ATR, le redémarrage est complètement supprimé et les GINS Dig PLA fortement positifs.
Le traitement CSK+R est essentiel pour réduire le signal de fond. Assurez-vous d’enduire les plaques d’un adhésif cellulaire et de préfixer avec 0,1% FA ou les cellules se décolleront de la plaque.
