In diesem Video beschreiben wir eine Reihe von Verfahren, die entwickelt wurden, um die Auswirkungen einer Virusinfektion und die daraus resultierende immunologische Reaktion mit einem Murine-Modell der Zika-Infektion zu befragen. Dieses Protokoll ist von Bedeutung, weil es es uns ermöglicht, ein mechanistisches Verständnis von Infektion und Immunität zu entwickeln, indem es das Ausmaß identifiziert, in dem sich ein Virus im ganzen Körper ausgebreitet hat, physische Barrieren überträgt und auf Gewebe zugreift. Diese Techniken ermöglichen ein detailliertes Verständnis der viralen Pathogenese und bieten die Möglichkeit, den Schutzmechanismus durch Impfstoffe oder Therapeutika zu sezieren.
Hier zeigen wir diese Methode mit Zika-Virus-Infektion von Mäusen, aber diese Methode kann auf eine Reihe von Virusinfektionen einschließlich anderer Flaviviren wie Dengue-Virus und Alphaviren wie Chikungunya-Virus angewendet werden. Die Ernte der Organe des zentralen Nervensystems kann eine Herausforderung sein, daher ist es wichtig für eine Person, ein kleines Experiment zu planen und bereit zu sein, die Techniken vorher zu üben. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Zerlegung der viralen Verbreitung in Kleintiermodellen mit der Fähigkeit, experimentelle Daten zu visualisieren, zu erfassen und zu speichern.
Es ist wichtig, diese Methode visuell zu demonstrieren, damit der Experimentator verstehen kann, wie man die Organe des zentralen Nervensystems erntet. Es ist auch wichtig, den Grad der Zellkonfluenz und die Intensität der viralen Brennpunkte zu sehen. Verwenden Sie zunächst Zangen, um das Fell der infizierten Maus zu entfernen.
Enthaupten Sie den Kopf der Maus mit der Schere, gefolgt von der Entfernung der Arme und Beine. Um das Gehirn zu ernten, verwenden Sie gezackte La Grange Schere, um den Schädel durch das Foramen magnum zu schneiden. Schälen Sie den Schädel mit Zangen ab und schaufeln Sie das Gehirn mit einem Spachtel aus.
Mit einer stark abgestumpften Schere entfernen Sie den Knochen, der die Wirbelsäule umgibt, und schneiden Sie dann über den Beckenknochen, um das Wirbelforamen auf Lendenebene freizulegen. Entfernen Sie dann so viel Muskel wie möglich um die Wirbelsäule. Legen Sie vorsichtig die abgeschrägte Spitze der Nadel in das Wirbel-Foramen, um übermäßigen Druck zu vermeiden, um zu verhindern, dass die Nadel den Wirbelkörper übergeht.
Halten Sie stark, um Druck auf den Wirbelkörper und die Nadel auszuüben, und drücken Sie den Spritzenkolben, um die Schnur in die Petrischale zu vertreiben. Das Rückenmark sofort in das markierte Rohr geben und zur weiteren Homogenisierung in das Trockeneisbad legen. Zur Homogenisierung einen Milliliter DMEM hinzufügen und die Probe in einem BeadBeater homogenisieren.
Nach der Sicherstellung, dass organe homogenisiert werden, Zentrifugen- und Aliquot-Proben auf Eis und lagern Sie in den minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Am Tag des Testes die homogenisierten Proben aus dem Minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank entfernen und auftauen lassen. Mit den Proben auf Eis, verdünnen Zika-Virus zehnfach in den ersten Brunnen der Verdünnungsplatte und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um zehnfache serielle Verdünnungen auf der Platte zu tun, jedes Mal die Spitzen zu wechseln.
Durch Zugabe von 20 Mikrolitern Probe in 180 Mikroliter Wachstumsmedien, ändern Sie die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung. Bereiten Sie die Fokusformplatte vor, indem Sie die Medien aus der vorbereiteten flachen 96-Well-Platte entfernen, die Virozellen abdeckt. Um zu verhindern, dass die Monoschicht austrocknet, fügen Sie sofort 100 Mikroliter der Virusverdünnung zu jedem Brunnen in der Viroplate hinzu.
Verwenden Sie den gleichen Satz von Tipps, um von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration hinzuzufügen. Steinplatte Seite an Seite zwei bis vier Mal und inkubieren bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden. 2%Methylcellulose auf Raumtemperatur aufwärmen.
Anschließend die 2%Methylcellulose-Lösung in Wachstumsmedien im Verhältnis von etwa zwei zu eins verdünnen. Nach der Inkubation 125 Mikroliter der Methylcellulose-Wachstumsmedien in jeden Brunnen der 96-Well-Platten geben. Wieder bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 32 bis 40 Stunden inkubieren.
Um die Virozellen zu fixieren, fügen Sie in einem Biosicherheitsschrank 50 Mikroliter 5%Paraformaldehyd über die Oberseite der Methylcelluloseschicht in jedem Brunnen der 96-Well-Platten hinzu. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alternativ können Sie die Platten mit Parafilm bedecken und über Nacht bei vier Grad Celsius platzieren.
