Ce protocole est utile pour la conservation à long terme des ovocytes félins grâce à une technique de cryopréservation connue sous le nom de vitrification, qui est cruciale pour la fertilité et la préservation de la biodiversité chez les espèces animales. Les principaux avantages de la vitrification sont sa vitesse puisqu’elle peut être achevée en moins de 17 minutes et sa faisabilité sur le terrain si de l’azote liquide est disponible. Le chat domestique est un modèle viable pour les félins sauvages en voie de disparition.
Le développement et l’optimisation de protocoles de cryopréservation permettraient d’établir des biobanques de gamete pour les programmes de conservation féline. Commencez par préparer une plaque de vitrification Repro avec trois puits coniques dans une rangée. Ajouter 20 microlitres de solution d’équilibrage au premier puits et 300 microlitres de solution de vitrification aux deuxième et troisième puits.
Pour équilibrer les complexes d’ovocytes cumulus, ou COCs, utilisez une pipette à petit alésage pour transférer un ou plusieurs complexes au fond du premier puits. Ajouter lentement 20 microlitres de solution d’équilibrage à la limite de la goutte et attendre trois minutes, puis ajouter 240 microlitres supplémentaires de solution d’équilibrage et attendre neuf minutes. En attendant, préparez une boîte avec de l’azote liquide et étiquetez un support de vitrification avec l’expérience ou le code d’identification du chat.
Placez la boîte et soutenez près du microscope stéréo. Après avoir équilibré les COC, effectuez la vitrification en moins de 90 secondes. Pour vitrifier les COC, remplissez la pipette à petit alésage de la solution de vitrification du deuxième puits.
Prenez les COC du bas du premier puits et déplacez-les à la surface du deuxième puits. Lavez la pipette avec la solution de vitrification, puis déplacez les COC dans une autre zone du puits et mélangez la solution environnante. Remplissez la pipette d’une solution provenant d’une autre zone du puits.
Déplacez les COC et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette. Répétez ce processus une fois de plus. Ensuite, lavez la pipette avec la solution de vitrification du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC au bas du troisième puits.
Encore une fois, mélanger la solution environnante. Après avoir rempli la pipette de solution à partir d’une autre zone du puits, déplacez les COC et mélangez la solution. Répétez ce processus.
Remplissez la pointe pipette avec la solution de vitrification d’une autre zone du puits et utilisez-la pour charger les COC sur la bande du support de vitrification près de la pointe, puis aspirez l’excès de milieu. Plongez immédiatement le support de vitrification dans de l’azote liquide et utilisez des pinces pour le fermer, en vous assurant qu’il reste immergé. Conservez les supports de vitrification chargés dans un gobelet et gardez-les dans un réservoir d’azote liquide de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent.
Placez l’étage chauffant près du microscope stéréo et allumez-le à 38 degrés Celsius. Réchauffer le couvercle d’une boîte de Pétri sur le dessus de la scène, puis transférer les supports de vitrification du réservoir de stockage à une boîte avec de l’azote liquide. Préparez une rangée d’une plaque Repro pour réchauffer chaque support de vitrification.
Ajouter 300 microlitres de solution de dilution au premier puits et 300 microlitres de solution de lavage aux deuxième et troisième puits. Sortez la solution de décongélation de l’incubateur et déposez 100 microlitres sur le couvercle de la boîte de Pétri. Utilisez les pinces pour ouvrir le support de vitrification à l’intérieur de l’azote liquide.
Placez le couvercle de la boîte de Petri sous le microscope stéréo, puis prenez rapidement le support de vitrification et plongez sa bande dans la goutte, en la déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’il est vide, mais laissez les COC dans la solution de décongélation pendant une minute. Remplissez une pipette d’une solution de dilution et utilisez-la pour déplacer les COC de la solution de décongélation vers le fond du premier puits avec une solution de dilution.
Laissez les COC là pendant trois minutes. Lavez la pipette avec la solution de lavage du deuxième puits, puis prenez les COC et déplacez-les au fond du deuxième puits. Attends cinq minutes.
Lavez la pipette avec une solution à partir du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC du deuxième puits à la surface du troisième puits. Attendez que les COC touchent le fond du troisième puits. Répétez ensuite le processus avec un autre puits.
Une fois terminée, laver la pipette avec le milieu de culture et déplacer les ovocytes dans un plat de culture. La grande majorité des gamètes survivent après la vitrification des ovocytes et le réchauffement selon ce protocole. Une image représentative d’un complexe viable vitrifié d’oocytes chauds de chat souillés avec le diacétate de fluorescéine et l’iodure de propidium est montrée ici.
Ce tableau montre le pourcentage de survie après vitrification, qui représente les données post-réchauffement des ovocytes destinés à la maturation in vitro. Sur 435 ovocytes, 395 ont survécu, avec une viabilité globale de 90,8 % après le réchauffement. Cependant, certains changements morphologiques peuvent être remarqués après le réchauffement.
Les anomalies morphologiques les plus fréquentes sont les changements dans la forme et la granulation d’ooplasme, la perte partielle ou parfois totale des cellules de cumulus, et les ruptures de pellucida de zona. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas de préparer les médias à l’avance afin qu’ils soient la bonne température avant utilisation et de suivre les températures du protocole et les calendriers pour éviter la toxicité cellulaire. Le protocole pourrait également être appliqué aux ovocytes d’autres espèces.
En cas de succès, cela pourrait également contribuer à la banque de plasmes germinales pour la préservation de la biodiversité chez les félins en voie de disparition.
