Dans cette vidéo, nous décrivons un ensemble de procédures conçues pour interroger l’impact d’une infection virale et la réponse immunologique qui en résulte à l’aide d’un modèle murin d’infection à Zika. Ce protocole est important parce qu’il nous permet de développer une compréhension mécaniste de l’infection et de l’immunité en identifiant la mesure dans laquelle un virus s’est propagé dans tout le corps, en transversant les barrières physiques et en accédant aux tissus. Ces techniques permettent une compréhension détaillée de la pathogénie virale et permettent de disséquer le mécanisme de protection fourni par les vaccins ou les thérapeutiques.
Ici, nous démontrons cette méthode en utilisant l’infection par le virus Zika des souris, mais cette méthode peut être appliquée à une gamme d’infections virales, y compris d’autres flavivirus comme le virus de la dengue et les alphavirus comme le virus Chikungunya. La récolte des organes du système nerveux central peut être difficile, il est donc important pour une personne de planifier une petite expérience, et être prêt à pratiquer les techniques à l’avance. Ce protocole permet la dissection rapide de la propagation virale dans les petits modèles animaux avec la possibilité de visualiser, capturer et stocker des données expérimentales.
Il est important de démontrer visuellement cette méthode pour permettre à l’expérimentateur de comprendre comment récolter les organes du système nerveux central. Il est également important de voir le niveau de confluence cellulaire et l’intensité des foyers viraux. Pour commencer, utilisez des forceps pour enlever la peau de la souris infectée.
Décapiter la tête de la souris avec des ciseaux, suivie de l’enlèvement des bras et des jambes. Pour récolter le cerveau, utilisez des ciseaux La Grange dentelés pour couper le crâne à travers le magnum foramen. Peler le crâne avec des forceps, et ramasser le cerveau avec une spatule.
À l’aide de solides ciseaux émoussés, enlever l’os entourant la colonne vertébrale, puis couper à travers l’os pelvien pour exposer les contremaures vertébrales au niveau lombaire. Ensuite, retirez autant de muscle que possible autour de la colonne vertébrale. Soigneusement, placez la pointe biseauté de l’aiguille à l’intérieur du contre-homme vertébral, en évitant la pression excessive pour empêcher l’aiguille d’empiéter sur le corps vertébral.
Maintenez fortement pour exercer une pression sur le corps vertébral et l’aiguille, et appuyez sur le piston de seringue pour expulser le cordon dans la boîte de Pétri. Transférer immédiatement la moelle épinière dans le tube étiqueté et le placer dans le bain de glace sèche pour une homogénéisation plus complète. Pour l’homogénéisation, ajouter un millilitre de DMEM et homogénéiser l’échantillon dans un BeadBeater.
Après s’être assuré que les organes sont homogénéisés, des échantillons de centrifugeuses et d’aliquot sur la glace et conserver dans les moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire. Le jour de l’analyse, retirez les échantillons homogénéisés du congélateur de moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler. Avec les échantillons sur la glace, diluer le virus Zika décuplé dans le premier puits de la plaque de dilution et utiliser une pipette multicanal pour faire des dilutions en série décuplées dans la plaque, en changeant les conseils à chaque fois.
En ajoutant 20 microlitres d’échantillon dans 180 microlitres de supports de croissance, changez les pointes de pipette entre chaque dilution. Préparer la plaque de formation de mise au point en enlevant le média des virocellules préparées à fond plat de 96 puits couvrant les virocellules. Pour éviter que le monocouche ne se dessèche, ajoutez immédiatement 100 microlitres de dilution du virus à chaque puits du viroplate.
Utilisez le même ensemble de conseils à ajouter de la concentration la plus basse à la plus élevée. Plaque de roche côte à côte deux à quatre fois et incuber à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une à deux heures. Réchauffer 2% de méthylcellulose à température ambiante.
Ensuite, diluer la solution de méthylcellulose de 2% dans les médias de croissance à un ratio d’environ deux pour un. Après l’incubation, ajouter 125 microlitres du média de croissance de la méthylcellulose à chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 32 à 40 heures.
