Notre protocole démontre un flux de travail préclinique complet pour tester l’efficacité thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites par l’homme après une lésion cérébrale. Ce modèle de lésion cérébrale traumatique offre un degré élevé de polyvalence et de reproductibilité en contrôlant étroitement les paramètres de la force mécanique et donc en fournissant une blessure bien définie. Ces procédures peuvent être utilisées pour étudier les processus de blessures et de récupération dans d’autres régions du cerveau et la méthode de transplantation est utilisable avec de nombreux types de cellules.
Le forage crânien est difficile car la technique exige la dextérité manuelle pour maîtriser la pression, la vitesse, la profondeur et les mouvements lisses appropriés. Documentez tous les événements et pratiquez abondamment. Pour effectuer une craniectomy unilatérale, confirmez un manque de réponse au pincement d’onteil dans la souris anesthésiée et fixez la souris dans un cadre stéréotaxique.
Appliquer de l’onguent ophtalmique antibiotique sur les yeux avec un coton-tige stérile et une solution à base d’iode sur la zone rasée du cuir chevelu. Retirer l’iode avec 70% d’éthanol et couvrir l’animal d’un drapé chirurgical fenestrated. Faire une incision médiane de 1,5 à deux centimètres sur le cuir chevelu et utiliser des cotons-tiges stériles pour nettoyer la plaie et effacer le fascia laissé de la ligne médiane à bregma.
Utilisez une sonde impacteur pour identifier le site craniectomy et définir le x est égal à zéro, y égale zéro point de référence stéréotaxique à bregma. Réglez la sonde latéralement à deux millimètres à gauche de la ligne médiane. Utilisez un marqueur à pointe fine chirurgicalement sûr pour repèrer un cercle de cinq millimètres de diamètre autour de la zone d’impact présumé.
Soulevez et faites pivoter l’impacteur hors position et complétez le cercle de cinq millimètres. Remettre brièvement l’impacteur en position pour vérifier l’exactitude du cercle de cinq millimètres. Puis soulever et faire pivoter l’impacteur hors position et utiliser un outil à grande vitesse rotatif kit moteur micro équipé d’une pointe ronde 0,6 ou 0,8 millimètre bavure foreuse bit pour faire un trou ouvert dans le crâne à 70 à 80% vitesse maximale.
Appliquez une légère pression sur le crâne pendant le forage le long du contour circonférentiel de cinq millimètres à l’intérieur de cette frontière et utilisez des forceps pour soulever le volet osseux qui en résulte. Le forage par des lignes de suture peut présenter des difficultés supplémentaires à mesure que l’os est interrompu et nécessite une pression supplémentaire. Les vaisseaux sanguins peuvent être en association étroite et donc des événements saignants sont probables.
Pour induire une légère blessure à l’impact cortical contrôlé, nettoyez la sonde de l’impacteur à l’intérieur d’un tampon stérile de préparation à l’alcool et déplacez la sonde de l’impacteur en position au-dessus du cortex exposé. Abaissez la sonde jusqu’à ce qu’elle touche la surface du dura mater et marquez cette position comme z égale zéro. Retirez le piston et déplacez-vous vers z égale moins un millimètre et déchargez le piston pour avoir un impact sur le cortex.
Soulevez immédiatement le piston et déplacez le bras hors de position et irriguer le cortex avec un volume généreux de points salins et utiliser de simples points interrompus et suture de soie 5-0 pour fermer l’incision du cuir chevelu. Ensuite, livrer 10 milligrammes par kilogramme de Cyclosporine A par injection sous-cutanée dans le scruff et placer la souris dans une cage postopératoire propre préchauffée avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Environ 24 heures après la craniectomy, placez la souris de nouveau dans le cadre stéréotaxique.
Couvrir la souris du drapé chirurgical fenestrated. Lavage du site d’incision avec salin stérile pour nettoyer le site et desserrer les sutures. Utilisez un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 % pour stériliser doucement le site d’incision et utiliser de fines pinces à épiler et des ciseaux ophtalmiques pour enlever les sutures.
Puis irriguer le site de chirurgie et de craniectomy avec la solution saline stérile abondante. Dans un capot de biosécurité de culture cellulaire, tourbillonnez doucement ou appuyez sur le tube des cellules pour assurer une suspension cellulaire homogène. Utilisez une micropipette pour charger environ 7,5 microlitres de cellules dans une seringue Hamilton à travers l’extrémité du piston.
