Ce protocole permet l’acquisition simultanée de plusieurs embryons en une seule séance d’imagerie. Bien que la préparation de l’échantillon soit adaptée pour l’acquisition en plusieurs points à l’aide d’un analyseur à contenu élevé, les échantillons préparés à l’aide de ce protocole peuvent être photographiés sur n’importe quel microscope inversé capable d’acquérir plusieurs points. Pour commencer, organisez deux rangées de 15 à 20 embryons sur une section propre de grande plaque à l’aide d’un outil de cueilleur d’ovules.
Aligner les embryons sur leur côté ventral dans la même orientation par rapport aux extrémités antérieures et postérieures. Adhérez un espaceur sur un coverslip et strie 10 microlitres de colle d’heptane vers le bas de l’encart de verre de coverslip exposé. Pendant que la colle sèche, utilisez une lame de rasoir pour couper un rectangle autour des deux rangées d’embryons.
Couper un deuxième rectangle à côté du premier et retirer le deuxième rectangle avec un côté droit bord d’une spatule en acier inoxydable. Faites glisser délicatement le bord droit de la spatule sous le premier rectangle et retirez-le. Ensuite, placez la découpe avec des embryons sur le côté externe d’un plat de 3,5 centimètres.
Au microscope stéréo, abaissez un couvercle préparé sur les embryons et appuyez doucement sur les deux rangées d’embryons sur la colle. Si vous n’effectuez pas de microinjection, remplissez l’espaceur en silicone à mi-chemin vers le haut avec de l’huile d’halocarbone 700 à l’huile d’halocarbone 27. Tapisser les bords inférieurs d’un adaptateur de plaque à quatre glissières d’un ruban adhésif à double face.
Cela empêchera la diapositive de se déplacer pendant l’imagerie. Assurez-vous de ne pas placer la bande sur le chemin de l’objectif. Montez le coverslip sur l’adaptateur de plaque à quatre diapositives.
Si vous microinjecter les embryons, placez le coverslip avec des embryons sur une diapositive pour empêcher le fond de la couverture de se salir pendant la dessiccation et la microinjection. Dessiccate les embryons pendant cinq à 10 minutes, puis couvrez-les immédiatement avec de l’huile d’halocarbone 700 à l’huile d’halocarbone 27, remplissant l’espaceur de silicone à mi-chemin vers le haut. Chargez deux ou trois aiguilles de microinjection avec environ deux microlitres d’injecteur à l’aide d’une pointe de chargement prolongée.
Monter une aiguille sur le microinjecteur et déprimer le piston à mi-hauteur de la pointe, augmentant la pression d’air à l’intérieur du capillaire en verre. Abaissez l’aiguille en verre sur une glissière en verre et coupez la pointe de l’aiguille avec un nouveau rasoir numéro neuf, en coupant à un angle de 45 degrés pour produire une pointe ouverte nette. L’injecteur doit descendre au fond de la pointe sans sortir de l’aiguille.
Ajouter délicatement 20 microlitres d’huile d’halocarbone sur la pointe de l’aiguille et la couper à nouveau ouverte à un angle de 45 degrés. L’injecteur doit commencer à circuler rapidement, alors n’oubliez pas d’ajuster la pression en rétractant le piston. Utilisez le micromanipulateur pour positionner l’aiguille au centre du champ de vision.
Soulevez ensuite l’aiguille et retirez la glissière de verre de dessous. Placez les embryons au stade du microscope stéréo, sous l’aiguille de microinjection et concentrez-vous sur eux à 50 fois le grossissement. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle entre dans le même plan de mise au point que les embryons.
Déplacer la diapositive d’une main et faire fonctionner le microinjecteur de l’autre, injecter une rangée d’embryons. Soulevez l’aiguille et faites pivoter la glissière à 180 degrés pour exposer la deuxième rangée d’embryons à l’aiguille de microinjection. Abaissez l’aiguille et injectez la deuxième rangée d’embryons.
Ce protocole a été employé pour examiner le rôle des microtubules dans la réorganisation endoplasmique de reticulum pendant la mitose dans l’embryon de Drosophila. Les effets de plusieurs traitements médicamenteux microinjectés sur la réorganisation des services d’assurance-santé ont été comparés quantitativement. La colchicine, qui empêche la nouvelle polymérisation des microtubules, a considérablement réduit la localisation des ER aux poteaux de fuseaux pendant la mitose.
Des données de formation image de time lapse ont été acquises pour 32 embryons. Des mesures d’intensité moyenne et maximale ont été analysées à partir de 12 800 régions d’intérêt à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, n’oubliez pas de ne pas prendre trop de temps sur une seule étape, sinon vous risquez de manquer votre stade de développement que vous voulez l’image.
Pratiquez ce protocole étape par étape avant de tenter des expériences. Notre méthode de préparation de l’échantillon facilite l’acquisition simultanée d’embryons multiples au cours d’une expérience, générant ainsi suffisamment de répliques expérimentales pour l’analyse quantitative. Ce protocole peut aider à la transition de l’embryologie développementale des expériences d’imagerie qualitative à quantitative.
La capacité d’image de plusieurs embryons en une seule séance d’imagerie élimine également le bruit expérimental entre les répliques.