Pour fixer les virocellules, dans une armoire de biosécurité ajouter 50 microlitres de 5%paraformaldéhyde sur le dessus de la couche de méthylcellulose dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Vous pouvez également couvrir les plaques de parafilm et les placer à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Après cela, utilisez une pipette pour enlever la superposition et les médias des cellules dans un récipient jetable à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Laver délicatement avec 150 microlitres de PBS par puits. Retirez le PBS des plaques et retirez la plaque de l’armoire de biosécurité.
Répétez le lavage PBS deux fois, puis ajoutez 150 microlitres par puits une fois tampon de lavage FFA et laisser à température ambiante pendant cinq à 10 minutes pour perméabiliser les cellules fixes. Ensuite, utilisez l’anticorps zika primaire pour détecter l’infection. Préparer l’anticorps primaire 4G2 à une concentration d’un microgramme par millilitre dans le tampon de coloration FFA.
Feuilletez le tampon de lavage FFA des plaques et ajoutez 50 microlitres de l’anticorps primaire dans le tampon de coloration FFA à chaque puits. Ensuite, sceller les plaques avec parafilm, ou film plastique, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez l’anticorps anti-souris secondaire HRP étiqueté à une concentration de un à 5000 dans le tampon de coloration FFA.
Après avoir enlevé la solution d’anticorps, laver les cellules trois fois avec 150 microlitres FFA tampon de lavage par puits. Retirez le tampon de lavage en feuilletant dans l’évier à chaque fois. Tacher les cellules avec l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration FFA à 50 microlitres par puits et incuber une à deux heures à température ambiante.
Après cela, laver les cellules trois fois avec tampon de lavage FFA, encore une fois, en enlevant le tampon de lavage en feuilletant dans l’évier à chaque fois. Ajouter 50 microlitres du substrat TrueBlue dans chaque puits. Attendez deux à 15 minutes jusqu’à ce que les taches soient entièrement définies avec un arrière-plan minimal.
Une fois les taches visibles, lavez doucement avec de l’eau à l’aide d’une main pour protéger le monocouche de la force de l’eau courante. Appuyez sur sec sur du papier absorbant. Peu de temps après, utilisez une portée de dissécation pour compter manuellement les taches dans chaque puits, ou utilisez un compteur au comptant automatisé.
Dans le logiciel ImmunoCapture, sélectionnez une dilution avec des foyers facilement distingués entre 20 et 200 par puits pour chaque échantillon et calculez le litre en unités de mise au point par millimètre en utilisant la moyenne des puits en double. Dans cette expérience, la charge virale a été montrée dans les tissus périphériques et centraux du système nerveux après que les souris Ifnar ont reçu le virus Zika sous-cutanée. La limite de détection se situe entre 100 et 500 FFU par gramme, selon l’organe.
Lors de l’exécution de l’analyse de mise au point, les erreurs techniques peuvent entraîner des résultats sous-optimaux. La toxicité d’organe, entraînée par la concentration élevée du foie, a changé la sensibilité de l’essai. Lorsque le litre viral dans l’organe était inférieur à la toxicité, la FFA ne pouvait pas enregistrer avec précision les titres viraux.
Les cellules rénales ont illustré la toxicité avec la concentration élevée d’organe mais ont été surmontées par le titer viral à de faibles concentrations d’organe. Le pipetage ou le lavage vigoureux peuvent enlever le monocouche, menant à la perte de données rapports inexacts des résultats de titer. Les fibres ou les poils qui sont présents dans le papier absorbant de banc de laboratoire, peuvent contaminer des puits individuels et causer des erreurs significatives si l’utilisation d’un programme automatisé de comptage.
La densité cellulaire est un autre problème, qui peut avoir un impact considérable sur le succès d’un essai de mise au point. Les cellules à environ 60% de confluence au début de l’essai, comparées aux cellules plaquées à 90% confluency, ont montré la différence dramatique impactant l’essai de mise au point-formation. La planification de la taille et de la portée de l’expérience afin que la récolte des organes soit effectuée efficacement, est la partie la plus importante de la procédure, suivie par le démarrage de l’essai de mise au point avec des cellules de haute qualité.
Cette procédure a été utilisée pour quantifier le virus pour plusieurs familles virales. Ce protocole peut également être adapté pour dépister les composés thérapeutiques et quantifier les titres neutralisants d’anticorps. Ces techniques sont utilisées pour quantifier les virus vivants et des mesures de sécurité appropriées devraient être prises conformément aux lignes directrices énoncées dans le BMBL.
