L’embryogenèse de C.elegans prend environ 13 heures, et est habituellement surveillée en filmant un embryon à la fois. Notre protocole, cependant, permet l’imagerie simultanée en 3D time lapse de 80 à 100 embryons. La capacité de recueillir des données pour un grand nombre d’embryons de C.elegans en développement ouvre une nouvelle gamme d’expériences, y compris l’analyse quantitative des événements développementaux et des écrans à grande échelle.
Ce protocole peut être facilement adapté pour capturer différents processus de développement ou pour l’image d’embryons exprimant n’importe quelle combinaison de marqueurs dans les tissus d’intérêt. Il est difficile de bien disperser les embryons à l’intérieur des puits. Ils doivent être proches les uns des autres pour permettre la capture de plusieurs embryons par champ sans s’agglutiner dans différents plans Z.
Nous recommandons d’utiliser deux chercheurs pour la dissection côte à côte, sur la glace et le blocage des puits inutilisés. Nous allons également démontrer quelques astuces utiles pour mettre en place rapidement une plaque bien mise en scène de 384 puits. Commencez par sceller une plaque à fond de verre de 384 puits avec du papier adhésif PCR pour masquer les puits inutilisés.
Utilisez un rasoir ou un scalpel pour couper le papier d’aluminium pour exposer un sous-ensemble des puits pour une utilisation. Ajouter 70 microlitres de TMHC fraîchement préparé dans chaque puits et garder la plaque sur la glace. Exclure les deux rangées extérieures de la plaque pour éviter les effets de bord.
Pour une préparation rapide de l’échantillon, une dissection côte à côte par deux chercheurs est recommandée. Lorsque toute la solution a été plaquée, utilisez des pinces fines et un microscope à dissection pour transférer environ 10 adultes gravid dans 150 microlitres de solution tmhc glacée dans une diapositive de dépression par condition. À l’aide de la pince à épiler et d’un scalpel, disséquer les vers pour libérer les embryons et charger une pipette capillaire tirée dans un aspirateur buccaux.
Utilisez la pipette buccae pour transférer tous les embryons de deux à huit cellules dans des puits individuels de la plaque préparée et examiner la plaque pour confirmer qu’aucun agrégat n’est présent dans les puits. Lorsque tous les embryons ont été prélevés, réglez les spécimens par centrifugation et utilisez un lingette imbibé d’éthanol pour éliminer tout résidu du fond de la plaque. Placez la plaque dans le porte-plaques d’un microscope confocal équipé d’un environnement à température contrôlée et utilisez l’objectif 10X pour effectuer un pré-balayage de chaque puits afin d’identifier les champs avec des embryons appropriés.
À la fin de l’analyse, passez à l’objectif 60X, ajustez le plan focal à chaque point pour l’image d’un à quatre champs par puits et acquérez 18 sections Z à deux intervalles de micromètre toutes les 20 minutes pendant 10 heures. Lorsque toutes les images ont été acquises, effectuez un balayage faible et entier bien brillant, environ 20 à 24 heures après le début de l’imagerie de nuit pour évaluer la létalité embryonnaire. Pour le recadrage automatisé à l’aide d’embryoCropUI exécutable, téléchargez d’abord le programme à partir de Zenodo et des testfiles.
zip pour déterminer si le programme fonctionne correctement sur la plate-forme. Une fois téléchargé, dézip et naviguer pour trouver le fichier embryoCropUI exécutable et double clic pour lancer le programme. Sélectionnez ouvert pour charger le premier champ de vision 4D spécifique à la culture.
Lors de la culture d’une série TIFF avec plusieurs dimensions charger seulement la première image de la série dans le dossier. Lorsque toutes les images ont été chargées, spécifiez les paramètres d’imagerie, sélectionnez la correction de soustraction et d’atténuation de l’arrière-plan, et définissez l’ordre de collecte d’images et les microns par pixel. Ensuite, sélectionnez exécuter, une nouvelle culture étiquetée sous-dépliant sera créé dans le même chemin que le dossier non recadré et les versions rognées seront enregistrées à cet endroit.
Pour la visualisation, téléchargez les instructions ouvertes et combinées msv2 ImageJ plugin et interface utilisateur graphique Zenodorepov2. docx de Zenodo et ouvrez le plugin dans IMageJ. Localisez les lignes trois et quatre et entrez l’emplacement où les dossiers d’image seront stockés après la culture.
Le dossier d’image nomme les conditions à traiter, et l’identificateur alphanumérique unique pour chaque expérience de nuit. Lorsque toutes les informations ont été saisies, cliquez sur exécuter. Une fenêtre apparaîtra qui lancera une invite à naviguer vers le dossier externe contenant les dossiers d’image rognés.
Une fois sélectionnée, une autre fenêtre apparaîtra qui permettra de spécificationr les paramètres d’imagerie. Cliquez bien. Le fichier composite commencera à s’assembler.
Lorsque le composite a été généré, examinez les fichiers laissés ouverts. Lorsqu’elles sont photographiées en conjonction, les souches de reporter personnalisées fournissent des lectures informatives pour la plupart des événements de développement majeurs. Y compris la spécification du sulfate, l’intercalation dorsale, l’enclos épidermique, l’allongement et la neurogenèse.
24 heures après l’injection est un point de temps optimal pour l’imagerie. À cette époque, l’épuisement et l’inhibition des protéines maternelles de l’expression des gènes zygotiques produisent tous deux des phénotypes de signature distincts et hautement reproductibles dans un large éventail de gènes impliqués dans la spécification du sulfate et la morphogenèse. Il est important d’être patient pendant les étapes de dissection et de sélection d’embryons.
Il est également essentiel de minimiser l’agglutination et de sélectionner les plans focaux appropriés pour assurer des données de haute qualité. Notre protocole peut être effectué avec une variété de souches de marqueurs fluorescents et en combinaison avec RNAi ou mutants. Nos outils de traitement permettent une analyse de données simplifiée, automatisée ou manuelle.
En utilisant les souches, les méthodes et les outils décrits ici, notre groupe a effectué un écran à contenu élevé basé sur l’ARNi ciblant environ 2000 gènes nécessaires au développement embryonnaire. Des méthodes à débit semi-élevé étaient essentielles pour ce projet.
