La culture des tranches organotypiques est un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux et dégénératifs ou régénérateurs. Cette technique peut être utilisée pour dépister rapidement les molécules candidats pour leur potentiel neuroprotecteur. Cette méthode imite étroitement les conditions in vivo, par rapport aux cultures cellulaires primaires dissociées, car l’architecture des ensembles tissulaires et les connexions cellulaires indigènes sont préservées dans les plans des sections.
Ici nous démontrons l’étude de la mort cellulaire de Purkinje dans le cervelet en développement. Mais la culture organotypique de tranche est également appropriée pour modéliser des maladies neurodegenerative dans presque chaque région centrale de système nerveux. Sean McDermott, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure avec Jennifer Rakotomamonjy.
Avant de récolter les tranches de cerebellar, dans une armoire de biosécurité stérilisée, remplissez chaque puits d’une plaque de culture de six puits d’un millilitre de milieu de culture filtré sous vide, et ajoutez l’agent pharmacologique d’intérêt aux puits de traitement, et un volume égal de véhicule aux puits de contrôle. À l’aide de forceps stériles, placez un filtre à membrane PTFE de taille pore de 0,4 micromètre inséré dans chaque puits, en prenant soin d’éviter les bulles à l’interface de chaque membrane et de chaque milieu, et équilibrez le milieu dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Pour récolter le cervelet, utilisez des pinces droites pour saisir la tête de chiot par le nez, et utilisez des ciseaux droits pour ouvrir le cuir chevelu de l’extrémité postérieure latéralement à la ligne médiane.
Coupez le crâne de la même manière, en pointant les pointes de ciseaux vers l’extérieur pour éviter d’endommager le cervelet, et utilisez une spatule pour transférer le cerveau dans un plat de 60 millimètres contenant du HBSS froid et cinq milligrammes par millilitre de glucose. Utilisez les forceps droits pour disséquer soigneusement le cervelet et utilisez des forceps fins incurvés stériles pour placer le tissu sur un disque en plastique sur la table de coupe d’un hachoir à tissus. Faites pivoter la table de coupe pour orienter le tissu pour permettre l’acquisition de sections parasagittal, et tirez le bouton de dégagement de table vers la droite pour déplacer la table de coupe jusqu’à ce que la lame soit placée au bord du tissu.
Ajustez ensuite l’épaisseur de la tranche à 350 micromètres, et la vitesse de la lame à moyen, et démarrez l’hélico. Lorsque tout le cervelet a été tranché, éteignez l’hélico. À l’aide de forceps stériles, maintenez le disque sur un nouveau plat de 60 millimètres.
Utilisez une pipette de transfert pour rincer hbss plus le glucose sur le disque de sorte que les tranches tombent dans le plat. Ensuite, en touchant les échantillons le moins possible, utilisez un microprobe pour séparer les tranches. Utilisez la pipette de transfert pour sélectionner des sections du cervelet près du verme sur des inserts individuels de culture cellulaire dans la plaque de six puits, et utilisez le microprobe pour positionner les tranches au centre de chaque insert.
Lorsque toutes les tranches ont été placées, aspirez soigneusement tout excès de HBSS plus le glucose, et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Pour les taches d’immunofluorescence, retirez le surnatant de chaque puits et lavez les inserts avec du PBS. Fixer les tranches avec un millilitre de paraformaldéhyde froid de 4% dans le puits de chaque insert, et 500 microlitres sur chaque insert pendant une heure.
À la fin de la fixation, laver les inserts quatre fois pendant 10 minutes avec un millilitre de PBS frais sous chaque insert et 500 microlitres de PBS frais sur le dessus de chaque insert par lavage sur un shaker orbital. Pré-remplir chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de PBS-TB, et utiliser un pinceau pour transférer les tranches de cerebellar de chaque insert de culture cellulaire dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits. Perméabilizez et bloquez les tranches à température ambiante pendant une heure.
À la fin de l’incubation, étiquetez les cellules avec 200 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dilués dans PBS-TB par puits pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur le shaker orbital. Le lendemain matin, lavez les tranches quatre fois pendant 10 minutes et 500 microlitres de PBS frais par lavage sur le shaker, avant d’étiqueter les échantillons avec les anticorps secondaires conjugués au fluorophore appropriés pendant deux heures à température ambiante sur le shaker, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, contrestain les sections avec 500 microlitres d’une tache nucléaire appropriée par puits pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.
Et utilisez une pipette de transfert pour monter les tranches sur des toboggans en verre. Ensuite, laissez sécher complètement les sections avant de les réhydrater avec du PBS et de monter les tissus avec des couvertures recouvertes d’environ 80 microlitres de milieu de montage. Une fois que le support de montage s’est durci, les sections cerebellar sont prêtes à être imaged.
Au sixième jour postnatal, la survie cellulaire de Purkinje est faible dans les échantillons de contrôle, compatible avec leur fenêtre de vulnérabilité connue. La survie augmente à mesure que l’animal donneur vieillit et sort de cette période critique. Le traitement des tranches de cerebellar avec une forte concentration de chlorure de potassium a comme conséquence l’induction réussie de leur dépolarisation et survie.
Pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles, il est essentiel de sélectionner des sections de cerebellar saines et d’effectuer la configuration de la culture aussi efficacement que possible. Les applications post-culture vont au-delà de l’immunofluorescence. Comme les tranches organotypiques peuvent être utilisées pour les études d’expression des protéines du génome, et pour la surveillance de l’activité du circuit neuronal à l’aide de l’électrophysiologie et de l’imagerie en direct du calcium.
