L’infection par le VIH provoque un dysfonctionnement immunitaire même chez les personnes qui suivent un traitement antirétroviral sans virus détectable. Cette méthode permet l’étude de la fonction monocyte qui sont les régulateurs clés de la réponse immunitaire. Nous avons optimisé cette technique pour l’isolement, la culture et la transfection des monocytes primaires humains.
Nous utilisons cette méthode pour comprendre les mécanismes moléculaires du dysfonctionnement immunitaire chez les personnes infectées par le VIH, mais elle peut être appliquée à toute autre étude immunitaire impliquant des monocytes. Si c’est la première fois que vous travaillez avec du sang humain, n’oubliez pas de suivre les protocoles de biosécurité appropriés et de traiter tous les échantillons comme des matériaux potentiellement infectieux. Après avoir recueilli 40 millilitres de sang entier humain frais dans quatre tubes à vide EDTA de 10 millilitres, utilisez une technique stérile pour transférer tout le sang dans un seul tube conique de propylène de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.
Suivant les instructions du fabricant à partir d’un kit d’isolation des monocytes humains sélectionnés, ajoutez deux millilitres de cocktail d’isolation monocyte du kit au tube de sang et vortex les perles magnétiques du kit pendant 30 secondes. Ajouter deux millilitres de perles dans le sang et utiliser une pipette sérologique de 25 millilitres pour mélanger soigneusement les perles avec le sang. Après cinq minutes à température ambiante, diviser le sang également entre quatre tubes de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de PBS stérile complété par un millimolaire EDTA à chaque tube.
Mélanger à nouveau avec une pipette sérologique en plastique de 25 millilitres et placer les tubes dans des supports magnétiques. Après 10 minutes, utiliser une pipette pour dessiner le contenu à partir du centre de chaque tube en prenant soin de ne pas aspirer plus d’un millilitre de globules rouges et de distribuer le contenu du tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Ajouter 500 microlitres supplémentaires des perles magnétiques vortexées à chaque tube et mélanger délicatement la solution cellulaire.
Remettre les tubes dans les supports magnétiques pendant cinq minutes avant de transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Lorsque toutes les suspensions cellulaires ont été transférées, placez chaque nouveau tube de 50 millilitres dans les porte-aimants pendant cinq minutes avant de transférer soigneusement le contenu du tube dans un troisième ensemble de quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Puis recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre les quatre granulés cellulaires dans un total de 10 millilitres de PBS stérile pour le comptage.
Après comptage, resuspendez les monocytes isolés à une fois 10 aux sixièmes cellules par millilitre de 37 degrés Celsius sans sérum RPMI 1640 moyen complété avec des antibiotiques et plaque un millilitre de cellules résuspendues dans des plaques de 35 millimètres dans une armoire de biosécurité. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 à 60 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer au fond du puits. Pour commencer pour les macrophages avec un phénotype de type M1, ajouter 100 microlitres de sérum bovin fœtal contenant 25 nanogrammes par millilitre de GM-CSF à chaque plaque.
Pour prier les macrophages avec un phénotype de type M2, ajoutez 100 microlitres de bovins fœtaux contenant 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF à chaque plaque. Pour la transfection monocyte avec des imitations de microARN, inhibiteurs, ou un petit ARN interférant, suivant le protocole du fabricant pour le kit de transfection, diluer les ARN sélectionnés dans le tampon à une concentration finale de 1,83 micromolaire dans 10 microlitres d’imitation diluée ou inhibiteur par transfection d’une fois 10 au volume des cellules cinquième. Pour préparer le réaccente de transfection, ajouter un microlitre du polymère fourni à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter immédiatement 90 microlitres du tampon fourni par kit pour obtenir un total de 91 microlitres de réaccente par transfection.
Vortex le régent pendant trois à cinq secondes et pipette 90 microlitres de la solution de transfection dans le tube contenant 10 microlitres d’ARN dilué. Après un mélange doux, incuber la solution pendant 15 minutes à température ambiante avant d’ajouter 100 microlitres de teint transfection à un puits de cellules. Après quatre heures à 37 degrés Celsius, remplacer le milieu par trois millilitres de milieu complet contenant le facteur de croissance approprié.
Le sixième jour de la culture, remplacer les supernatants de culture des cultures M1 par trois millilitres de milieu complétés par du sérum bovin fœtal, des antibiotiques, du lipopolysaccharide et de l’interféron gamma et remplacer les supernatants des cultures M2 par un sérum bovin fœtal, des antibiotiques, du M-CSF et de l’interleukine-4. Après 24 heures de culture, lavez chaque assiette de macrophages activés deux fois avec du PBS frais par lavage. Pour les analyses d’ARN et de protéines, lyse les cellules attachées directement dans les plaques pour permettre la collecte du contenu cellulaire libéré pour leur analyse.
Pour l’analyse cytométrique d’écoulement, détachez les cellules avec deux millimolar EDTA dans PBS pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius avant de racler doucement les cellules du fond de plaque pour permettre leur collecte dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour leur analyse. Ici, des histogrammes représentatifs de cellules de contrôle activées par M1 et de cellules dérivées du patient avec des niveaux accrus de cellules CD80 et CD83 et M2 activées avec des niveaux accrus de CD163 et CD209 par rapport aux cellules T0 non activées sont montrés. Fait intéressant, le CD80 et le CD83 semblaient être plus fortement exprimés dans les cellules dérivées du contrôle que dans les cellules dérivées du VIH.
La transfection des monocytes fraîchement rassemblés avec un microARN étiqueté proche infrarouge brouillé a comme conséquence une plus grande efficacité de plus de 90% de transfection telle que déterminée par la cytométrie d’écoulement et la microscopie confocale. En outre, la transfection ne réduit pas significativement la viabilité des cellules dérivées du patient ou de contrôle, quel que soit le stade de maturation cellulaire ou les conditions de transfection. La transfection entraîne une downregulation efficace du gène cible lors de la transfection avec le petit ARN interférant spécifique au premier jour et au quatrième jour après l’isolement.
En outre, les cellules transfectées avec l’imitation de microARN démontrent une augmentation de 48 à 72 fois de l’expression de microARN au-dessus des cellules nontransfectées tandis que tous les contrôles de transfection ne montrent aucun changement appréciable. Le nombre de cellules plaquées est essentiel à la survie. Nous recommandons un million de cellules par plat de 35 millimètres.
Le placage dans le milieu sérique-libre améliorera également considérablement l’attachement cellulaire. Les cellules obtenues avec cette méthode peuvent être traitées avec des cytokines ou des facteurs de croissance pour étudier les réponses différentielles chez les patients d’intérêt et de contrôles sains.
