L’objectif global de cette procédure est de produire un vaccin glycoconjugate homogène en combinant l’incorporation non canonique d’acides aminés et la cliquez-chimie. L’expansion du code génétique est un outil puissant pour incorporer des acides aminés contre nature dans les protéines afin de modifier leurs caractéristiques, d’étudier ou de créer de nouvelles fonctions protéiques, ou d’avoir accès à des conjugués protéiques. Une méthode de suppression du codon est apparue comme la méthode la plus populaire pour incorporer des acides aminés contre nature à différentes positions.
Cette méthodologie sera ici appliquée à la production d’un porteur de protéines contenant un acide aminé contre nature abritant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Cette poignée réactive peut ensuite être utilisée pour greffer spécifiquement et efficacement un hapten oligosaccharide synthétique pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène. La propargyl-lysine, PrK, est synthétisée en deux étapes à partir de boc-lysine commerciale.
Dans un premier temps, le groupe aminé non protégé du Boc-lysine est converti en chloroformate propargyl. Dans un deuxième temps, le groupe alpha amino est dé-protégé. Pour synthétiser le N(alpha)Boc-propargyl-lysine, dissoudre d’abord 500 milligrammes de Boc-lysine dans le mélange de cinq millilitres d’une molaire aqueuse NaOH et cinq millilitres de THF dans un flacon et adapter le flacon avec un septum de silicium.
Refroidir le flacon dans un bain de glace et attendre que la poudre soit dissoute. Ajouter ensuite le chloroformate propargyl sur une période de deux à trois minutes en remuant. Réchauffer le mélange de réaction à température ambiante et poursuivre l’agitation pendant 10 heures.
Refroidir les solutions d’éther diététhyle, d’acide chlorhydrique aqueux et d’acétate éthylique. Refroidir le mélange de réaction brute dans un bain de glace. Verser le mélange dans un entonnoir séparant.
Extraire un mélange avec cinquante millilitres d’éther de diététhyle. L’extraction peut entraîner une accumulation de pression, assurez-vous de libérer toute accumulation de pression fréquemment. Recueillir la phase aqueuse et jeter la couche organique.
Ajouter prudemment cinquante millilitres d’un acide chlorhydrique molaire à la phase aqueuse de l’entonnoir séparant. Puis, extraire la couche aqueuse deux fois à l’aide de trente millilitres d’acétate d’éthyle. Recueillir la phase organique, vérifier la présence de votre composé par TLC.
À ce stade, il devrait être dans la phase organique. Sécher les couches organiques combinées sur le sulfate de magnésium. Filtrer la phase solide.
Et concentrez le filtrate sous pression réduite sur un évaporateur rotatif. Dissoudre l’échantillon du pétrole brut N(alpha)Boc-propargyl-lysine dans le chloroforme stérilisé et contrôler son identité par NMR. Pour synthétiser le propargyl-L-lysine, introduisez le N(alpha)Boc-propargyl-lysine dans un flacon de bouton rond équipé d’un septum.
Ajouter quatre millilitres de dichloromethane anhydre dans le flacon sous argon. Ajouter quatre millilitres d’acide trifluoroacétique en remuant. Remplacez le septum de silicium pour un couvercle en verre pour éviter que tfa n’endommage le septum de silicium.
Remuer le mélange de réaction pendant une heure à température ambiante. Vérifiez la déprotection du Boc-PrK par TLC. Concentrez le mélange de réaction sous pression réduite.
Ajouter l’éther de déthyle aux résidus bruts. Filtrer le propargyl-L-lysine sous la forme d’un solide blanc sur un verre fritté. Dissoudre un aliquot du propargyl-L-lysine dans l’oxyde de deutérium, puis effectuer une analyse NMR pour contrôler son identité et sa pureté.
Propargyl-L-lysine est ensuite dissous dans de l’eau distillée à la concentration finale de cent millimollaires et stockés à moins 20 degrés en un millilitre aliquots. Pour co-transformer les plasmides en souche d’expression, décongelez une centaine de microlitres aliquot d’E.Coli BL21 chimiquement compétent sur la glace pendant cinq minutes. Ajouter un microlitre de chaque plasmide ou cinquante à cent nanogrammes de chacun dans les cellules et les incuber pendant 30 minutes sur la glace.
Incuber les cellules compétentes à 42 degrés, pendant 45 secondes. Ensuite, remets-les sur la glace pendant deux minutes. Ajouter neuf cents microlitres de LB moyen et incuber sous secouant pendant une heure à 37 degrés pour permettre l’expression des antibiotiques.
Ensuite, plaquez les bactéries transformées sur l’agar LB avec des antibiotiques. Laissez les bactéries se développer pendant la nuit à 37 degrés. Pour exprimer les protéines modifiées avec prk, inoculer une seule colonie co-transformée en cinq millilitres de milieu LB avec des antibiotiques.
Incuber toute la nuit à 37 degrés avec des secousses. Le lendemain, diluer avec les cinq millilitres de la culture primaire en cinq cents millilitres de milieu d’auto-induction contenant des antibiotiques, 0,02% de L-arabinose, et un millimolaire de PrK et d’incuber à 37 degrés pendant 24 heures sous secousses. Inclure un contrôle négatif en effectuant la culture sans PrK et le contrôle positif en effectuant la culture d’un clone contenant le gène de protéines de type sauvage.
Récolter les cellules de la culture nocturne par centrifugation à 5000 x g pendant 10 minutes. Jeter le surnatant et congeler la pastille à moins 20 degrés. Pour la purification de la protéine par chromatographie d’affinité d’écoulement de gravité-banc, résuspendez les granules de cellules dans vingt millilitres de tampon de lyse.
