Ce travail a été en partie soutenu par Kansas INBRE, P20GM103418 à Li et Zinovyeva et R35GM124828 à Zinovyeva. Nous remercions Min Han d’avoir généreusement partagé l’anticorps anti-AIN-1. Certaines des souches utilisées dans le cadre de ces travaux ont été fournies par le Centre de génétique caenorhabdite (CGC), financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).

1. Collection d’échantillons de vers
<ol><li>Graines mélangées au stade ousynchronisées 13 vers sur les plaques solides NGM à la température requise et permettent aux vers de croître jusqu’au stade désiré. Pour la croissance et l’entretien de base de C. elegans, veuillez consulter Stiernagle et coll. et Porta-de-la-Riva et coll.14,13.</li>
	<li>Recueillir les vers dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL en lavant les plaques de ver avec tampon M9.</li>
	<li>Pelleter les vers en centrifugant à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 2 min et jeter le supernatant. REMARQUE : La taille des granulés de ver pour la préparation de l’extrait se situe entre 100 μL et 500 μL. Une pastille de 300 μL de vers emballés est recommandée pour les expériences d’immunoprécipitation en aval et donne généralement ~4,5 mg de protéines totales, tandis qu’une pastille de 500 μL rapportera ~7,5 mg de protéines totales.</li>
	<li>Effectuez des lavages supplémentaires de 3 à 5 lavages avec tampon M9 (voir tableau 1)ou jusqu’à ce que le supernatant ne soit plus nuageux.</li>
	<li>Effectuez un dernier lavage avec ddH2O.</li>
	<li>Déplacez la pastille de ver lâche dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et faites tourner vers le bas à 400 x g à RT pendant 2 min. Jeter le surnatant restant pour obtenir une pastille de ver emballée et procéder à la préparation de l’extrait. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les granulés de ver peuvent être congelés immédiatement dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C ou dans de l’azote liquide. Veuillez noter que les granulés de vers ne peuvent être décongelés qu’une seule fois et ne peuvent pas être recongelés.</li>
</ol>2. Extraire la préparation de la pastille de ver
REMARQUE : La préparation de l’extrait doit être effectuée sur glace ou à 4 °C.
<ol><li>S’il est congelé, décongeler les granulés de ver sur la glace. REMARQUE : Si la taille de granulés de ver emballée désirée de 300 μL n’a pas été obtenue au cours de la collecte de l’échantillon, plusieurs granulés plus petits peuvent être combinés jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de matériaux pour une extraction plus importante.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de tampon de lyse 2x glacé (60 mM HEPES, pH = 7,4, chlorure de potassium de 100 mM, 0,1 % Triton X, chlorure de magnésium de 4 mM, 10 % glycérol, 2 mM TNT avec inhibiteur de la RNase, inhibiteur de la protéase et inhibiteurs de la phosphatase; voir le tableau 1) et vortex ou pipette de haut en bas pour mélanger. Faites tourner le tube (s) vers le bas pour recueillir le mélange au fond du tube.</li>
	<li>Déplacez le mélange dans un tube sans RNase de 1,5 mL contenant des perles métalliques (voir tableau des matériaux)et mettez l’échantillon dans l’homogénéiseur du moulin à perles (voir table des matériaux)à 4 °C. Assurez-vous que les bouchons de tube sont serrés et que les échantillons sont équilibrés à l’intérieur de l’homogénéiseur.</li>
	<li>Homogénéiser l’échantillon à la vitesse la plus élevée (réglage 12) pendant 4 min.</li>
	<li>Retirer l’échantillon des perles et le placer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Alternativement, un aimant fourni avec l’homogénéiseur peut être utilisé pour enlever les perles de l’échantillon.</li>
	<li>Faire tourner l’extrait à 19 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour clarifier l’extrait de protéine.</li>
	<li>Transférer le surnatant dans un tube frais de 1,5 mL sur la glace, tout en évitant le report du précipité blanc et nuageux qui se forme sur le dessus de l’échantillon. Le surnatant est maintenant l’extrait clarifié. REMARQUE : Économisez 10 μL de l’extrait clarifié pour déterminer la concentration totale de protéines.</li>
	<li>Utilisez immédiatement l’extrait pour les expériences suivantes ou congèlez l’extrait dans de l’azote liquide et stockez-le à -80 °C. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les extraits peuvent être conservés à une température ultralow (-80 °C congélateur ou azote liquide pendant ~6 mois). Les extraits congelés peuvent être décongelés une fois et ne peuvent pas être recongelés.</li>
	<li>Déterminer la concentration totale en protéines de l’extrait à l’aide d’un kit d’analyse de concentration de protéines compatible avec les détergents (voir tableau desmatériaux) selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>3. Immunoprécipice
