Dans la biomasse lignocellulosique, l’activité des enzymes analysant les polysaccharides est limitée par l’existence d’interactions non spécifiques avec la lignine. L’analyse fret est une approche pertinente pour l’évolution à l’échelle nanométrique. L’obtention de toutes les sections après peut être un défi selon la biomasse.
Prenez votre temps à faire la section avec le microtome et effectuer des lavages doux. La collision des mesures fluorescentes de la durée de vie et du spectre permet une détermination quantitative sensible et sans ambiguïté du FRET entre les molécules de lignine et tag in situ. Cette méthode utilise des techniques délicates, comme la section d’échantillons sur l’acquisition et l’analyse de microscopie multidimensionnelle qui peuvent être faciles à apprendre avec une démonstration visuelle.
Pour préparer des échantillons de plantes à partir de bois, de blé, de fibres ou de fragments, utilisez des lames de rasoir pour couper des échantillons d’un centimètre de long sans endommager la structure du matériau et placer les échantillons sous vide pour éliminer tout air. Submerger les échantillons pendant 24 heures en concentrations successives de 30 % et de 50 % de PEG diluées dans l’eau à température ambiante en remuant doucement. Suivi de 24 heures immergées dans une concentration de 100% de PEG à 70 degrés Celsius.
Après l’immersion de 100 % PEG, placez les échantillons dans des capsules sur une plaque chauffante de 70 degrés Celsius et diminuez progressivement la température de la plaque par incréments de cinq degrés Celsius jusqu’à ce que la plaque atteigne la température ambiante. Lorsque les échantillons se sont refroidis, utilisez une microtome et des lames jetables pour obtenir soigneusement des sections plates de 30 à 60 micromètres d’épaisseur de chaque bloc PEG. Retirez le PEG des sections avec trois lavages d’eau doux de cinq minutes.
Après le dernier lavage, incuber jusqu’à trois sections par tube avec 500 microlitres de sonde fluorescente fraîchement préparée pendant 72 heures à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation de coloration, utilisez une brosse pour transférer les sections sur une glissière avant de monter les sections entre une glissière en verre et un glissement de couvercle numéroté de 1,5 H. Pour déterminer la largeur spectrale de la fenêtre du détecteur sFLIM, placez les cristaux d’urée dans une boîte de culture avec un fond en verre de 0,17 micromètre et placez la boîte sur un porte-échantillon de microscope.
Sélectionnez l’objectif 20X et un laser saphir dopé en titane avec une longueur d’onde de 900 nanomètres et une puissance de 2% et allumez la numérisation. Pour effectuer des mesures sFLIM, passez le système en mode sFLIM. Pour recueillir le deuxième signal harmonique sur le détecteur sFLIM, ajustez graduellement la longueur d’onde d’excitation laser de 900 à 980 nanomètres jusqu’à ce que le deuxième signal harmonique soit recueilli dans le deuxième canal spectral.
Déterminez ensuite la longueur de la fenêtre spectrale. Passez au mode numérisé non D pour envoyer des photons fluorescents au détecteur sFLIM. Réglez l’acquisition sFLIM au mode Activer pour permettre au photon de compter sur le compteur photon unique.
Lorsque l’instrument est prêt, placez une section de plante de paille de blé indigène de contrôle seule entre la glissière et le glissement de couverture sur le stade du microscope et réglez le système en mode continu pour permettre le balayage laser. Définissez une collection de 30 secondes et vérifiez que la fraction constante discriminante se situe entre une fois 10 à la quatrième et une fois de 10 à la sixième. Sélectionnez ensuite la zone de mesure sur l’échantillon et cliquez sur Démarrer.
À la fin de la mesure, enregistrez le fichier sdt et répétez la mesure pour au moins neuf autres échantillons. Un équilibre doit être trouvé entre la réalisation d’un nombre suffisant de photons collectés pour le photon tout en évitant l’achat d’impulsions et les effets induits par la photo qui peuvent modifier la durée de vie de la florescence. Top analyser les données sFLIM acquises, importer la paille de blé indigène seul fichiers de données dans le logiciel de compteur photon unique et option ouverte et le mode pour sélectionner incomplète multi exponentielle 12,5 nanosecondes.
Sous Options et Préférences, sélectionnez Calculer automatiquement la réponse instrumentale et sélectionnez le modèle To Exponential Fit. Pour chaque canal, appliquez le modèle d’ajustement et enregistrez les paramètres d’ajustement sur une feuille de calcul. Pour une comparaison entre les canaux et les expériences calculer la durée de vie principale de fluorescence dans une feuille de calcul.
Pour calculer la durée de vie moyenne d’au moins 10 échantillons dans tous les canaux, analyser la durée de vie fluorescente principale sur les canaux donneurs afin de déterminer la valeur du canal dédié qui a choisi le nombre de photons le plus élevé et correspond à l’émission maximale de lignine. Pour comparer les valeurs du SFLIM et de l’EFRET entre l’échantillon de paille de blé indigène de contrôle et un échantillon expérimental, considérez un EFRET positif associé à une diminution homogène de la durée de vie entre le contrôle et les échantillons expérimentaux à analyser comme un événement FRET. Dans cette expérience représentative, les courbes sFLIM montrent certaines des modifications qui peuvent être réalisées entre l’échantillon de référence et les deux cas d’interaction.
En effet, l’augmentation de la fluorescence dans les régions spectrales correspondant à la gamme d’émissions de rhodamine est facilement visualisée. L’observation attentive des trois premières courbes de désintégration des photons de canal révèle également une inflexion plus forte pour la paille de blé indigène avec de la dextrine étiquetée avec de la rhodamine, que pour la paille de blé indigène incubée avec du PEG marqué avec de la rhodamine. Après avoir ajusté les courbes de désintégration des photons et calculé la durée de vie principale de chaque canal de fluorescence, la signature FRET devient plus évidente.
Par exemple, alors que la durée de vie de fluorescence augmente et diminue alternativement le long du spectre de fluorescence pour l’échantillon de paille de blé indigène, une signature fret claire est observée pour les deux sections indigènes de paille de blé incubées avec peg marqué avec de la rhodamine et de la paille de blé indigène avec de la dextrine étiquetée avec des échantillons de Rhodamine. Dans le contexte de l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique, cette méthode peut facilement être transférée à des études d’interaction enzymatique dans divers échantillons de biomasse nécessitant une caractérisation rigoureuse de chaque nouvelle biomasse. Comme le SFLIM n’exige pas la fixation de l’échantillon, il ouvre la voie à des études dynamiques sur l’interaction de la lignine enzymatique et est susceptible de guider les stratégies d’ingénierie enzymatique et les pré-traitements de la biomasse.
Comme la plupart du temps, les mesures du temps de vie nécessitent l’utilisation de sources laser infrarouges pulsantes. Les précautions de sécurité appropriées doivent être prises en conséquence.