Ajouter le DNase I et le lysozyme, et permettre la lyse en incubant la suspension à 37 degrés pendant 30 minutes. Sonicate les cellules dans la glace pendant cinq minutes, puis enlever les débris cellulaires par centrifugation à 20.000 x g pendant 30 minutes. Filtrate le lysate avec filtre de 0,45 micromètre Ajouter de la résine Ni-NTA à la suspension.
Mélangé doucement à quatre degrés pendant une heure. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène et recueillir la fraction non lié. Laver la résine avec dix millilitres, puis cinq millilitres de tampon de lavage.
Recueillir les fractions de lavage. Elutez la protéine saguée avec un millimètre de tampon d’élitution et répétez cette étape quatre fois et recueillez toutes les fractions supplémentaires. Combinez les fractions contenant des protéines pures étiquetées histidine et dialyz-les dans un litre de tampon de protéase TEV pendant la nuit en utilisant la membrane de dialyse.
Recueillir l’échantillon de protéines dans un tube de 50 millilitres et ajouter le tampon TEV pour obtenir une concentration finale de deux milligrammes par millilitre dans un volume final d’un millilitre. Ajouter une centaine de microlitres de protéase TEV. Ajouter 50 microlitres de 0,1 molaire DTT.
Complet avec tampon TEV jusqu’à cinq millilitres. Incuber toute la nuit à quatre degrés, avec des secousses lentes. Pour éliminer l’EDTA, dialysez la protéine à quatre degrés pendant la nuit en utilisant la membrane de dialyse et le tampon de phosphate avec l’imidazole millimolaire de cinq millimolar.
Pour éliminer la protéase TEV et les protéines non digérées, incubez le mélange avec des perles Ni-NTA et mélangez doucement pendant une heure à quatre degrés. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène. Recueilli la fraction non lié.
La protéase TEV et les protéines non digérées restent liées aux perles et la protéine digérée est éludée. Lavez la colonne avec cinq millilitres de tampon de lavage et de recueillir les fractions de lavage ainsi. Dialyz la protéine digérée contre un litre de tampon de clic à quatre degrés pendant la nuit avec la membrane de dialyse pour enlever l’imidazole aussi bien que pour échanger le tampon.
Et mesurer la concentration de la protéine à 280 nanomètres. Pour conjuguer le mPsaA avec 6-hexachloro-fluorescéine-azide, ou un antigène de hydrate de carbone antidote-fonctionnalisé, mettez la protéine mutée de PrK à une concentration de 57.8 micromolar dans un micro tube de deux millilitres. Ajouter 10 microlitres de composé d’azide de cinq millimolaires, puis ajouter un pré-mélange de solution de sulfate de cuivre et THPTA.
Ajouter l’hydrochlorure d’aminoguanidine. Ajouter la solution aqueuse extemporanéée de l’ascorbate de sodium. Fermer le tube, mélanger en inversant plusieurs fois et incuber à température ambiante pendant deux heures.
Arrêtez la réaction en ajoutant EDTA. Vérifiez la conjugaison sur la page SDS. Après la migration, visualiser le gel sur la lumière UV à 312 nanomètres pour le conjugué avec la fluorescéine.
Ou tacher le gel avec Coomassie Blue pour visualiser le conjugué avec l’antigène de glucides. Comme l’ajout de l’hapten devrait induire un changement de poids moléculaire. Purifier le glycoconjugate en l’appliquant sur une colonne gel-filtration équilibrée avec PBS.
Recueillir les fractions contenant les glycoconjugates. Pour un stockage prolongé, dialyser le glycoconjugate contre l’eau distillée, puis congeler-sécher et stocker le glycoconjugate à moins 80 degrés. Le PrK a été introduit à la position 32 en remplacement d’une lysine près du N-terminus de la PsaA.
L’efficacité de la production de mPsaA a été vérifiée par la page SDS et l’analyse de tache occidentale utilisant l’anticorps d’étiquette d’anti-Histidine. La présence d’une protéine pleine longueur indique fortement l’incorporation réussie de la PrK. L’intensité est toutefois inférieure à celle observée pour les mPsaA de type sauvage.
Le mPsaA (K32PrK) a été purifié sur des perles Ni-NTA. Avec un rendement typique de huit milligrammes et l’incorporation du résidu de PrK a finalement été confirmé par spectrométrie de masse. L’étiquette d’Histidine a été enlevée sur le clivage protéolytique utilisant la protéase de TEV.
Ayant le mPsaA (K32PrK)la réactivité de l’alkyne a été évaluée utilisant une fluorescéine azido-fonctionnalisée et plus loin employée pour conjuguer un antigène synthétique d’oligosaccharide. Des expériences ont été faites en comparaison avec des mPsaA de type sauvage comme un contrôle. Enfin, le glycoconjugate a été purifié par filtration de gel et son identité confirmée par spectrométrie de masse.
Dans le cadre de ce projet, des vaccins homogènes contre la glycoconjugate ont été préparés à l’aide de la technologie de suppression du codon d’arrêt de l’ambre pour incorporer un acide aminé contre nature sous des sites définis. L’homogénéité du vaccin glycoconjugate est un critère important pour assurer une caractérisation physico-chimique complète. Et donc, satisfaire de plus en plus exigeantes recommandations de l’agence du médicament.
Ce critère n’est pas satisfait en utilisant la méthode classique de pure conjugaison. De plus, ce protocole permet d’affiner finement la structure du vaccin glycoconjugate. Donnant lieu à un outil sans précédent pour étudier la relation entre l’homogénéité et la structure d’un glycoconjugate.