REMARQUE : Toutes les étapes d’immunoprécipice pour la préparation d’extrait doivent être exécutées sur la glace ou à 4 °C. Il est recommandé d’utiliser 2 mg de protéines totales pour chaque immunoprécipitation. Cependant, des immunoprécipices réussies avec 0.8-1 mg de protéine totale ont été exécutées. Utilisez toujours des extraits de protéines frais ou fraîchement décongelés. Le protocole suivant est décrit pour effectuer l’immunoprécipitation de 2 mg de protéine totale, ou une expérience unique d’immunoprécipitation. La quantité de perles et d’anticorps peut être augmentée ou diminuée en conséquence pour plusieurs échantillons ou si une quantité différente d’extrait de protéine est utilisée.
<ol><li>Placer ou décongeler l’extrait de protéines sur la glace. L’échantillon peut être dilué à 10 mg/mL ou 5 mg/mL avec tampon de lyse 1x glacé (voir le tableau 1).</li>
	<li>Resuspendez les perles magnétiques par inversion et transférez 150 μL de la suspension de perles de 50% dans un tube de 1,5 mL. Magnétiser les perles sur la glace contre un support magnétique pendant 1 min ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Jeter le surnatant.</li>
	<li>Retirer le tube du support magnétique et laver les perles dans un tampon de 1x lyse à l’aide de 2 volumes (c.-à-d. 300 μL) de boue de perles. Répétez le lavage 2x pour un total de trois lavages.</li>
	<li>Resuspendez les perles dans 150 μL de tampon de lyse glacée.</li>
	<li>Transférer 75 μL de boue de perle à 2 mg d’extrait de protéines et incuber à 4 °C pendant 1 h avec une agitation douce. Gardez le reste de la suspension de perle sur la glace pour une utilisation ultérieure. REMARQUE : Cette étape est effectuée pour réduire la liaison protéique non spécifique aux perles pendant l’étape d’immunoprécipice.</li>
	<li>Placez le tube avec l’échantillon sur le support magnétique sur la glace pendant 1 min ou jusqu’à ce que les perles soient entièrement magnétisées et que l’échantillon soit clair. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL; ne pas déranger les perles. C’est le lysate protéique prédéclegé. Économisez 10 % de l’échantillon pour l’analyse des taches occidentales.</li>
	<li>Ajouter 20 μg d’anticorps purifiés d’affinité au lysate précléarisé et incuber à 4 °C pendant 1 h avec une agitation douce. REMARQUE : La quantité d’anticorps utilisée pour l’immunoprécipitation est spécifique à l’anticorps et aux protéines et doit être déterminée empiriquement pour assurer une immunoprécipitation efficace de la protéine cible.</li>
	<li>Ajouter le reste de 75 μL de la suspension des perles prélavées (étape 3.5) au mélange anticorps/lysate et incuber pendant 1 h à 4 °C avec une agitation douce.</li>
	<li>Placez le tube dans le support magnétique sur la glace pendant 1 min ou jusqu’à ce que les perles soient entièrement magnétisées et que l’échantillon soit clair. Enregistrer le supernatant pour l’analyse des taches occidentales (facultatif).</li>
	<li>Laver les perles contenant l’immunoprécipice 3x dans 450 μL de tampon de lavage (30 mM HEPES, pH = 7,4, chlorure de potassium de 100 mM, 0,1% Triton X, chlorure de magnésium de 2 mM, 10% glycérol, 1 mM TNT; voir tableau 1) sur glace. REMARQUE : Des lavages supplémentaires peuvent être effectués si des conditions de lavage plus strictes sont préférables.</li>
	<li>Resuspendez la pastille de perles dans 20 μL de tampon de chargement de gel protéique SDS/BME (voir tableau des matériaux)et déliaturez en bouillant à 95 °C pendant 5 minutes avant de charger sur un gel SDS-PAGE. Alternativement, les échantillons dénaturés peuvent être stockés à -20 °C pendant plusieurs mois. REMARQUE : Une partie de l’immunoprécipice de perle peut être sauvée pour l’isolement en aval d’ARN, si désiré.</li>
</ol>4. Détection occidentale des taches d’échantillons de propriété intellectuelle
<ol><li>Chargez les échantillons IP sur le gel SDS-PAGE (voir tableau des matériaux). Évitez de transférer les perles en plaçant les tubes IP sur le support magnétique pendant 1 min avant l’aspiration de l’échantillon.</li>
	<li>Effectuez le ballonnementoccidental 15,16 et les taches d’anticorps16 avec les modifications suivantes : diluer l’anticorps ALG-117 1:500 dans 5 % de lait sec non gras (NFDM); diluer l’anticorps HRPK-12 1:1 000 dans 5 % NFDM; et diluer l’anticorpsAIN-1 18 1:10,000 dans 5% NFDM. Les anticorps secondaires (voir tableau desmatériaux) ont été utilisés selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Détecter les bandes avec la chimioluminescence à base de HRP (voir tableau des matériaux).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