Danach verwenden Sie eine Pipette, um Überlagerungen und Medien aus Zellen in einen Einwegbehälter im Biosicherheitsschrank zu entfernen. Mit 150 Mikroliter PBS pro Brunnen vorsichtig waschen. Entfernen Sie PBS von den Platten und entfernen Sie die Platte aus dem Biosicherheitsschrank.
Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal, fügen Sie dann 150 Mikroliter pro Brunnen ein Mal FFA-Waschpuffer und lassen Bei Raumtemperatur für fünf bis 10 Minuten, um die festen Zellen zu permeabilisieren. Als Nächstes verwenden Sie primären Zika-Antikörper, um Infektionen zu erkennen. Bereiten Sie den primären Antikörper 4G2 mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter im FFA-Färbepuffer vor.
Flick FFA Waschpuffer von den Platten, und fügen Sie 50 Mikroliter des primären Antikörpers in FFA Färbung Puffer zu jedem Brunnen. Dann versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder Kunststofffolie und bebrüten über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie den sekundären Go Anti-Maus-HRP-beschrifteten Antikörper mit einer Konzentration von ein bis fünf 000 im FFA-Färbepuffer vor.
Nach dem Entfernen der Antikörperlösung, waschen Zellen dreimal mit 150 Mikroliter FFA Waschpuffer pro Brunnen. Entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie jedes Mal in die Spüle streichen. Färben Sie die Zellen mit dem sekundären Antikörper im FFA-Färbepuffer bei 50 Mikrolitern pro Brunnen und bebrüten Sie ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Danach waschen Zellen dreimal mit FFA-Waschpuffer, wieder, entfernen Sie den Waschpuffer durch jedes Mal in die Spüle. Fügen Sie 50 Mikroliter des TrueBlue Substrats in jeden Brunnen ein. Warten Sie zwei bis 15 Minuten, bis die Spots mit minimalem Hintergrund vollständig definiert sind.
Nachdem die Flecken sichtbar sind, waschen Sie vorsichtig mit Wasser mit einer Hand, um die Monoschicht vor der Kraft des wasserfließenden zu schützen. Tippen Sie trocken auf Papiertücher. Verwenden Sie kurz darauf einen Sezierenbereich, um die Spots in jedem Brunnen manuell zu zählen, oder verwenden Sie einen automatisierten Spotzähler.
Wählen Sie in der ImmunoCapture-Software eine Verdünnung mit leicht zu unterscheidenden Brennpunkten zwischen 20 und 200 pro Bohrung für jede Probe aus und berechnen Titer in fokusbildenden Einheiten pro Millimeter anhand des Durchschnitts der doppelten Bohrungen. In diesem Experiment wurde eine Virusbelastung im peripheren und zentralen Nervensystemgewebe gezeigt, nachdem Ifnar-Mäuse subkutan Zika-Virus erhalten hatten. Die Nachweisgrenze lag zwischen 100 und 500 FFU pro Gramm, basierend auf Organ.
Bei der Durchführung des fokusbildenden Assays können technische Fehler zu suboptimalen Ergebnissen führen. Organtoxizität, angetrieben durch hohe Konzentration der Leber, veränderte die Empfindlichkeit des Assays. Wenn der virale Titer im Organ niedriger als die Toxizität war, konnte die FFA die viralen Titer nicht genau aufzeichnen.
Nierenzellen illustrierten Toxizität mit hoher Organkonzentration, wurden aber durch den viralen Titer bei niedrigen Organkonzentrationen überwunden. Kräftiges Pipettieren oder Waschen kann die Monoschicht entfernen, was zu Datenverlusten führt, die ungenaue Berichterstattung über Titer-Ergebnisse. Fasern oder Haare, die in laborlaboriertem saugfähigem Papier vorhanden sind, können einzelne Brunnen kontaminieren und bei Verwendung eines automatisierten Zählprogramms zu erheblichen Fehlern führen.
Die Zelldichte ist ein weiteres Thema, das den Erfolg eines fokusbildenden Assays dramatisch beeinflussen kann. Zellen mit etwa 60 % Konfluenz zu Beginn des Testes zeigten im Vergleich zu Zellen, die mit 90 % Konfluenz plattiert waren, einen dramatischen Unterschied, der sich auf den fokusbildenden Assay auswirkte. Die Planung von Umfang und Umfang des Experiments, damit die Organernte effizient abgeschlossen wird, ist der wichtigste Teil des Verfahrens, gefolgt von dem Start des fokusbildenden Assays mit hochwertigen Zellen.
Dieses Verfahren wurde verwendet, um Virus für mehrere virale Familien zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch an den Bildschirm für therapeutische Verbindungen angepasst werden und neutralisierende Antikörpertiter quantifizieren. Diese Techniken werden verwendet, um lebende Viren zu quantitieren, und es sollten geeignete Sicherheitsmaßnahmen gemäß den Richtlinien des BMBL getroffen werden.