Tenant la seringue à un angle de 120 degrés avec l’extrémité du piston orientée vers le bas, insérez le piston en prenant soin de ne pas introduire une bulle d’air entre la suspension et la pointe du piston. Fixez l’assemblage du joint à l’aiguille de la pipette et fixez l’aiguille à la seringue. Poussez le piston pour déplacer la suspension cellulaire dans l’aiguille de pipette et fixez la seringue à la pompe stéréotaxique de seringue.
Avancez le piston pour vous assurer que l’assemblage de la pompe à seringues fonctionne correctement et déplacez l’aiguille dans les coordonnées pour l’injection. Alignez la pointe de l’aiguille sur bregma et réglez les coordonnées x et y à zéro. Déplacez la pointe de l’aiguille sur la craniectomy à deux millimètres latéraux et moins un millimètre postérieur à bregma et toucher la pointe de l’aiguille à la surface du dura mater.
Soulevez légèrement l’aiguille puis faites une petite incision dans le dura mater à l’endroit où l’aiguille a pris contact. Réglez la coordonnée stéréotaxique à z égale zéro et poussez le piston pour confirmer que la suspension cellulaire coule adéquatement avant d’introduire l’aiguille dans le cerveau. Introduire l’aiguille dans le cerveau à une profondeur de z égale moins 1,4 millimètres pour placer la greffe à la frontière matière grise / matière blanche du cortex profond.
Démarrez la pompe à seringues pour infuser la suspension cellulaire sur une période de 15 minutes. Utilisez un microscope longue distance de travail pour surveiller l’écoulement de suspension cellulaire irriguant le site de la chirurgie avec de la solution saline stérile pendant l’injection pour maintenir l’hydratation des tissus. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, retirez lentement l’aiguille de transplantation et irriguez le site de chirurgie avec la solution saline supplémentaire avant de fermer l’incision avec de nouvelles sutures.
Ensuite, fournir des soins postopératoires comme démontré. Pour un test d’enlèvement du ruban adhésif, utilisez d’abord un petit couteau à rasoir pour couper les morceaux jaunes et rouges de ruban électrique en bandes de trois par cinq millimètres sur une surface de verre lisse. Amenez les souris dans la salle d’essai du comportement pendant au moins 30 minutes avant l’essai et utilisez un chiffon de manipulation pour retenir la souris par le gribouillis du cou et du dos de sorte que la souris tient les scies avant loin de son corps et de sa tête.
Utilisez des pinces à épiler pour placer une bande adhésive sur la surface plantaire de chaque scie avant et utilisez une pression délicate et constante des doigts pour fixer les bandes aux pattes. Placez rapidement la souris dans un cylindre en plastique et démarrez deux chronomètres lorsque la souris a les quatre pattes sur la boîte d’essai en plastique. Utilisez ensuite les deux chronomètres pour enregistrer les latences pour l’avis de patte gauche, l’enlèvement de la patte gauche, l’avis de patte droite et l’enlèvement de la patte droite.
Dans cette expérience pilote, la fonction de membre antérieur a été comparée dans craniectomy seul, dommages contrôlés d’impact cortical et souris naïves. Les souris qui ont subi la chirurgie ont exhibé les latences accrues transitoires pour remarquer des stimulus adhésifs pendant un à trois jours immédiatement après la chirurgie et les déficits postopératoires transitoires dans l’enlèvement adhésif de la forepaw ipsilateral. Les souris qui ont subi l’impact cortical commandé, cependant, ont exhibé des déficits significatifs dans la performance motrice dans le contralatéral de forepaw à la blessure comparée aux souris naïves hors du jour postopératoire 28.
L’immunostaining des sections de cerveau de souris pour l’antigène nucléaire humain indique que les greffes humaines de cellules peuvent être clairement distinguées des tissus d’hôte dans les dommages de SHAM et les cerveaux contrôlés d’impact cortical. Vous devez respecter les procédures standard de sécurité en laboratoire lors de la manipulation de cellules humaines de culture et lors de la manipulation d’aiguilles de seringue qui entrent en contact avec des rongeurs ou des médicaments immunosuppresseurs. Les sections des tissus cérébraux peuvent être analysées pour l’expression de marqueurs neuro-inflammatoires car il est utile de savoir comment la greffe affecte la réponse aux lésions tissulaires de l’hôte et vice versa.
Nous avons été surpris de trouver des différences sexuelles subtiles dans les résultats de comportement post-blessure. Nous étudions maintenant si le sexe joue un rôle dans la réponse neuro-immune aux lésions cérébrales. Les mains stables, la patience et la pratique sont cruciales pour développer une bonne technique de craniectomy.
Les dommages collatéraux causés par une craniectomy incorrecte peuvent compromettre la zone que vous voulez cibler pour la transplantation cellulaire.