C. elegans est un excellent modèle pour étudier les questions fondamentales en biologie cellulaire, moléculaire et développementale19. En plus de sa puissance en tant que système de modèle génétique, C. elegans est sensible aux approches biochimiques, y compris, mais sans s’y limiter, l’immunoprécipitation et la co-immunoprécipitation des protéines. Un obstacle potentiel lors de la conduite d’expériences d’immunoprécipice est le manque d’anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt. Si aucun anticorps n’est disponible, des anticorps polyclonals ou monoclonaux personnalisés peuvent être générés. Cependant, les innovations récentes dans la technologie d’édition du génome ont permis aux chercheurs d’introduire rapidement des mutations ou tag endogènes gènes C. elegans 20,21, facilitant les études qui démêler les interactions génétiques, fonctionnelles et physiques entre les gènes et les protéines codées. Plus précisément, le marquage crispr/cas9-24 des gènes de C. elegans au loci endogène a réduit la dépendance des expériences d’immunoprécipitation sur la disponibilité d’anticorps, rendant des expériences de co-immunoprécipitation beaucoup plus réalisables. Les gènes C. elegans peuvent être marqués avec une variété d’étiquettes allant des étiquettes fluorescentes telles que GFP ou mCherry aux petites étiquettes telles que FLAG et HA. Les anticorps reconnaissant ces étiquettes sont facilement disponibles dans le commerce, facilitant les études des interactions protéine-protéine par des approches d’immunoprécipitation.
Le protocole présenté, décrit à la figure 1,peut être effectué pour un petit nombre d’échantillons ou mis à l’échelle, ce qui permet jusqu’à 24 préparations d’échantillons à la fois. Bien que les caractérisations initiales des interactions protéine-protéine par immunoprécipitation se font généralement dans des milieux de type sauvage dans des conditions de croissance normales, les études de suivi nécessitent fréquemment de tester les interactions protéine-protéine dans une variété de milieux génétiques ou dans des conditions de croissance différentes. La capacité de préparer simultanément plusieurs extraits permet de gagner du temps et, surtout, assure la cohérence de la préparation des extraits entre les différents échantillons. Un contrôle négatif est toujours nécessaire, le contrôle idéal étant une mutation nulle dans l’encodage génétique de la protéine d’intérêt immunoprécipitée (voir la figure 3 et la figure 4 par exemple).
Ce protocole d’extrait permet la préparation rapide d’extrait de protéine des échantillons de C. elegans et est comparable à l’homogénéisation à base de perle de zirconium8. L’homogénéisation des perles en général peut être réduite à plusieurs préparations simultanées d’échantillons à l’aide d’une variété d’homogénéisateurs de moulin à perles ou d’équipements similaires. Certains homogénéisants plus économiques moulin à perles peuvent réduire le nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément, cependant. Alternativement, le protocole d’extrait présenté est compatible avec la préparation à base de dounce d’extrait, qui représente une alternative économique. Bien que différents homogénéisants de moulin à perles n’aient pas été testés, la plupart sont susceptibles d’être compatibles avec ce protocole d’extrait de protéine, tant que la perturbation complète des échantillons de C. elegans est atteinte.
