La compréhension de la base physique de l’auto-assemblage des protéines dans les cellules est limitée par le manque d’outils appropriés. Les méthodes actuelles souffrent d’une faible sensibilité, de lectures indirectes, d’un débit limité et/ou d’une résolution au niveau de la population. En revanche, notre analyse détecte et quantifie la propension d’une protéine pour l’auto-assemblage in vivo avec une cellule sensible, une seule cellule, lecture à haut débit indépendamment de la localisation des protéines ou la solubilité.
Lorsque vous essayez d’abord l’analyse, obtenir le droit de conversion photo peut nécessiter des tests empiriques pour obtenir des conditions optimales pour atteindre une bonne lecture sur l’ensemble de la plaque. La sensibilité de l’essai pourrait également être compromise si le cytomètre n’a pas de filtres de détection séparés pour les signaux FRET et accepteur. La démonstration de la procédure avec moi sera Andrew Box, le directeur de laboratoire du noyau de cytométrie.
Pour préparer une culture de levure pour DAmFRET, pour chaque protéine de requête, inoculer les colonies transformées de levure en triplicate dans 200 microlitres d’un milieu de croissance approprié non induisant dans les puits individuels d’une plaque de culture de fond bien ronde de 96. Incuber les cellules de levure avec des secousses avec une orbite de 1,5 millimètre à 1200 rotations par minute à 30 degrés Celsius pendant 16 heures. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules de levure par centrifugation et enlever les supernatants par inversion puissante.
Ajouter 200 microlitres d’un milieu d’induction approprié et retourner les cellules dans l’incubateur de secousses pendant encore 12 heures. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules de levure par centrifugation et inversion puissante, puis ajouter 200 microlitres de milieu d’induction fraîche. Ensuite, incuber les cellules en secouant pendant quatre heures supplémentaires pour réduire l’auto-fluorescence.
Pour photo convertir les échantillons, placez la plaque sans couvercle sous une lampe ultraviolette équipée d’un filtre de 320 à 500 nanomètres et d’un collimateur de faisceau placé à 45 centimètres au-dessus de la plaque. Allumez la lampe pour photo convertir les cellules pendant 25 minutes avec secouant. Pour la collecte de données DAmFRET, chargez les cellules converties par photo sur un cytomètre à flux d’imagerie avec des lasers non colinear 488 et 561 nanomètres et portez quatre cellules non rembourrées par une circularité élevée et une petite zone cellulaire.
Ensuite, recueillir des données pour deux à cinq fois 10 à quatre cellules individuelles par échantillon dans une barrière positive de fluorescence. À la fin de l’analyse, utilisez un échantillon mEos3.1 converti non photo pour le signal donneur pur et monomère DsRed deux pour le signal d’accepteur pur pour définir la compensation. Pour plus de sensibilité, assurez-vous que le canal du détecteur FRET est également considéré comme la cible de retombées dans le programme d’analyse.
Calculez le paramètre AmFRET comme le rapport du signal FRET total divisé par le signal total de l’accepteur FRET. Les profils AmFRET des cellules de levure exprimant la protéine fluorescente seules présentent l’AmFRET négligeable tandis que les cellules de levure exprimant comme homooligomer stable fusionné à la protéine fluorescente démontrent les valeurs positives uniformes d’AmFRET. Les images des cellules acquises par cytométrie de flux d’imagerie révèlent une fluorescence diffuse dans tous les canaux.
La microscopie confoccale des piles Z pour plusieurs champs de cellules montre une distribution uniforme de la fluorescence dans tout le cytosol de chaque cellule sans ponction détectable. Les cellules de levure exprimant le fluorophore seul ou le fluorophore plus la forme mutante d’une protéine inflammasome humaine présentent l’AmFRET négligeable sur toute la gamme de concentration indiquant une incapacité à s’auto-interagir. En revanche, la protéine inflammasome de type sauvage démontre un profil DAmFRET avec une population négligeable d’AmFRET et une population élevée d’AmFRET.
Notez que la protéine inflammasome de type sauvage résiste à l’auto-assemblage même à des concentrations élevées avec la protéine passant à la forme auto-assemblée dans seulement une fraction des cellules. Il s’agit d’une indication claire de l’existence d’une barrière de nucléation à l’auto-assemblage. Comme le confirme l’imagerie par fluorescence, ces populations représentent des cellules qui ne contiennent que des protéines solubles ou qui sont pour la plupart des protéines auto-assemblées respectivement.
En effet, DAmFRET corrobore les données structurelles antérieures que le mutant point dans l’inflammasome perturbe la nucléation à travers les concentrations réalisables par ce système d’expression. Notez que les profils d’expression protéique dans les cellules mammifères qui n’ont pas d’expression Caspase-1 ressemblent à ceux observés dans les cellules de levure. L’étape la plus importante à retenir est la conversion de photos.
D’autres étapes cruciales comprennent la collecte d’un nombre suffisant d’événements qui ne sont pas saturés pour le signal de fluorescence et d’obtenir la compensation correcte. Le suivi de l’analyse avec la biochimie appropriée, la mutagenèse rationnelle et les approches de biologie structurale peut aider à élucider complètement le mécanisme de l’auto-assemblage.
