Notre protocole peut être utilisé pour déterminer les événements dynamiques spacial et temporels pendant la mitose, et peut également être utilisé pour visualiser les effets des régulateurs mytotiques en temps réel. L’utilisation de l’imagerie à double couleur permet une analyse simultanée de deux marqueurs moléculaires. Par exemple, nous pouvons visualiser les microtubules du fuseau mytotique et la structure cœur cinétique des chromosomes répliqués.
Pour induire l’expression fluorescente de protéine, quatre jours après traitement d’interférence d’ARN, exposez les cellules transfectées inductibles de promoteur de metallo-thyanin à une concentration finale de 500 sulfate de cuivre de micromolar pendant 24 à 36 heures. Pour préparer la protéine fluorescente exprimant les cellules à l’imagerie, transférez les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres et, après comptage, sédimentez les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en SIM frais et réchauffé de 25 degrés Celsius, complétée par 10 % de FBS, à une concentration de deux fois 10 à 6 cellules par millilitre, et traitez les cellules avec du sulfate de cuivre supplémentaire de 500 micromolaires.
Ajoutez ensuite 200 à 500 microlitres de cellules à un puits d’une chambre cellulaire vivante multi-puits, et placez la chambre sur un stade de microscope fluorescent inversé. Pendant que les cellules s’installent dans la chambre, ouvrez le logiciel d’imagerie cellulaire en direct et cliquez sur nouveau et expérimentez. Pour insérer une boucle time lapse sur laquelle les images seront prises, cliquez sur l’icône de boucle time lapse.
Réglez l’intervalle en secondes, et divisez la longueur globale désirée de l’expérience en quelques secondes par l’intervalle pour définir le nombre de cycles. Laissez la boucle se répéter sur la période totale désirée. Pour insérer une vérification de mise au point infrarouge pour maintenir la mise au point de l’objectif, cliquez sur l’icône déplacer XY et sélectionnez Z drift compensation pour ajouter une étape de compensation de dérive Z dans la couche de boucle time lapse.
Pour permettre l’acquisition d’une image multicanal, cliquez sur l’icône de groupe multicanal pour ajouter une couche de groupe multicanal, et cliquez sur l’ajouter une icône de boucle de pile Z pour ajouter une couche de boucle de pile Z. Réglez ensuite la taille de l’étape désirée et le nombre de tranches, et réglez l’exposition de chaque canal à aussi bas que possible pour minimiser le blanchiment photo. Pour imager une division cellulaire, sélectionnez un objectif d’immersion d’huile de 40 ou 60 fois, et le canal de florescence mCherry, et alignez l’objectif le long du haut ou du bas du puits.
Éloignez-vous ensuite du séparateur vertical de puits pour éviter toute interférence avec l’étape de compensation de la dérive Z. Localisez une cellule ou des cellules à la fin de la phase G2 ou au début de la phase M, et cliquez sur le bouton d’affichage en direct pour commencer à visualiser les cellules dans l’écran du logiciel. Trouver les cellules appropriées à la transition G2 à M est la clé de l’imagerie d’une division cellulaire.
Localisez une cellule avec un noyau intact et exactement deux centrosomes pour obtenir de meilleurs résultats. À l’aide du bouton de mise au point fine du microscope, concentrez-vous sur les cellules d’intérêt et cliquez sur trouver offset pour régler la vérification de mise au point infrarouge. Cliquez sur commencer à lancer le programme d’imagerie time lapse, et sélectionnez le canal désiré et ajuster les intensités de pixel moyen pour ajuster les histogrammes au besoin, pour visualiser clairement les cellules d’intérêt.
Vérifiez les cellules après 15 à 20 minutes pour confirmer que la rupture de l’enveloppe nucléaire s’est produite, comme déterminé par la disparition de l’endroit rond et sombre réfracté près du centre de la cellule. Après encore 15 à 20 minutes, vérifiez si l’apparition de l’anaphase s’est produite. Ensuite, arrêtez le programme et enregistrez le fichier.
Pour déterminer la dégradation de l’enveloppe nucléaire au moment de l’apparition de l’anaphase, cliquez sur le bouton de mise en place du cadre pour déterminer l’heure de la rupture de l’enveloppe nucléaire et le moment de la séparation initiale du chromosome en quelques minutes, et soustrayez le temps de décomposition à partir du moment du début pour obtenir la rupture de l’enveloppe nucléaire jusqu’au moment de l’apparition de l’anaphase pour une cellule donnée. Ensuite, continuez à scanner les cellules de pré-division pour obtenir plusieurs extrémités pour une condition donnée pendant un jusqu’à 12 heures à partir du règlement initial. Les cellules qui sont sur le point de se diviser peuvent être ciblées par la présence de deux centrosomes et d’un noyau intact, comme l’indiquent la lumière réfractée et une tache plus foncée à l’intérieur de la cellule lorsqu’elles sont vues dans le canal alpha tubulin.
La dégradation de l’enveloppe nucléaire peut être visualisée par la disparition de cette tache sombre, ce qui entraîne la coloration uniforme du cytoplasme. Après la rupture de l’enveloppe nucléaire, le temps que chaque cellule prend pour former le fuseau et pour congrès et séparer les chromosomes peut être mesuré en notant les points de temps de ces événements par rapport à la dégradation de l’enveloppe nucléaire. Le traitement avec l’ARN double brin visé contre l’arrêt-court, une protéine de liaison croisée de microtubule d’actine suspectée pour affecter la dynamique de cycle cellulaire a comme conséquence un retard mytotic significatif.
Ce traitement a comme conséquence un retard significatif, avec beaucoup de cellules arrêtant à la metaphase et ne transitionnant jamais à l’anaphase pendant l’expérience entière de formation image de deux à trois heures. Le co-traitement avec l’ARN à double brin contre le tir et l’affaire rugueuse, une composante importante de ce point de contrôle, conduit à une suppression du phénotype d’arrestation, ayant pour résultat la rupture d’enveloppe nucléaire aux temps d’anaphase semblables aux cellules commandées et non traitées. Assurez-vous de sélectionner les cellules appropriées et ne perdez pas de temps à imagerie des cellules qui ne commencent pas la division.
Si une cellule ne commence pas à se diviser dans les 20 minutes, trouver une autre cellule. Les chercheurs peuvent suivre cette procédure pour aider à identifier de nouveaux régulateurs mytotiques, ou peut-être de nouveaux composés secs qui affectent des événements spécifiques dans la division cellulaire.