Tel que présenté, ce protocole de préparation d’extrait est compatible avec de multiples expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et le retrait du microARN12 et permet la collecte en aval des composants protéiques et arn. Il extrait également efficacement les protéines nucléaires et cytoplasmiques (figure 2, figure 3et figure 4). De même, le protocole d’immunoprécipitation présenté permet l’isolement d’ARN des immunoprécipices protéine-associés. Bien que le protocole d’immunoprécipitation ait été initialement mis au point pour identifier les interacteurs protéiques ALG-1, la méthode peut être adaptée pour tester les interactions entre toutes les protéines d’intérêt. En fait, les conditions d’immunoprécipitation utilisées ont fonctionné également bien pour l’immunoprécipitation de l’ALG-1 (figure 3) et du HRPK-1 (figure 4). Ce protocole est un excellent point de départ pour l’immunopurification des protéines liant l’ARN. Il convient toutefois de noter que certains changements dans la composition tampon peuvent être nécessaires pour d’autres protéines d’intérêt. Les changements peuvent dépendre des propriétés physiques et biochimiques de la protéine d’intérêt et doivent être mis en œuvre au cas par cas.
Une fois que la protéine cible (ici, ALG-1 ou HRPK-1) est immunoprécipitatée, le ballonnement occidental peut être utilisé pour tester le co-immunoprécipice pour des interacteurs spécifiques de protéine.
Alternativement, l’immunoprécipice copurifié peut être soumis à l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier toutes les protéines d’interaction putatives. Les interactions confirmées de co-immunoprécipitation peuvent ensuite être examinées dans une variété de milieux ou de conditions génétiques afin d’identifier la régulation potentielle de l’interaction spécifique. Par exemple, pour déterminer si le hrpk-1 joue un rôle dans l’assemblage ALG-1/AIN-1 miRISC, la coprécipitation ALG-1-AIN-1 a été évaluée à la fois dans un contexte sauvage et en l’absence de HRPK-1 (figure 3). hrpk-1 s’est révélé dispensable pour l’interaction ALG-1/AIN-12 (Figure 3). En outre, la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour générer des mutations ponctuelles ou de suppression de domaine dans les protéines d’intérêt. Le retest de la capacité des mutants générés à coprécipifier avec leurs interacteurs protéiques peut révéler quels domaines ou résidus médiation l’interaction physique. De telles études futures peuvent fournir des informations précieuses sur le mécanisme de la fonction et de la régulation des protéines. Ces approches, combinées à la puissance de la génétique C. elegans, peuvent fournir des informations importantes sur les processus moléculaires fondamentaux qui régissent le développement des animaux et la fonction cellulaire.

L’identification des interactions macromoléculaires d’une protéine d’intérêt peut être essentielle pour en apprendre davantage sur sa fonction. Des expériences d’immunoprécipitation et de co-immunoprécipitation peuvent être utilisées pour identifier l’interaction entière d’une protéine par des approches protéomiquesà grande échelle 1 ou pour tester spécifiquement la capacité d’une protéine à coprécipifier avec un interacteur hypothéqué. Dans C. elegans, les deux méthodes ont été utilisées avec succès pour en apprendre davantage sur l’activité d’une variété de protéines, y compris celles qui fonctionnent étroitement avec les microARN pour réguler l’expressiondes gènes 2,3,4. Les expériences de co-immunoprécipitation ont l’avantage de tester les interactions protéine-protéine dans leur environnement cellulaire natal, mais la préparation des extraits peut être difficile et prendre beaucoup de temps. Une lyse efficace de l’échantillon est nécessaire, mais il faut prendre soin de minimiser la perturbation des interactions protéines-protéines. Des méthodes telles que le douncing5, la sonication6, l’homogénéisation de Balch7, et la zirconia perles-homogénéisation8,9 ontété employées pour préparer avec succès des extraits totaux de protéine de C. elegans. Ces méthodes, à l’exception de l’homogénéisation des perles de zirconia, ont des limites en termes de nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément. Présentée est une méthode alternative qui peut être facilement mise à l’échelle pour permettre une préparation rapide et à haut débit d’extrait de protéine à partir d’échantillons de C. elegans suivis de co-immunoprécipice. Plus précisément, la méthode peut préparer jusqu’à 24 échantillons à la fois, réduisant considérablement le temps nécessaire à la préparation de l’extrait. En revanche, par exemple, le douncing ne permet généralement qu’une seule préparation d’échantillon à la fois. Cette méthode d’extrait peut être utilisée pour préparer des extraits de n’importe quel stade de développement de C. elegans.
Décrit est une procédure étape par étape pour la collecte d’échantillons d’animaux, la préparation d’extraits, l’immunoprécipitation et la présentation de données de ballonnement occidental pour confirmer le retrait réussi des protéines et la détection de la protéine co-immunoprécipitante d’intérêt. Pour démontrer l’efficacité du protocole, deux expériences de co-immunoprécipitation ont été exécutées entre 1) microARN Argonaute ALG-1 et AIN-1, un homolog GW182 ; et 2) ALG-1 et HRPK-1, un nouvel interacteur ALG-12. ALG-1 et AIN-1 sont des protéines de base qui composent le complexe de silencing induit par microARN (miRISC) et l’interaction entre ces deux protéines estbien établie 10,11. Le protocole de préparation d’extrait était efficace dans l’expérience de co-immunoprécipation d’ALG-1-AIN-1. Ce protocole a également confirmé avec succès l’interaction entre ALG-1 et son nouvel interacteur, HRPK-12.
En résumé, le manuscrit décrit un protocole de préparation d’extrait de C. elegans qui peut être mis à l’échelle jusqu’à traiter simultanément 24 échantillons avec un protocole de co-immunoprécipitation qui peut être utilisé pour identifier de nouvelles interactions ou confirmer des interactions supposées entre les protéines. Le protocole de préparation de l’extrait est compatible avec un certain nombre d’expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et les retraits de microARN12. En outre, le protocole d’immunoprécipitation peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus endogènes dans une variété de milieux génétiques.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Les méthodes de co-immunoprécipitation sont fréquemment utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine. La confirmation d’interactions protéinées-protéines supposées ou l’identification de nouvelles interactions peuvent fournir des informations précieuses sur la fonction d’une protéine d’intérêt. Certaines des méthodes traditionnelles pour la préparation d’extrait exigent fréquemment des techniques laborieurs et chronophages. Ici, un protocole modifié de préparation d’extrait utilisant un homogénéisateur de moulin de perle et des perles en métal est décrit comme alternative rapide aux méthodes traditionnelles de préparation de protéine. Cette méthode de préparation d’extrait est compatible avec des études en aval de co-immunoprécipitation. À titre d’exemple, la méthode a été utilisée pour co-immunoprécipifier avec succès C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 et deux interacteurs connus d’ALG-1 : AIN-1, et HRPK-1. Ce protocole inclut des descriptions de la collecte d’échantillon d’animal, de la préparation d’extrait, de la clarification d’extrait, et de l’immunoprécipice de protéine. Le protocole décrit peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus en endogènes ou surexprimées dans une variété de milieux génétiques.

Ce protocole (schématisé à la figure 1) a été utilisé avec succès pour obtenir des extraits totaux de protéines C. elegans (figure 2) pour l’immunoprécipitation enaval de plusieurs protéines 2 (figure 3 et figure 4). Le protocole homogénéisant présenté par le moulin à perles était comparable dans l’extraction totale des protéines aux méthodes à base de dounce (figure 2) et extrait efficacement nucléaire (COL-19::GFP (NLS) (Figure 2) et protéines cytoplasmiques (figure 3 et figure 4). Plusieurs échantillons de différentes tailles ont été extraits simultanément (Figure 2). Les protéines argonautes interagissent avec les membres de la famille des protéines GW182, formant les miRISCs qui se lient aux ARN messagers cibles et répriment leur expression10. La figure 3 montre une co-immunoprécipitation réussie des composants miRISC de base ALG-1 et AIN-1, conformément aux rapportsprécédents 11,17. Plus récemment, des efforts ont été déployés pour identifier d’autres facteurs protéiques d’ArgonauteALG-1 3 afin d’en apprendre davantage sur la façon dont la biogenèse et l’activité des microARN pourraient être réglementées par des facteurs auxiliaires. La protéine liant l’ARN HRPK-1 a été identifiée dans les immunoprécipicesALG-1 3. Cette interaction a été récemment confirmée dans une expérience réciproque d’immunoprécipitation HRPK-12. Les protocoles présentés d’extrait et d’immunoprécipitation ont réussi à récupérer ALG-1 dans les co-immunoprécipices spécifiques à HRPK-1 (figure 4). De plus, l’interaction ALG-1—AIN-1 a été testée dans divers milieux génétiques et il a été démontré que le HRPK-1 n’était pas nécessaire pour l’assemblage2 de l’ALG-1/AIN-1 miRISC (figure 3). Des chiffres supplémentaires sont fournis pour montrer la membrane complète sondée(Figure supplémentaire 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figure 1 : Schéma de flux de travail pour la préparation et l’immunoprécipice d’extrait de C. elegans. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figure 2 : Comparaison des taches occidentales d’un GFP localisé nucléaire, COL-19::GFP (NLS), niveaux dans des échantillons préparés et homogénéisés de dounce de 250 μL et de 100 granulés de ver de μL. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figure 3 : GW182 homolog AIN-1 co-immunoprécipice avec ALG-1. Ballonnement occidental pour les protéines ALG-1 et AIN-1 dans les immunoprécipices ALG-1. La co-immunoprécipitation alg-1/AIN-1 n’a pas été affectée par l’absence de hrpk-1. Entrée = 10% de la propriété intellectuelle. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figure 4 : Co-immunodéprécipices ALG-1 avec HRPK-1. Le ballonnement occidental pour HRPK-1 et ALG-1 dans les immunoprécipices HRPK-1 est montré. Entrée = 10% de la propriété intellectuelle. * indique chaîne lourde d’anticorps. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tampon M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon 2x Lysis (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycérol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ajouter frais:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TNT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibiteur de la protéase sans EDTA</td>
			<td>1 comprimé</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inhibiteur de phosphatase 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inhibiteur de phosphatase 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampon de lyse</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluer le tampon 2x Lysis avec un volume égal de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampon wash 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycérol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TNT</td>
			<td>20 μL (ajouter frais)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recettes
Figure supplémentaire 1. Les membranes de tache occidentales sondées complètes utilisées pour générer les figures 2-4 sont montrées. (A) Membrane sondée pour la figure 2. Notez que la membrane a été coupée pour permettre une sonder simultanément pour GFP et Tubulin, réduisant ainsi la taille globale des taches. (B) Membrane sondée pour la figure 3. (C) Membrane sondée pour la figure 3. *désigne la chaîne lourde d’anticorps. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Cette méthode décrit un protocole pour la préparation d’extrait de protéine à haut débit des échantillons d’elegans de Caenorhabditis et la co-immunoprécipitation suivante.

Préparation et co-immunoprécipitation d’extrait de protéine de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.7K vues.  Kansas State University. Cette méthode décrit un protocole pour la préparation d’extrait de protéine à haut débit des échantillons d’elegans de Caenorhabditis et la co-immunoprécipitation suivante.

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Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Biochimie

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biologie

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinée des nucléotides et des Extractions de protéine chez Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Dissection manuelle des intestins de Caenorhabditis elegans

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Dissociation unicellulaire de Caenorhabditis elegans : une méthode pour isoler des cellules vivantes

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Préparation et co-immunoprécipitation d’extrait de protéine de Caenorhabditis elegans

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Extraction de prostaglandine et de l'analyse en

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

Combinée des nucléotides et des Extractions de protéine chez Caenorhabditis elegans

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Dissection manuelle des intestins de Caenorhabditis elegans

Dissociation unicellulaire de Caenorhabditis elegans : une méthode pour isoler des cellules vivantes